DIFERENSIASI EMBRYONIC STEM CELLS MENCIT MENJADI NEURON MENGGUNAKAN CONDITIONED MEDIUM RIRIS LINDIAWATI PUSPITASARI

(1)

DIFERENSIASI EMBRYONIC STEM CELLS MENCIT

MENJADI NEURON MENGGUNAKAN

CONDITIONED MEDIUM

RIRIS LINDIAWATI PUSPITASARI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2009

(2)

PERNYATAAN ORISINALITAS

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Diferensiasi Embryonic Stem

Cells Mencit menjadi Neuron menggunakan Conditioned Medium adalah

karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka.

Bogor, Agustus 2009

Riris Lindiawati Puspitasari NRP B151060051

(3)

ABSTRAK

RIRIS LINDIAWATI PUSPITASARI. Diferensiasi Embryonic Stem Cells Mencit menjadi Neuron menggunakan Conditioned Medium. Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO dan FERRY SANDRA

Embryonic stem cells (ESCs) merupakan sel pluripoten yang mampu untuk

berproliferasi dan berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel penyusun tubuh. Potensi tersebut telah diyakini sangat bermanfaat dalam pengobatan penyakit degeneratif. Kemampuannya untuk berdiferensiasi hingga saat ini masih terus dikaji. Penelitian ini dilakukan untuk mempelajari tingkat diferensiasi ESCs menjadi neuron secara in vitro dengan menggunakan conditioned medium (CM) tanpa melalui pembentukan embryoid bodies (EB). ESCs mencit dikultur dalam medium dengan penambahan 20 ng/ml Leukemia inhibitory factor (LIF) selama 8 hari hingga terbentuk outgrowth. CM berasal dari supernatan kultur primer sel syaraf. Digunakan 2 konsentrasi CM yaitu 1x-CM (CM tidak dikonsetratkan) dan 10x-CM (CM dikonsentratkan hingga 10 kali). ESCs dikultur dalam petri yang telah dilapisi gelatin selama 7 hari hingga berdiferensiasi. Ekspresi nestin diketahui melalui metode 2 steps reversed transcript polymerase chain reaction (RT-PCR). Hasil penelitian menunjukkan bahwa penambahan 10x-CM ke dalam medium mampu menginduksi pertumbuhan neural-like cells (NLC) dengan persentase sebesar 8.83 ± 3.06. Hasil PCR memperlihatkan adanya perbedaan ekspresi gen nestin pada tiap sampel. Sementara itu, medium dengan penambahan 1x-CM belum mampu menginduksi terbentuknya NLC. Dengan demikian, penambahan CM yang dikonsentratkan hingga 10 kali dapat mengarahkan perkembangan ESCs mencit menjadi NLC tanpa melalui pembentukan EB. Kata kunci: embryonic stem cells mencit, conditioned medium, nestin, diferensiasi neuron

(4)

ABSTRACT

RIRIS LINDIAWATI PUSPITASARI. Conditioned medium induced neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Under direction of ARIEF BOEDIONO and FERRY SANDRA

Embryonic stem cells (ESCs) are pluripotent cells having capability in extensive proliferation while maintaining their potential to differentiate into various cells. Therapeutic potential of these cells is promising, however there is still insufficient ability in inducing the differentiation. In this study we examined the effect of conditioned medium that contained many inducing factors in direct differentiation of mouse ESCs (mESC) into neural cells without embryoid bodies formation. Mouse ESCs were cultivated in culture with supplementation of 20 ng/ml Leukemia inhibitory factor (LIF) to form outgrowth within 8 days. Mouse ESCs were induced with neural-cells-primary-culture-conditioned-medium. We used two concentrations of conditioned medium (CM), 1x-CM and 10x-CM. The mESCs were cultured on gelatin coated dishes in both of treatments for 7 days to differentiate. The expressions of nestin were analyzed by two steps RT-PCR. Based on result, 10x-CM increased the percentage of neural-like cells outgrowth 8.83 ± 3.06 and also nestin level expression. Mean while the treatment with 1x-CM gave no neural morphology at all. In conclusion, 10x-1x-CM had effect on neural differentiation from mESCs.

