LAPORAN PRAKTIKUM ANALISIS FISIKOKIMIA MENGENAI ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF
BAHAN BAKU DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
DISUSUN OLEH :
NAMA : TURYATI
NIM : D1A151085
PARTNER 1. NURIKA 2. IMAS DEDAH 3. RITA MAESAROH
LABORATORIUM KIMIA DASAR JURUSAN FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS AL GHIFARI BANDUNG
BAB I
PRINSIP DAN TUJUAN
1.1 Prinsip Percobaan
Berdasarkan metode kromatografi cair kinerja tinggi. 1.2 Tujuan Percobaan
1. Melakukan analisis kualitatif bahan baku dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi.
2. Melakukan analisis kuantitatif bahan baku dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi.
BAB II
TEORI PENUNJANG
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantaranya dua fase, yaitu fase diam (stationary) dan fase bergerak (mobile). Fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fase bergerak dapat berupa zat cair atau gas. Dalam kromatografi fase bergerak dapat berupa gas atau zat cair dan fase diam dapat berupa zat padat atau zat cair (Acun, dkk, 2010).
Banyaknya macam-macam kromatografi yang salah satunya adalah kromatografi gas, yang merupaka metode kromatografi pertama yang dikembangkan pada zaman instrumen dan elektronika. Kromatografi gas dapat dipakai untuk setiap campuran dimana semua komponennya mempunyai tekanan uap yang berarti, suhu tekanan uap yang dipakai untuk proses pemisahan. Tekanan uap atau keatsirian memungkinkan komponen menguap dan bergerak bersama-sama dengan fase gerak yang berupa gas (Acun, dkk, 2010).
Kromatografi gas metode yang tepat dan cepat untuk memisahkan campuran yang sangat rumit. Waktu yang dibutuhkan beragam, mulai dari beberapa detik untuk campuran yang sederhana sampai berjam-jam untuk campuran yang mengandung 500-1000 komponen. Metode ini sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah menguap seperti hidrokarbon dan eter. Analisis minyak mentah dan atsiri dalam buah telah dengan sukses dilakukan dengan tehnik ini. Efisien pemisahan ditentukan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan cairan, dengan menggunakan fase cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai senyawa (Acun, dkk, 2010).
tetap dilaksanakan di dalam kolom disertai pemakaian pelarut pengembangdengan tekanan tinggi (Ahmad dan Suherman, 1995).
Prinsip dasar dari HPLC, dan semua metode kromatografi adalah memisahkan setiap komponen dalam sample untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut (kuantitatif). Analisa kualitatif bertujuan untuk mengetahui informasi tentang identitas kimia dari analat dalam suatu sample. Sedangkan analisa kuantitaif untuk mengetahui jumlah dan konsentrasi analat tersebut dalam sample (Riyadi, 2009).
Teknik HPLC merupakan satu teknik kromatografi cair- cair yang dapat digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis kuantitatif dengan teknik HPLC didasarkan kepada pengukuran luas atau area puncak analit dalam kromatogram, dibandingkan dengan luas atau area larutan standar. Pada prakteknya, perbandingan kurang menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan satu standar, oleh karena itu maka perbandingan dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi (Cupritabu, 2010).
Pendahuluan zat aktif yang memiliki kompresibilitas buruk akan tetapi dikehendaki dalam takaranyang besar harus dibuat dengan cara granulasi basah. Apabila dibuat dengan cetak langsungakan dibutuhkan banyak bahan tambahan, sehingga volume tablet menjadi terlalu besar (Hoover, 1975).
berbahan organik sehingga berikatan secara kimia atau fisika terhadap permukaannya. (Skoog et al., 1998)
Pemilihan parasetamol sebagai model disebabkan parasetamol adalah salah satu obat analgetik-antipiretik yang banyak digunakan khususnya di fasilitas pelayanankesehatan pemerintah. Parasetmol memiliki kompresibilitas yang buruk sementaraitu jumlah parasetamol dalam satu tablet cukup besar yaitu 500 mg, sehingga untuk menghasilkan tablet dengan mutu fisik yang memuaskan harus dibuat dengan metodegranulasi basah (DepKes RI, 1990).
BAB III
PROSEDUR PERCOBAAN
3.1 Prosedur Percobaan 1. Analisis Kualitatif
Larutan Standar
a) Timbang 25 mg parasetamol serbuk kemudian masukkan ke dalam labu takar 25 ml!
b) Larutkan parasetamol dalam fase gerak hingga tanda batas! Fase gerak yang digunakan adalah asam asetat (methanol 40 ml ditambahkan aquabides 60 ml).
c) Kocok larutan hingga homogen. Saring larutan dengan membrane filter nilon ukuran 0,45 mikrometer!
d) Larutan siap untuk diinjeksikan ke dalam KCKT! Larutan Uji
a) Timbang 25 mg parasetamol kemudian masukkan ke dalam labu takar 25 ml!
b) Larutkan parasetamol dalam fase gerak hingga tanda batas!
c) Kocok larutan hingga homogen. Saring larutan dengan membrane filter nilon ukuran 0,45 mikrometer!
d) Larutan siap untuk diinjeksi ke dalam alat KCKT!
kromatogram larutan uji dan larutan standar. Waktu retensi puncak larutan uji harus sama dengan waktu retensi puncak larutan standar.
2. Analisis Kuantitatif Larutan Standar
a) Timbang 25 mg baku pembanding parasetamol lalu masukkan ke dalam labu takar 25 ml!
b) Encerkan dengan fase gerak hingga tanda batas! c) Kocok larutan hingga homogen!
d) Pipet masing-masing larutan 4, 5, 6, 7, 8, dan 9 ml larutan stok baku pembanding ke dalam labu takar 10 ml!
e) Encerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Saring larutan dengan membrane filter nilon ukuran 0,45 mikrometer!
f) Larutan siap untuk diinjeksikan ke dalam alat KCKT! g) Hitung konsentrasi masing-masing larutan kurva kalibrasi!
Larutan Uji
a) Timbang dengan seksama 25 mg parasetamol!
b) Masukkan ke dalam labu takar 50 ml dan encerkan dengan fase gerak hingga tanda batas!
c) Kocok larutan hingga homogen lalu saring dengan membrane filter nilon ukuran 0,45 mikrometer!
Cara Kurva Kalibrasi
Injeksikan masing-masing serangkaian konsentrasi larutan standard dan larutan uji. Dengan menggunakan kurva kalibrasi atau persamaan garis, hitunglah kadar larutan sampel (jangan lupa factor pengencerannya).
Cara One Point
3.2 Alat-alat yang Digunakan 1. Timbangan
2. Pipet
3. Labu takar 50, 25 dan 10 ml
4. Saringan membrane filter nilon ukuran 0,45 mikrometer 5. Kromatografi cair kinerja tinggi
6. Gelas ukur
3.3 Bahan-bahan yang Digunakan 1. Parasetamol
BAB IV
HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Percobaan A. Analisa Kualitatif
a. Berat bahan baku pembanding Paracetamol (larutan standar) 25 mg. b. Perhitungan ppm sebagai berikut :
Larutan Uji :
- Volume = 25 ml = 0,025 L
- Konsentrasi = m (mg)/V (L) = 25/0,025 = 1000 ppm.
Larutan Standar
- Volume = 25 ml = 0,025 L
- Konsentrasi = m (mg)/V(L) = 25/0,025 = 1000 ppm. c. Hasil pengamatan :
Metode Analisis Waktu Retensi Luas Area
Larutan Standar 4,442 523218,6
B. Analisa Kuantitatif
- Berat baku pembanding PCT (larutan standar) = 25 mg. - Volume = 25 ml = 0,025 L.
- Berat bahan baku PCT (larutan uji) = 25 mg. - Volume = 50 ml = 0,05 L.
- Perhitungan ppm uji = 25 mg / 0,05L = 500 ppm. - Perhitungan ppm standar = 25mg/ 0,025L = 1000 ppm. - Perhitungan pengenceran standar:
V2 = 10 ml, N1 = 1000 ppm.
1. V1 = 4 mL V1N1 = V2N2
4 ml . 1000 ppm = 10 ml . � � = 400 ppm
2. V1 = 5 mL V1N1 = V2N2
5 ml . 1000 ppm = 10 ml . � � = 500 ppm
3. V1 = 6 mL V1N1 = V2N2
6 ml . 1000 ppm = 10 ml. x � = 600ppm
V1N1 = V2N2
7 ml . 1000 ppm = 10 ml . � � = 700 ppm
5. V1 = 8 mL V1N1 = V2N2
8 ml . 1000 ppm = 10 ml . � � = 800 ppm
6. V1 = 9 mL V1N1 = V2N2
9 ml . 1000 ppm = 10 ml. � � = 900 ppm
- Hasil Pengamatan Analisis Kuantitatif Tabel Kurva Kalibrasi
Konsentrasi (ppm) (x) Luas Area (y)
400 516970
600 526414
800 703049,5
900 1189728,7
Larutan Uji
Waktu Retensi Luas Area
4,483 635299,3
Dengan mensubstitusikan besarnya luas area larutan uji ke dalam persamaan regresi linier diatas, maka dapat diketahui besarnya konsentrasi larutan uji dalam perhitungan berikut : y = 4E – 05x + 3,1803
635229,3 = 4.10 -5x + 3,1803 4.10 -5x = 635229,3 – 3,1803 4.10 -5x = 635296,12
X = 1,588240
Konsentrasi sample = 25 ml/2ml x 1,6 = 19,853ppm
% kadar = 19,853 /50 x 100% = 39,7 %
Cu = 635299,3/703049,5 x 40 Cu = 36,14
% Kadar = 36,14/50 x 100 = 72,28 %
Analisis kuantitatif adalah salah satu metode pengujian suatu senyawa atau zat kimia untuk menentukan kadar senyawa tersebut. Salah satu senyawa atau zat yang dapat dianalisis kuantitatif adalah kadar senyawa obat. Banyak instrumen atau alat yang dapat digunakan untuk menentukan kadar senyawa aktif suatu obat, salah satunya adalah menggunakan instrumen Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau yang lebih dikenal dengan HPLC (High Performance Liquid Cromatography). Prinsip kerja dari penggunaan alat ini adalah pemisahan satu atau lebih komponen berdasarkan kepolaran, dimana sampel atau larutan uji (contoh : senyawa obat) dibawa oleh fase gerak (dengan sifat kepolaran tertentu) melewati fase diam (dengan sifat kepolaran berbeda dengan fase geraknya). Sehingga menyebabkan larutan uji akan tertambat disalah satu fase gerak atau pun fase diamnya dan kemudian akan terdeteksi oleh detector (komponen alat HPLC). Sehingga pada akhirnya dapat diukur kadar satu atau lebih komponen dari suatu larutan uji (senyawa obat).
Pada percobaan kali ini penggunaan instrumen HPLC/KCKT digunakan untuk melakukan analisa baik secara kualitatif maupun kuantitatif terhadap sediaan farmasi berupa tablet paracetamol yang dijual di pasaran. Analisis kualitatif dilakukan dengan tujuan untuk membuktikan bahwa adanya kandungan dalam tablet tersebut, dan analisis kuantitatif dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kadar paracetamol yang terkandung dalam sediaan tablet.
digunakan. Sedangkan fase gerak yang digunakan adalah campuran air dengan metanol perbandingan 4 : 6. Karena kedua fase yang digunakan berbentuk cair, maka sistem kromatografi yang digunakan pada percobaan ini adalah kromatografi partisi, dimana pemisahan terjadi berdasarkan partisi analit dalam dua cairan yang tidak saling bercampur. Pemisahan akan terjadi karena adanya perbedaan kelarutan komponen sample dalam kedua fase cair tersebut. Berdasarkan sifat kepolaran dari fase diam dan fase gerak yang digunaakan, sistem kromatografi pada percobaan ini berlangsung dengan fase balik ini menunjukkan bahwa fase gerak yang digunakan memiliki sifat kepolaran yang lebih tinggi dibandingkan fase diamnya, sehingga senyawa yang akan terelusi terlebih dulu adalah senyawa yang bersifat sangat polar.
Senyawa uji yang digunakan pada percobaan ini adalah parasetamol. Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar, dengan gugus kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Untuk analisis senyawa ini sistem kromatografi yang harus digunakan di jelaskan dalam Farmokpe IV bahwa Komotografi cair kinerja tinggi yang di gunakan untuk penetapan kadar dilengkapi dengan detektor 243 nm yang berada di daerah serapan Ultra Violet dan kolom 3,9 mm x 30 cm berisi bahan pengisi (fasa diam) L1 ataupun ODS (Octadesylsilane) yang berbersifat non polar. Laju aliran 1,5 mL/menit, dan efisiensi kolom tidak kurang dari 1000. Fasa gerak yang digunakan bersifat polar seperti methanol : air (1:3).
Dalam strukturnya, parasetamol memiliki gugus kromofor, yaitu gugus yang bertanggung jawab untuk berinteraksi dengan radiasi elektromagnetik. Detektor yang digunakan pada percobaan ini adalah detektor UV, dengan panjang gelombang 243 nm. Penggunaan detektor UV untuk mendeteksi senyawa parasetamol ini disebabkan karena parasetamol memiliki gugus kromofor yang dapat menyerap radiasi elektromagnetik pada panjang gelombang sinar UV.
Untuk melakukan uji analisis keberadaan zat aktif dan penentuan kadar dari tablet paracetamol ini, pertama-tama yang perlu dilakukan adalah persiapan fase diam dan fase gerak yang digunakan dalam HPLC dan juga persiapan dan pembuatan larutan standar paracetamol, larutan uji dan larutan untuk kurva kalibrasi. Sebelum sampel uji parasetamol dan standar parasetamol diinjeksikan, terlebih dahulu larutan tersebut disaring mengunakan filter PTFE 0,45 µm untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam larutan juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Pembuatan larutan standar dilakukan dengan menimbang baku pembanding paracetamol (dari Industri Farmasi) sebanyak 25 mg kedalam labu takar 25 ml dan diencerkan dengan fase gerak hingga 25 ml sehingga didapat larutan stok baku pembanding. Dari larutan stok pembanding dibuat serangkaian pengenceran untuk kurva kalibrasi yang masing masing konsentrasinya adalah 4 ml; 5 ml; 6 ml; 7 ml; 8 ml; dan 9 ml kedalam labu takar 10 ml yang kemudian diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas.
ditambahkan 50ml fase gerak dan dikocok selama 10 menit kemudian ditambahkan fase gerak hingga tanda batas. Dari larutan uji dipipet sebanyak 2.0 ml dan dimasukan kedalam labu takar 25 ml kemudian diencerkan hingga tanda batas. Kemudian saring larutan uji menggunakan membran filter PTFE 0.45 µm, dibuang sebanyak 2 ml filtratnya. Pembuangan filtrat pertama digunakan untuk membilas filter, agar filtrat yang selanjutnya tidak mengandung banyak pengotor. Diambil hasil filtrat sebanyak 10ml untuk diinjeksikan kedalam alat HPLC.
Prosedur kurva kalibrasi ini dilakukan dengan cara menginjeksikan serangkaian pengenceran dari stok larutan standar yang telah dibuat yang masing-masing konsentrasinya adalah 4 ml; 5 ml; 6 ml; 7 ml; 8 ml; dan 9 ml. Kurva kalibrasi digunakan untuk menentukan kadar sampel dari persamaan regresi linier yang diperoleh dari kurva kalibrasi tersebut.
Setelah prosedur dan data kurva kalibrasi dilakukan dan didapat langkah akhir dari uji penetapan kadar paracetamol ini adalah penginjeksian larutan tablet obat paracetamol. Penginjeksian ini dilajukan satu kali injeksi, yang kemudian akan didapatkan data waktu retensi dan luas area. Dari data yang didapatkan selanjutnya adalah memasukan data luas area yang didapat ke dalam persamaan regresi linier yang (dari data kurva kalibrasi) atau menggunakan cara one point untuk mendapatkan persentase kadar dari larutan tablet obat paracetamol.
parasetamol. Karena sebelumnya tidak lakukan uji kesesuaian sehingga kemungkinan tidak menunjukan hasil yang sebenarnya.
