BIOLOGI SELULER DAN MOLEKULER

(1)

BIOLOGI SELULER DAN MOLEKULER

KODE MK : 04015061 JUMLAH SKS : 2 SKS SEMESTER : III (TIGA)

Edisi Revisi 2020

(2)

Metode Analisis Molekuler:

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Tatap Muka ke-14

Disusun oleh: Tim Dosen Biologi Sel Molekuler

(3)

Ingat Kembali Materi Terkait DNA

(4)

[email protected]

www.uhamka.ac.id (021)73944451 uhamkaid Uhamka @UhamkaID

Ingat Kembali Materi Terkait Replikasi

(5)

Reaksi Polimerase Berantai

(6)

[email protected]

• Reaksi Polimerase Berantai ~ Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu metode amplifikasi

(perbanyakan) fragmen DNA secara invitro berdasarkan prinsip replikasi DNA

• Metode ini dikembangkan oleh ilmuan biokimia bernama Kary Mullis (1983)

• Berkat penemuannya ini Kary Mullis memenangkan hadiah Nobel dibidang Kimia pada tahun 1993

Reaksi Polimerase Berantai

(7)

Komponen Reaksi PCR

(8)

[email protected]

Target DNA (template) yang akan diamplifikasi / perbanyak

• Sumber DNA bisa dari mana saja:

▪ DNA sel prokariotik

▪ DNA sel eukariotik

▪ DNA mitokondria

• Sebelum dijadikan template, DNA dari sel ataupun sampel lainnya harus diisolasi/diekstraksi terlebih dahulu

• Proses/metode isolasi disesuaikan dengan karakteristik sel dan sampelnya

Fragmen DNA/Cetakan DNA

▪ DNA virus

▪ DNA rekombinan/kloning

(9)

Oligonukleotida DNA rantai tunggal pendek yang

berkomplemen dengan urutan basa target DNA yang akan diamplifikasi

• Primer menentukan spesifisitas reaksi dari metode PCR

• Hasil dari PCR (amplikon) besarannya ditentukan dari jarak antar pasangan primer

• Primer dapat dirancang sesuai dengan keinginan

• Sebelum digunakan, primer sebaiknya dioptimasi untuk mendapatkan hasil yang optimal

Sepasang Primer

(10)

[email protected]

• Panjang primer

18 – 22 pasang basa

• Melting temperature (Tm) / suhu peleburan 52 – 60

^o

C

• Kandungan Guanin (G) dan Sitosin (C) 40 – 60 %

• Hindari struktur sekunder

• Hair-pin Loop

• Self-Dimer

• Cross-Dimer

Kriteria Primer

https://youtu.be/OcN6mML3DGI

(11)

1. Menyiapkan sekuen referensi

a) Pilih sekuen referensi dari database GenBank dari situs (www.ncbi.nlm.nih.gov), misalkan gen eae dari E.coli

b) Masuk di NCBI → pilih nukleotida → masukkan nama sekuen gen yang diinginkan → klik FASTA → salin sekuen/simpan

Melakukan Desain Primer

(12)

[email protected]

2. Buka software untuk mendesign primer, contoh Primer3plus

(http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi)

Melakukan Desain Primer

(13)

3. Masukkan sekuen pada kotak yang tersedia atau bisa mengunggah (upload) sekuen dari file komputer

Melakukan Desain Primer

(14)

[email protected]

4. Pilih jenis primer yang ingin didesain, primer sense (left

primer ), antisense (right primer ), probe/pelacak (internal oligo)

Melakukan Desain Primer

(15)

5. Tentukan parameter lain jika diperlukan

Melakukan Desain Primer

(16)

[email protected]

6. Klik di “General Settings” → Atur parameternya

Melakukan Desain Primer

(17)

7. Didapatkan urutan pasangan primernya

Forward: CTGCTGAAATGTACGGCTGA Reverse: TGCAGGATGGGAAATACACA

Melakukan Desain Primer

(18)