Keywords: mouse embryonic stem cells, conditioned medium, nestin, neural differentiation

(5)

RINGKASAN

RIRIS LINDIAWATI PUSPITASARI. Diferensiasi Embryonic Stem Cells Mencit menjadi Neuron menggunakan Conditioned Medium. Dibimbing oleh ARIEF BOEDIONO dan FERRY SANDRA

Stem cell atau yang juga dikenal dengan istilah sel punca, merupakan sel

yang dapat berproliferasi dengan mempertahankan sifat tidak terdiferensiasi. Sel punca diprediksi memegang kunci untuk pengobatan beberapa penyakit degeneratif yang pada saat ini tidak dapat disembuhkan dengan pengobatan konvensional, misalnya pada penyakit Alzheimer, Parkinson, diabetes dan jantung. Salah satu jenis sel punca yang telah banyak diteliti adalah Embryonic

Stem Cell (ESC). ESC dihasilkan dari inner cell mass (ICM) yang terdapat pada

embrio blastosis. ESC memiliki beberapa karakter diantaranya dapat dipertahankan untuk tetap tidak berdiferensiasi secara in vitro dan dalam kondisi tertentu dapat berdiferensiasi menjadi berbagai tipe sel yang menyusun tubuh.

Propagasi ESC untuk dapat berdiferensiasi menjadi sel tipe tertentu dipengaruhi oleh beberapa faktor yang diregulasi oleh mediator pertumbuhan yang sesuai. Secara in vitro, ESC dapat diarahkan perkembangannya menjadi sel neuron dan sel glia. Interaksi antara sel-sel dan kondisi lingkungan mikro dapat mempengaruhi diferensiasi ESC ataupun sel-sel prekursor baik secara in vitro maupun in vivo. Selain itu, pengarahan ESC menggunakan conditioned medium (CM) juga memungkinkan dikarenakan CM dapat menyediakan faktor-faktor penginduksi neuron. CM merupakan medium yang dikoleksi dari kultur primer sel tertentu setelah dikultur selama beberapa hari.

Conditioned medium dari kultur primer sel syaraf mengandung sejumlah

faktor pertumbuhan antara lain nerve growth factor (NGF), glial

derived-neurotrophic factor (GDNF), nestin, dan glial fibrillary acidic protein (GFAP).

Pada umumnya tahapan untuk mendiferensiasikan ESCs adalah melalui pembentukan embryoid bodies (EB) terlebih dahulu. EB merupakan agregat sel yang terdiri atas sel-sel ektodermal, mesodermal, dan endodermal. Metode diferensiasi ESC mencit menjadi sel neuron dengan menggunakan CM secara tunggal dan tanpa melalui tahapan EB belum dilaporkan. Oleh karena itu tujuan penelitian ini adalah untuk mempelajari pengaruh penggunaan CM dari kultur primer sel syaraf secara tunggal (tanpa penambahan GF eksternal), terhadap tingkat pengarahan ESC mencit menjadi sel neuron.

Penelitian ini menggunakan inner cell mass (ICM) dari blastosis mencit sebagai sumber ESCs. ICM yang berhasil dikoleksi kemudian dikultur dalam medium ESCs dengan penambahan 20 ng/ml LIF. ICM dikultur pada petri yang telah dilapisi gelatin. Penggunaan LIF dimaksudkan agar ESCs tidak berdiferensiasi. Setelah 8 hari, koloni ESCs dikultur dalam medium diferensiasi sebagai perlakuan. Perlakuan yang digunakan adalah 2 konsentrasi CM yaitu CM yang belum dikonsentratkan (1x-CM) dan CM yang telah dikonsentratkan hingga sepuluh kali (10x-CM). Konsentrasinya berturut-turut adalah 490 μg/ml dan 2615 μg/ml. CM berasal dari supernatan kultur primer sel syaraf setelah dikultur selama 8 hari. Volume yang digunakan yaitu 50% (untuk 1x-CM) dan 5% (untuk 10x-CM). Parameter perkembangan ICM yang diamati adalah attachment rate,

(6)

pembentukan koloni primer, outgrowth, dan tingkat diferensiasi ESC menjadi sel neuron. Data hasil perkembangan ICM dijelaskan secara deskriptif. Isolasi RNA total dilakukan pada hari ke-7. Kemampuan ekspresi gen nestin (penanda untuk sel progenitor neuron) dilihat berdasarkan hasil two steps reversed

transcript-polymerase chain reaction (RT-PCR).