Penentuan kadar (analisis kuantitatif) dapat diketahui dari persamaan regresi linier yang diperoleh dari kurva kalibrasi larutan standar. Larutan standar yang diinjeksikan dengan konsentrasi yang berbeda memberikan luas area yang berbeda-beda yang kemudian dibuat dalam bentuk kurva kalibrasi dan didapat persamaan regresi linier untuk digunakan dalam penentuan kadar bahan baku parasetamol. Hasil dari persamaan regresi linier ini kemudian dimasukkan nilai luas area bahan baku parasetamol yang didapat dari hasil kromatogram bahan baku parasetamol. Didapat konsentrasi bahan baku parasetamol adalah 19,853 ppm. Dari konsentrasi ini kemudian dihitung kadar parasetamol dan didapat kadar sebesar 39,7%. Selain dengan metode kurva kalibrasi, penentuan kadar sampel uji dapat diketahui dengan menggunakan metode one point. Dalam metode one point ini menunjukkan bahwa besarnya kadar suatu senyawa akan berbanding lurus dengan luas area kromatogram. Dari hasil perhitungan dapat diketahui bahwa kadar dari parasetamol sebesar 72,28. Dalam Farmakope Indonesia Ed IV (Hal 650), disebutkan bahwa tablet parasetamol mengandung parasetamol C8H9NO2, tidak kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 110,0% dari jumlah yang tertera pada etiket.
Kesalahan analisa pada percobaan ini kemungkinan besar berasal dari cara kerja praktikan yanng tidak sesuai prosedur, kesalahan dalam pengenceran atau pembuatan larutan standar sehingga mengakibatkan kurva kalibrasi hasilnya jelek, kemudian tidak diuji kesesuaian . Dalam analisa kualitatif, waktu retensi puncak larutan uji tidak sama dengan standar. Dan dalam analisa kuantitatif, nilai kadar yang diperoleh melebihi batas kadar yang telah ditetapkan dalam Farmakope. Perbedaan nilai kadar ini pun dapat disebabkan oleh sifat bahan yang sudah tidak stabil atau mungkin telah melewati tanggal kadaluarsanya.
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
1. Tidak dilakukan uji kesesuaian.
2. Analisis kualitatif sediaan tablet parasetamol dapat dilakukan menggunakan metode KCKT.
3. Rt larutan standar sebagai pembanding dan larutan uji memiliki nilai yang sama yang menunjukkan keberadaan parasetamol pada bahan baku.
4. Analisis kuantitatif sediaan tablet parasetamol dapat dilakukan menggunakan metode KCKT.
5. Kadar sediaan tablet parasetamol menggunakan perhitungan kurva kalibrasi adalah 39,7%.
6. Kadar sediaan tablet parasetamol menggunakan perhitungan one point adalah 72,28%.
7. Mutu sediaan tablet parasetamol tidak bagus karena kadarnya yang tidak sesuai dengan literatur yang kurang dari 110.0% sehingga tidak layak untuk dikonsumsi, atau sediaan sudah rusak atau tidak stabil sehingga kadar menurun.
Hilma Hendrayanti, M.Si.,Apt, Modul Praktikum Analisis Fisikokimia. Universitas Al-Ghifari
Http://www.anitamuinia.worpress.com/hplc diakses 22/03/17 10:01 WIB
Http://www.thivachemchem.blogspot.co.id/penentuankadarparacetamol-hplc diakses 22/03/17 10:12WIB
Wilmana, P.F. (1995). Analgesik-Antipiretik,AnalgesikAnti-Inflamasi Non Steroid dan Obat Pirai : Farmakologi dan Terapi. Edisi ke 4. Jakarta. Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia.
http://www.sciencelab.com/analytics/pdf/msds. Diakses tgl 15/3/2017 jam 21.11 WIB
