20 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN A. Metode Penelitian
Penelitian dilakukan dengan metode eksperimental dalam laboratorium.
Daun pacar kuku dibuat serbuk lalu dimaserasi menggunakan pelarut etanol 70%, kemudian dilakukan pemisahan melalui kromatografi vacum cair (KVC) dengan tingkat kepolaran eluen yang meningkat yaitu n-heksan, etil asetat, dan etanol.
Pengujian aktivitas fraksi teraktif antibakteri ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.) dilakukan dengan metode difusi perforasi, kemudian diukur diameter daerah hambatnya dan ditentukan nilai bandingnya terhadap antibiotik tetrasiklin HCl. Identifikasi senyawa kimia dalam fraksi teraktif anti bakteri dilakukan dengan menggunakan GC-MS.
B. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian mulai dilakukan pada bulan Mei 2012 hingga Maret 2013 di Laboratorium Kimia Dasar FMIPA UNS dan Laboratorium Biologi FMIPA UNS, Surakarta.
C. Alat dan Bahan
Alat–alat yang digunakan adalah toples kaca, pengaduk kaca, kertas saring, penyaring Buchner, corong penyaring, pipet tetes, rotary evaporator (Buchi), kolom Kromatografi vacum cair (KVC), klem, statif, neraca analitik (Denver INST.TL603D), pendeteksi UV, hotplate-stirer (RCT Basic Labortechnik), autoclave(Presoclave 75 P-Selecta), Laminar Air Flow (Minihelik II, dwyer), inkubator (Hotcold M P-Selecta), GC-MS (QP2010S SHIMADZHU), penyemprot KLT, pipa kapiler, perforator (6 mm), mikropipet 10-100 µL, vortex mixer, cawan petri,kapas, tabung reaksi, alat-alat gelas, jarum ose, gelas ukur, yellow pet, dan eppendorft.
Bahan-bahan yang digunakan adalah simplisia daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.), etanol 70% dan etanol 96 %, n-heksan,etil asetat, aseton, larutan dimetil sulfoksida (DMSO), akuades, bahan-bahan E. Merck seperti : asam asetat
commit to user
glasial, metanol, toluen, dietil amin, dietil eter, H2SO4 pekat, asam formiat, AlCl3, HCl 3M, NaCl, bismuth nitrat, KI, SbCl3, FeCl3, KOH, benzene, dan kloroform, isolat Staphylococcus aureus, isolatEscherichia coli, MSA (Manitol Salt Agar), MCA (Mac Conkey Agar), tetrasiklin HCl, rhodamin B, dan Ce(SO4).4H2O.
D. Prosedur Penelitian
1. Identifikasi dan Determinasi Bahan Awal
Identifikasi dan determinasi tanaman sebagai bahan awal diakukan pada bagian daun, batang, bunga, biji, dan buah.
2. Persiapan Sampel
Daun pacar kuku diangin-anginkan hingga kering, tanpa menerima cahaya matahari secara langsung. Setelah kering kemudian dihaluskan hingga berupa serbuk halus.
3. Isolasi Senyawa Kimia
Isolasi senyawa kimia daun pacar kuku dilakukan dengan metode ekstraksi maserasi dengan pelarut etanol 70%. Maserasi dilakukan di dalam bejana kaca, terhindar dari cahaya langsung, dan dilakukan selama 3 hari dengan pengadukan.
Maserasi dilakukan sebanyak dua kali (remaserasi). Maserasi kedua juga dilakukan selama 3 hari.Selanjutnya dilakukan penyaringan untuk menghasilkan maserat. Pelarut etanol diuapkan dari maserat dengan menggunakan rotary evaporator hingga didapat ekstrak kental.
4. Pemisahan Ekstrak Etanol
Senyawa campuran dalam ekstrak kental etanol dipisahkan dengan kromatografi vacum cair untuk memudahkan mengetahui senyawa aktif yang berpotensi sebagai antibakteri. Pemisahan melalui KVC menggunakan silika GF254 sebagai fase diam dan silika adsorb G60 untuk mengimpregnasi sampel.
Perbandingan yang dipilih antara sampel dengan fase diam adalah 1:7 sedangkan perbandingan antara sampel dengan silika adsorb adalah 1:1. Sebanyak 5 gram ekstrak kental daun pacar kuku dilarutkan dalam aseton lalu diimpregnasi dengan
commit to user
5 gram silika G60. Proses impregnasi dilakukan hingga sampel berupa serbuk kering. Sampel yang kering tersebut kemudian diletakkan di atas fase diam, silika GF254 yang telah dipadatkan dalam sistem vacum KVC. Silika GF254 yang digunakan sebanyak 35 gram.