Keseluruhan blastosis yang diperoleh berjumlah sekitar 400 embrio. Dengan memberikan kondisi kultur yang sama maka terlihat adanya sejumlah perkembangan dari embrio. Kemampuan ICM untuk melekat ke dasar petri (attachment rate) adalah 73.5 ± 2.52% dan 72.5 ± 4.43%. Attachment rate diobservasi pada 24 dan 48 jam setelah penanaman. ICM yang melekat selanjutnya akan tumbuh dan berkembang membentuk koloni primer. Perkembangan koloni primer ditandai dengan bertambahnya diameter koloni seiring bertambahnya hari pengamatan. Hingga hari ke-8, koloni primer yang terbentuk yaitu 66 ± 7.66% dan 67 ± 5.29%. Pada koloni primer, stem cell tumbuh dan berkembang membentuk multilayer. Selain itu juga terlihat adanya pertumbuhan sel ke arah samping koloni atau outgrowth. Sebanyak 66 ± 7.66% dan 66 ± 4.90% koloni dapat berkembang membentuk outgrowth.

Pada tahap diferensiasi, sel neuron yang tumbuh diidentifikasi sebagai

neural-like cells (NLC) dikarenakan pengujian lanjutan seperti imunositokimia

untuk menentukan tipe atau jenis sel yang tumbuh tidak dilakukan. Secara visual, NLC tumbuh di area tepi dari koloni dan beberapa sel memiliki neurit yang saling berhubungan satu dengan lainnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada sampel dengan penambahan 1x-CM tidak menunjukkan adanya pertumbuhan NLC. Hal yang berbeda tampak pada sampel dengan penambahan 10x-CM. Sebanyak 8.83 ± 3.06% NLC teramati di bagian outgrowth, sehingga dapat dikatakan bahwa penambahan 10x-CM lebih mampu menginduksi terbentuknya NLC dari mESC. Kemampuan tersebut dikarenakan CM yang telah dikonsentratkan hingga sepuluh kali memiliki kandungan faktor-faktor yang berperan optimal untuk mengarahkan perkembangan mESC menjadi NLC. Lebih lanjut, conditioned medium dari kultur primer syaraf mengandung sejumlah faktor yang penting bagi perkembangan ESC menjadi sel neuron seperti nerve growth

factor (NGF), glial derived-neurotrophic factor (GDNF), fibroblast growth factor-2 (FGF-2), dan glial fibrillary acidic protein (GFAP).

Isolasi RNA total dari tiap sampel dilakukan setelah kultur diferensiasi berusia 7 hari. Hasil isolasi memperlihatkan bahwa RNA total dari tiap sampel terdapat pada kisaran 29.80 ng/μl hingga 90.40 ng/μl. Sebagai kontrol positif terhadap nestin adalah jaringan otak yang memiliki RNA total dengan konsentrasi 90.40 ng/μl. Setelah RNA total didapat maka dilakukan konversi ke cDNA. Untuk mendeteksi ekspresi dari gen target, sebelumnya dilakukan optimasi terhadap

primer agar didapatkan hasil pembacaan pita tunggal dan spesifik. Berdasarkan

hasil PCR, dapat dikatakan bahwa pemilihan primer sudah cukup spesifik sehingga produk yang dinilai intensitasnya menghasilkan pita tunggal sebesar 327 bp untuk nestin.

Hasil pembacaan PCR mengkonfirmasi bahwa sampel dengan penambahan 1x-CM tidak menghasilkan pita. Sedangkan pada sampel dengan penambahan 10x-CM terlihat bahwa nestin terekspresi dengan intensitas pita yang bervariasi. Namun demikian, level ekspresi nestin dari tiap sampel memiliki nilai yang cukup mirip. Sebagai kontrol pembanding digunakan beta aktin. Setelah setiap gel

(7)

didokumentasikan dengan G-box, maka dilakukan kuantitasi hasil pita-pita bacaannya. Pada sampel dengan penambahan 10x-CM, rasio nestin terhadap beta

aktin berkisar pada 0.08083 hingga 0.20318. Sedangkan pada kontrol positif yaitu

jaringan otak memiliki nilai rasio 0.69848. Apabila dibandingkan antara nilai rasio nestin/beta aktin dengan jumlah koloni yang berdiferensiasi pada sampel maka didapat nilai rasio ekspresi per koloni berkisar pada 0.04.

Berdasarkan penelitian dapat disimpulkan bahwa conditioned medium yang dikonsentratkan hingga sepuluh kali (10x-CM) dapat menunjang diferensiasi ESC mencit menjadi neural-like cells. Selain itu diferensiasi ESC mencit menjadi NLC dapat dilakukan tanpa melalui pembentukan embryoid bodies.

Kata kunci: embryonic stem cells mencit, conditioned medium, nestin, diferensiasi sel neuron

(8)

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebut sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB