METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan selama 5 bulan terhitung sejak Februari hingga Juni 2012 di LERMAB (Laboratoire d'Etudes et de Recherche sur Le Matériau Bois) , Université de Lorraine, Nancy, Perancis.
Bahan dan Alat Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit batang pohon Litsea tomentosa Blume di kawasan Taman Wisata Alam Camplong, 45 km sebelah barat laut Kota Kupang, Nusa Tenggara Timur. Kulit batang diambil dari pohon yang berusia antara 10-15 tahun.
(A) (B)
Gambar 5. (A) Peta lokasi pengambilan bahan dan (B) proses pengambilan kulit batang L.tomentosa
Kulit batang selanjutnya digiling untuk dijadikan serbuk dan disaring untuk mendapatkan ukuran serbuk yang sesuai. Kulit batang yang sudah menjadi serbuk disaring menggunakan penapis ukuran 60 mesh, 40 mesh dan 40-60 mesh. Serbuk yang digunakan pada penelitian ini adalah serbuk yang lolos saring pada ukuran saringan 40-60 mesh.
Bahan kimia yang digunakan untuk penelitian adalah diklorometan, aseton, toluen, etanol, metanol, etil asetat, air destilasi, DMSO, CDCL3. Untuk separasi menggunakan kromatografi kolom, bahan kimia yang digunakan antara lain silika gel sebagai fase diam. Fase gerak yang digunakan adalah campuran larutan diklorometan: etil asetat: metanol dengan perbandingan 36:12:5 (v/v).
Untuk uji bioaktifitas digunakan bahan agar, malt extract, air dan HCl 0,1 N. Jamur yang digunakan adalah jamur pembusuk kayu seperti : Poria placenta,
Coriolus versicolor , Gloeophyllum trabeum yang telah dibiakkan sebelumnya di laboratorium biologi LERMAB.
Alat
Peralatan yang digunakan untuk preparasi sampel antara lain : grinder, saringan ukuran 40 dan 60 mesh, eksikator dan bejana plastik. Alat yang digunakan untuk ekstraksi adalah bejana reaksi pyrex, bejana soxhlet, kompor pemanas, gelas ukur, penjepit dan kertas saring. Alat yang digunakan untuk pemekatan ekstrak adalah tabung kaca, vacuum rotary evaporator,liophilizer. Untuk mengukur berat digunakan neraca analitik, untuk mengeringkan sampel digunakan oven suhu 50ºC dan untuk mengukur kadar air sampel digunakan oven suhu 103±2ºC. Perangkat separasi kromatografi kolom menggunakan tabung kaca tinggi ±150 cm sebagai kolom, silika gel, pasir hydrida, pipet, gelas ukur, tabung reaksi, lempeng silika untuk kromatografi lapis tipis (KLT). Untuk uji bioaktifitas digunakan alat aluminium foil, autoclave, dan peralatan gelas (erlenmeyer, gelas ukur), pipet, penjepit, perekat karet, cawan petri, pH meter, inkubator, lampu UV, pemantik api. Untuk analisis struktur kimia dan berat molekul menggunakan alat FTIR Spectrum 2000 Perkin Elmer, spectrum for windows version : 1.5 (07 Mar 1997) Perkin-Elmer 1995 PE 1150F0018, GCMS, LCMS, dan NMR Bruker DX dengan frekuensi 400Hz.
Metode Penelitian Ekstraksi Pendahuluan
Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan soklet. Serbuk kulit batang yang berukuran 40-60 mesh sebanyak ± 112 g, kadar air ± 5%, diekstrak dengan
menggunakan 4 macam pelarut dengan tingkat polaritas yang berbeda (suksesif) sebagai pendahuluan.
Pelarut dengan tingkat polaritas yang berbeda yaitu : diklorometan, aseton, toluen-etanol (2:1), air destilasi, masing-masing pada volume 150 mL. Ekstraksi akan berakhir jika pelarut penyari yang digunakan berwarna jernih. Ekstrak kemudian dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 40ºC dan tekanan 50 mmHg. Ekstrak pekat disimpan dalam wadah yang tertutup rapat untuk penggunaan selanjutnya.
Gambar 6. Skema ekstraksi suksesif
Ekstraksi Menggunakan Metanol
Ekstraksi menggunakan pelarut metanol (MeOH) dilakukan menggunakan soklet. Sebanyak ± 170 gram serbuk kulit batang dimasukkan ke dalam cartridge selulosa (kertas saring) dan diletakkan kedalam bejana soklet. Ekstraksi dilakukan pada suhu titik didih metanol yaitu ± 65ºC.
Alat soxhlet digunakan untuk ekstraksi senyawa dari fase padat dengan melewatkan dalam fase cair berupa pelarut. Serbuk kayu ditempatkan dalam
cartridge selulosa, lalu dimasukkan ke dalam tubuh extractor yang melekat pada
Serbuk kulit batang (40-60 mesh)
Diklorometan
Ekstrak diklorometan Residu Aseton
Ekstrak aseton Residu Toluen-etanol (2:1)
Residu
Ekstrak toluen-etanol Air destilasi
Residu Ekstrak air
sebuah reservoir pelarut (tabung) dan dilengkapi dengan kondensor. Pelarut diuapkan dan didinginkan dan jatuh menyentuh fase padat. Siklus ekstraksi ini kemudian diulang selama enam jam.
Untuk mengambil ekstrak yang masih bercampur dengan pelarut, maka pelarut diuapkan menggunakan vacuumrotary evaporator. Unit ini dapat dengan cepat menghapus pelarut yang mudah menguap dan menurunkan titik didih dengan mengurangi tekanan sekitar 50 mmHg. Tabung berisi ekstrak dan pelarut ditempatkan di bejana pengeringan selama beberapa menit. Untuk menghitung persentasi ekstrak digunakan rumus :
Persentasi Ekstrak = me / ms x 100 %
Dimana me adalah massa ekstrak kering dan ms (g) adalah massa sampel awal (serbuk) sebelum ekstraksi (g).
Penetapan Kadar Air
Penetapan kadar air serbuk dilakukan dengan mengeringkan serbuk pada oven bersuhu 102±3ºC. Pengukuran berat serbuk dilakukan hingga mendapatkan berat konstan. Adapun metode penetapan kadar air enggunakan rumus :
Kadar air (%) = BKU-BKT x 100% BKT
Dengan keterangan bahwa BKU adalah berat serbuk kering udara (g) dan BKT adalah berat serbuk kering oven (g).
Analisis Infra Merah (FTIR)
Analisis inframerah menggunakan perangkat FTIR Spectrum 2.000 Perkin Elmer. Sebanyak 5 mg ekstrak ditambahkan dengan kalium bromida (KBr) hingga homogen dan membentuk lempengan tipis. Lempengan yang terbentuk dianalisis dengan perangkat lunak FTIR Versi Windows 1.5 Perkin Elmer-1150F0018 PE 1995.
Analisis GCMS
Alat yang digunakan untuk analisis ini adalah kromatografi gas jenis Perkin Elmer Clarus 500, digabungkan ke spektrometer massa jenis Perkin Elmer Clarus
500, yang dikemudikan oleh TurboMass v.5.4.2 dan perangkat lunak dengan database MS NIST Cari 2.0 (2005). Pemisahan kromatografi dilakukan dengan fase diam DB-5MS (panjang 30 m, diameter 250 mm, ketebalan film 0,25 µm) dengan oven terprogram selama 40 menit, suhu oven pertama sebesar 80ºC (10 menit), kemudian 190ºC (15 menit), 280ºC (10 menit), dan terakhir pada suhu tinggi sebesar 300ºC (5 menit). Fase gerak yang digunakan terdiri dari Helium dengan laju alir 1 mL/menit. Untuk melakukan ini, ekstrak dilarutkan dengan 200 µL BSTFA (silylating agent). Persiapan ini ditempatkan selama 30 menit, ditutup dalam oven pada suhu 70ºC untuk memungkinkan BSTFA menguap. Setelah menguap, 1 mL etil asetat ditambahkan untuk melarutkan ekstraktif. Langkah terakhir yaitu 1μL larutan ekstrak disuntikkan ke GC.