[email protected]

8. Lalukan konfirmasi

• NCBI → BLAST → BLAST Nukleotida

• Masukkan salah satu sekuen primer nya

Melakukan Desain Primer

(19)

Enzim termostabil yang berperan dalam sintesis DNA

• Bersifat termostabil agar tahan terhadap tahapan reaksi bersuhu tinggi

• Berfungsi mensistesis rantai DNA baru dari cetakan DNA yang digunakan

• Jenis yang umum digunakan adalah enzim Tag Polimerase yang berasal dari mikroorganisme Thermophillus aquaticus

Enzim DNA Polimerase Termostabil

(20)

[email protected]

Beberapa Contoh Enzim Polimerase

(21)

dNTP merupakan nukleotida penyusun rantai DNA baru

• Merupakan material building blocks/penyusun dari sintesis DNA

• Memiliki 2 tambahan gugus fosfat dari bentuk nukelotida pada umumnya

• N ~ Nukeolutida secara umum, mewakili A, C, T, dan G

Deoksinukleotida Trifosfat (dNTP)

(22)

[email protected]

Struktur dNTP

(23)

Mempertahankan kondisi lingkungan yang optimal untuk reaksi PCR

• Diperlukan untuk menciptakan kondisi lingkungan yang optimal dikarenakan proses sistesis DNA terjadi secara invitro

• Beberapa komponen dalam buffer PCR:

• 100 mM Tris-HCl (pH 8,8) →mempertahankan kondisi pH antara 8-9

• 50 mM KCl → memfasilitasi penempelan primer saat PCR

• 15 mM MgCl

₂

→ co-faktor bagi enzim polimerase

Larutan Penyangga/Buffer

(24)

[email protected]

Tahapan Utama Metode PCR

(25)

Pemisahan untai ganda DNA menjadi untai tunggal

• Tahapan pertama dari metode PCR dimana terjadinya pemutusan ikatan hidrogen antar basa nitrogen pada

DNA yang menyebabkan untai ganda DNA menjadi untai tunggal

• Suhu reaksi: 90 – 98

^o

C selama 20-30 detik

Tahap Denaturasi

(26)

[email protected]

Penempelan primer pada fragmen spesifik DNA target

• Tahapan kedua dari metode PCR dimana terjadinya

penempelan primer pada fragmen spesifik DNA target sesuai dengan urutan basa primernya yang telah

dirancang sebelumnya

• Suhu reaksi: 50 – 65

^o

C selama 20-40 detik

Tahap Penempelan/Annealing

(27)

Pemanjangan primer/sintesis DNA sesuai dengan urutan fragmen spesifik DNA target

• Tahapan terakhir dari metode PCR dimana terjadinya pemanjangan primer (sintesis DNA) dengan bantuan enzim DNA polimerase membentuk komplemen DNA dari untai tunggal DNA target

• Suhu reaksi: 70 – 80

^o

C selama 60 detik

Tahap Ekstensi/Pemanjangan

(28)

[email protected]

Animasi Reaksi PCR

(29)

Instrumentasi PCR & Pendukung

Kabinet PCR

Mikropipet

Minisentrifus

Mikrosentrifus

Vortex

Drybath

Cool Plate Mesin PCR

(30)

[email protected]

Replikasi vs PCR

No Replikasi DNA PCR

1 Enzim Helikase Pemanasan suhu 90 – 95

^o

C 2 Origin of Replication Sepasang Primer spesifik

komplemen dengan basa template 3 Enzim Primase Penurunan suhu menjadi 50 – 60

^o

C 4 Enzim DNA Polimerase Enzim DNA Polimerase termostabil 5 Proses Elongasi Suhu dipertahankan 70 – 80

^o

C

6 Satu siklus = 1 pembelahan sel bakteri

Jumlah siklus 20 – 40 x

(31)

Mari mengenal beberapa aplikasi dari metode PCR

1. Pendeteksian Cemaran Organisme, 2. Pengidentifikasian Orgenisme,

3. DNA Forensik,

4. Diagnosis Penyakit,

5. Pemetaan Sifat Keturunan, 6. Isolasi Gen,

7. Perubahan/Mutasi Genetik,dsb.

Aplikasi PCR

(32)

[email protected]

Mari mengenal titik kritis dari metode PCR 1. Metode Ekstraksi DNA

2. Design Primer

3. Protokol Pengerjaan dan Komposisi Reaksi PCR 4. Design Laboratorium

Titik Kritis Pengerjaan PCR

(33)

Ilustrasi Aplikasi PCR

https://youtu.be/ThG_02miq-4

(34)

[email protected]

Mari mengenal tipe-tipe PCR berdasarkan prinsip kerjanya:

1. Konvensional PCR (PCR)

PCR generasi pertama

2. Real-time PCR (qPCR)

PCR generasi kedua

3. Digital PCR (dPCR)

PCR generasi ketiga

4. Isotermal PCR (LAMP – Loop Mediated Isothermal Amplification)

Rapid PCR

Beberapa Tipe PCR

(35)

Kualitatif PCR yang membutuhkan instrument tambahan untuk analisisnya

• Merupakan standar PCR yang menyediakan hasil kualitatif dan masih memerlukan intrumen tambahan dalam analisa/visualisasi hasilnya

• Hasil akhirnya berupa visualisasi pita-pita DNA

• Membutuhkan instrument elektroforesis agar (Gel

electrophoresis) dan dokumentasi agar (Gel documentation) untuk visualisasinya

• Pewarnaan DNA dilakukan setelah proses PCR selesai dan biasanya menggunakan pewarna Etidium Bromida (EtBr)

Konvensional PCR

(36)

[email protected]

Illustrasi Konvensional PCR

(37)

Pemisahan fragmen DNA berdasarkan ukurannya

• Di akhir proses PCR terdapat beberapa kemungkinan fragmen DNA (DNA target, Amplikon, Amplikon tidak spesifik, Primer Dimer, dsb) yang

ukurannya beragam. Fragmen-fragmen ini akan diseparasi/dipisahkan berdasarkan ukurannya dengan bantuan elektroforesis agar

• Migrasi DNA pada agar dapat terjadi dikarenakan DNA memiliki muatan negatif dikarenakan gugus fosfatnya

• Marker DNA digunakan untuk memudahkan analisis

• DNA yang telah diseparasi kemudian diwarnai dan divisualisasikan

• Selain untuk DNA, elektroforesis agar juga dapat digunakan untuk separasi RNA dan protein

Elektroforesis Agar

(38)

[email protected]

Ilustrasi Elektroforesis Agar

Jenis agar yang biasa digunakan adalah Agarosa

Jenis buffer yang biasa digunakan:

• Tris/Acetate/EDTA (Buffer TAE)

• Tris Borate/EDTA (Buffer TBE)

(39)

Alir Kerja Elektroforesis Agar

(40)

[email protected]

Pewarnaan DNA dengan penyisipan ke dalamnya (intercalating agent)

• Pewarnaan menggunakan EtBr merupakan zat warna yang bersifat intercalating agents

• Pewarnaan DNA dilakukan dikarenakan DNA tidak memiliki warna, sehingga perlu diwarnai untuk memudahkan proses analisis

• Pewarnaan menggunakan EtBr merupakan pewarna fluoresensi yang dapat berpendar di bawah sinar UV

Etidium Bromida (EtBr)

(41)

Etidium Bromida (EtBr)

(42)

[email protected]

Visualisasi dan dokumentasi fragmen DNA untuk analisis

• Fragmen DNA yang telah diseparasi kemudian diwarnai dan divisualisasi untuk analisa lebih lanjut

• Proses dokumentasi biasanya dilakukan untuk melakukan report hasil PCR dan analisa lanjutan

• Dokumentasi biasanya dilakukan dengan 2 bentuk,

dokumentasi di kondisi terpapar sinar UV ataupun dengan cahaya lampu biasa

Dokumentasi Agar

(43)

Ilustrasi Dokumentasi Agar

(44)

[email protected]

Animasi Elektroforesis Agar

https://youtu.be/saJIWFUGEbw

(45)

Hasil dari Reaksi Konvensional PCR

Pita DNA Hasil dari Analisa Konvensional PCR

(46)

[email protected]

Kualitatif dan Semi Kuantitatif PCR yang sudah tidak membutuhkan instrument tambahan untuk analisisnya

• Biasa dikenal dengan sebutan quantitative PCR (qPCR)

• Menggunakan tambahan pewarna fluorensensi dalam proses reaksinya

• Hasil dapat diamati secara real time/langsung selama proses berjalan

• Berdasarkan jenis pewarna yang digunakan, qPCR dibedakan menjadi 2, yaitu:

• DNA-binding dye/intercalating dye

• Hybridization Probe/pelacak

• Hasil akhirnya berupa kurva antara nilai fluoresensi vs siklus PCR

Real-Time PCR

(47)

Ilustrasi Real-Time PCR

(48)

[email protected]

Sinyal fluoresensi dihasilkan setiap setelah tahapan ekstensi berakhir

• Pewarna dengan kategori DNA-Binding Dye digunakan untuk mewarnai untai ganda DNA

• Pewarna ini dapat menyisipi untai ganda DNA karena termasuk ke dalam kategori intercalating dye

• Keungggulan pewarna ini adalah harganya yang relatif lebih murah dibandingkan dengan pewarna jenis probe/pelacak

• Kelemahan pewarna ini adalah cara kerjanya yang tidak spesifik. Hal ini

dikarenakan pewarna ini akan mewarnai semua undai ganda DNA yang ada termasuk DNA target dan primer dimer

• Beberapa contoh pewarna jenis ini adalah:

• EtBr

• SYBR Green

DNA-Binding Dye qPCR

3’

3’ 5’

Taq

ID ID ID Taq

ID ID

l l l

l l

(49)

Reaksi DNA-Binding Dye

(50)

[email protected]

Reaksi DNA-Binding Dye

(51)

Sinyal fluoresensi dihasilkan setiap tahapan ekstensi berlangsung

• Merupakan pewarna fluoresensi yang menggunakan oligonukleotida yang diberi label dengan reporter fluoresen yang memungkinkan pendeteksian hanya setelah terjadinya proses hibridisasi pada pelacaknya

• Pewarna dengan kategori Pelacak/Probe Dye menggunakan kombinasi Fluorophore dan Quencher

• Keungggulan pewarna ini adalah pendarannya bersifat spesifik

• Kelemahan pewarna ini adalah harganya yang relative lebih mahal dibandingkan DNA-Binding dye

• Beberapa contoh pewarna jenis ini adalah:

• TaqMan

• Scorpion

• Locked Nucleid Acid (LNA)

Hybridization Probe Dye qPCR

(52)

[email protected]

Reaksi Hybridization Probe Dye

(53)

Reaksi Hybridization Probe Dye

(54)

[email protected]

SYBR vs Probe

Pewarna SYBR:

+ Cost reaksi relatif murah

+ Dapat melakukan analisis Melting Curves - Reaksi bersifat kurang spesifik

Pewarna Probe:

- Cost reaksi relatif mahal

+ Reaksi bersifat lebih spesifik

+ Dapat melakukan multiplexing PCR

(55)

Hasil dari Reaksi qPCR

Grafik Hasil dari Analisa qPCR

(Nilai Fluoresensi vs Siklus PCR)

(56)

[email protected]

Unit Satuan Hasil qPCR

Cq

Threshold Log Format

Nilai Cq atau Ct, merupakan jumlah siklus yang dibutuhkan sinyal fluoresen melewati garis ambang/threshold

(57)

[email protected]