Analisis LCMS
LCMS yang digunakan untuk analisis menggunakan array dioda detektor dan spektrometer massa LCMS-8030 Shimadzu (Kyoto, Jepang) terdiri dari injektor SIL-20A otomatis, dua pompa LC-20AD untuk campuran eluen, oven CTO 20-A yang mengandung kolom HPLC Phenomenex ® Luna 3u C18 dan detektor dioda-array SPD-M20A yang mengandung tungsten dan deuterium dioda. Injeksi produk yang dianalisis sebanyak 2μL. Perubahan gradien eluen menurut biner yang terdiri dari campuran air diasamkan dengan asam format 0,1% (pelarut A) dan asetonitril diasamkan dengan asam format 0,1% (pelarut B) dengan total laju aliran 0,4 mL/menit. Suhu oven diatur pada 40°C dan array detector dioda diatur ke 254 nm. Spektrometer massa terdiri sumber electrospray nebulizer (ESI) dan jenis ionisasi quadrupole. Nitrogen digunakan sebagai gas
nebulizing dan gas pengeringan. Argon digunakan sebagai gas penubruk. Hal ini akan memungkinkan untuk merekam spektrum dan kromatogram dalam mode positif dan negatif. Metode yang digunakan untuk analisis senyawa adalah ion fragmen scan producer. Potensi antarmuka (elektronebulizer dan corona) adalah 4,5 kV, laju aliran gas nebulizing adalah 3,0 L/menit dan laju aliran gas pengeringan adalah 15,0 L/min. Tekanan gas penubruk adalah 230 kPa. Setiap sampel dicatat dalam mode positif dan negatif dalam kisaran m/z 100-2000. Sekitar 4 mg ekstrak dilarutkan dalam 1-2 mL asetonitril. Untuk ekstrak yang
larut dalam metanol dilarutkan dalam 1-2 mL metanol dan dimasukkan ke dalam tabung kecil yang siap untuk dianalisis menggunakan LCMS.
Analisis NMR
Sebanyak 4 mg ekstrak ditambahkan 2 mL CDCl3. Setelah ekstrak larut lalu dianalisis alat analisis NMR Bruker DX dengan frekuensi 400Hz. Analisis NMR proton dilakukan dengan jumlah scan sebanyak 32 kali yang dilakukan pada suhu 298ºK dengan suntikan manual. Perangkat lunak yang digunakan untuk analisis adalah ACD/Chem Lab.
Analisis sakarida
Analisis sakarida dilakukan untuk mengetahui jenis dan kuantitas sakarida yang terkandung didalam ekstrak. Analisis ini dilakukan dengan melarutkan ekstrak sebanyak ±4 mg dengan ±4 mL metanol dan dianalisis menggunakan HPLC-PAD.
Kromatografi Kolom
Setelah penentuan eluen terbaik melalui teknik kromatografi lapis tipis, maka pemisahan ekstrak menggunakan kromatografi kolom dilakukan. Metode kromatografi kolom yang dilakukan adalah dengan metode normal, dimana fase gerak bersifat non polar dan fase diam bersifat polar. Dalam pengerjaan kolom, pertama penyiapan kolom setinggi ± 1.2 m. Kapas (selulosa) dimasukkan kedalam ujung kran kolom, untuk membantu pencegahan masuknya udara. Untuk menambah efisiensi kolom ditambahkan pasir anhidrida. Penambahan silika gel sebagai fase diam dilakukan hingga ± 3/4 bagian kolom. Diklorometan ditambahkan pada kolom dan sampel siap dielusi didalam kolom. Sampel berupa ekstrak yang telah dikeringkan dan menjadi serbuk dielusi sebanyak ± 5 g. Sampel ditempatkan diantara pasir anhidrida diatas lapisan silika gel. Ruang kosong diatas sampel setinggi ± 15-20 cm disiapkan untuk penambahan eluen. Penambahan eluen dilakukan dengan menggunakan pipet dengan meneteskannya disisi kolom secara beraturan setinggi ruang kosong yang tersedia. Kran kolom dibuka untuk mengelusi sampel. Kecepatan laju alir yang digunakan adalah 1 tetes/detik dengan
penampungan sampel setinggi 3/4 tinggi tabung penampung yang ditandai dengan spidol. Elusi dilakukan hingga eluat yang tertampung dalam tabung penampung tidak berwarna lagi. Eluat yang ditampung juga dipisahkan atas perbedaan warna yang ada.
Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi lapis tipis dilakukan untuk penentuan eluen dan penggolongan fraksi dari kromatografi kolom. Prinsip KLT adalah menotolkan larutan ekstrak atau eluat pada lempeng silika gel (lempeng KLT). Penotolan menggunakan pipa kapiler dengan jumlah penotolan minimal 10 kali pada tempat yang sama. Lempeng KLT dilihat dibawah sinar lampu UV 254 nm untuk melihat spot terbaik dari masing-masing penotolan. Spot yang menunjukkan pemisahan terbaik pada KLT dapat digunakan sebagai dasar penentuan eluen. Penggolongan fraksi dari eluat hasil kromatografi kolom juga dilakukan melalui KLT. Pola spot yang terbentuk dan menunjukkan kemiripan digabungkan pada fraksi yang sama. Perbedaan warna eluat juga dapat membantu penggolongan fraksi dari kromatografi kolom.
Uji Bioaktifitas Ekstrak
Jamur yang digunakan untuk uji bioaktifitas ekstrak adalah Poria placenta, Coriolus versicolor, Gloeophyllum trabeum. Jamur dibiakan pada campuran media agar (30 g) dan malt extract (40 g) dan air suling (1000 mL). Campuran media biakan ini dipanaskan pada suhu 100ºC selama 30 menit. Media biakan jamur dikondisikan pada pH 4,8 dan disterilisasi menggunakan autoclave pada suhu 120ºC selama 25 menit. Setelah steril, 20 mL media agar didistribusikan pada cawan petri berdiameter ± 9 cm. Jamur diinduksikan dibagian tengah media agar yang masing-masing terdiri dari kontrol, media agar yang ditambahkan metanol dan media agar yang ditambahkan larutan ekstrak (ekstrak dilarutkan dalam metanol) . Biakan jamur diinkubasi pada suhu 22ºC selama 7 hari pada kelembapan relatif 70%. Setelah 7 hari diameter pertumbuhan mycelium jamur diukur untuk setiap perlakuan, yakni :1) cawan petri yang tidak diberi metanol (kontrol) 2) cawan petri yang diberi metanol dan 3) cawan petri yang diberi
larutan ekstrak. Pengujian bioaktivitas ekstrak terhadap ketiga jamur diatas dilakukan secara triplo. Pengukuran indeks anti jamur menggunakan metode Mun dan Prewitt, 2011 dengan rumus :
(AI) = [1-D1/D2] x100
dimana AI adalah nilai indeks antijamur, D1 nilai diameter pertumbuhan jamur pada pada cawan petri yang telah ditambahkan ekstrak, D2 nilai diameter pertumbuhan jamur pada cawan petri yang telah ditambahkan metanol.
Secara skematis metode penelitian dapat dijelaskan sebagai berikut:
Gambar 7. Skema metode kerja penelitian
Pada metode penelitian dilakukan ekstraksi pendahuluan lalu dilihat rendemen ekstrak masing-masing pelarut serta hasil analisis GCMS. Berdasarkan penilaian kedua aspek tersebut, rendemen ekstraksi pendahuluan cenderung rendah, hasil kromatogram GCMS mengindikasikan kuantitas senyawa target yang sedikit. Berdasarkan hasil studi mengenai ekstraksi L.tomentosa sebelumnya yang menggunakan pelarut metanol, maka pelarut yang dipilih adalah metanol.
Kulit Batang Serbuk 40-60 mesh Ekstraksi (Soklet; MeOH) Analisis Fraksi (NMR, LCMS) Penentuan Struktur Kimia Senyawa Aktif Ekstraksi
Pendahuluan
4 pelarut (diklorometan, aseton,toluen-etanol, air destilasi)
Analisis FTIR,GCMS Kromatografi kolom Pemilihan pelarut Uji Bioaktivitas ekstrak
MeOH
Fraksinasi (KLT)