Proses pemisahan dilakukan 5 kali, dengan proses elusi dimulai dari pelarut non polar hingga polar, yaitu secara berturut-turut heksana, etil asetat, lalu etanol.
Dengan volume masing-masing sebanyak 200 mL. Hasil elusi (fraksi) kemudian ditampung, dan diperoleh fraksi n-heksan, fraksi etil asetat, dan fraksi etanol.
5. Uji Antibakteri Ekstrak Etanol dan Fraksi Daun Pacar Kuku a. Sterilisasi Alat
Sterilisasi alat dilakukan dalam autoclave pada suhu 121oC kurang lebih 15 menit.
b. Pembuatan media agar miring
Pembuatan media agar miring, dilakukan dengan melarutkan 2,06 gram Mac Conkey (untuk E.coli) dan 4,32 gram MSA (untuk S. Aureus) ke dalam 40 mL akuades, distirer sampai homogen, disterilkan dalam autoclave pada suhu 121 °C selama 20 menit, lalu dimasukkan dalam beberapa tabung reaksi masing-masing 5mL. Tabung reaksi ditutup dengan kapas dan alumunium foil, ditempatkan pada posisi miring, didiamkan hingga padat pada suhu kamar.
c. Pembuatan biakan bakteri
Biakan bakteri dibuat dengan menempelkan sebanyak 1 ose isolate bakteri pada media bakteri dengan pola zig-zag, masing-masing bakteri dibuat 3 atau 4 biakan bakteri. Tahap ini dilakukan pada keadaan steril di ruang isolasi pada sinar UV dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam.
d. Uji aktivitas antibakteri
Untuk uji antibakteri ekstrak etanol fraksi daun pacar kuku,sebanyak 2,575 gr Mac Concey (untuk E.coli) dan 5,4 gr MSA (untuk S. Aureus) dilarutkan ke dalam 50 mL akuades,distirer sampai homogen, disterilkan dalam autoclave pada
commit to user
suhu 121 °C selama 20 menit. Akuades steril disiapkan untuk membuat suspensi bakteri, yaitu dengan memasukkan 3 mL akuades ke dalam tabung reaksi, tutup rapat dengan kapas (1 tabung, 1 bakteri). Sebanyak 1 ose masing-masing bakteri diambil untuk membuat suspensi bakteri, dimasukkan dalam akuades steril, diaduk sampai keruh.Sebanyak 100 mikro liter suspensi bakteri diambil dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril.Sebanyak 15 mL media bakteri steril dimasukkan pula kedalamnya, pada suhu yang tidak terlalu panas dan tidak terlalu dingin (suhu tubuh), cawan petri digoyang, sehingga larutan tercampur rata.
Larutan didiamkan sampai memadat, kira-kira 15 menit. Lalu dibuat sumuran dengan ukuran 6 mm dengan alat pervorator dan spatula. Sumuran diisi dengan 20 mikro liter sampel atau bahan yang diujikan,yaitu ekstrak etanol yang dilarutkan dalam DMSO dengan konsentrasi 100%, 75%, 50%, dan 25 % serta fraksi-fraksi hasil KVC. Sumuran dibungkus kertas, diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37oC.Hambatan pertumbuhan bakteri dapat diketahui dengan mengukur diameter zona bening di sekitar sumuran, yang merupakan diameter zona hambat bakteri.
Kontrol negatif juga dilakukan terhadap pelarut DMSO.
6. Pengujian Golongan Senyawa Fraksi Teraktif
Pengujian golongan senyawa atau skrining fitokimia dapat dilakukan dengan Uji KLT menggunakan plat silika gel F254. Sampel ditotolkan pada plat kemudian dielusi dengan larutan pengembang, lalu disemprot dengan reagen spesifik. Bercak diamati pada cahaya tampak, UV254 nm, dan UV365 nm. Uji KLT dilakukan terhadap fraksi teraktif antibakteri. Berikut adalah pengujian KLT berdasarkan metode Wagner (1983) dan Harborne (1996).
a. Flavonoid
Larutan pengembang yang digunakan adalah etil asetat : asam formiat: asam asetat : air (100: 11: 11: 27) lalu disemprot dengan reagen amonia atau AlCl3 1%
dalam etanol 95 %, kemudian diamati pada UV254 nm, dan UV365 nm. Flavonoid memberikan warna biru tua pada UV254 nm, warna kuning, biru, atau hijau pada UV365 nm.
commit to user
b. Alkaloid
Larutan pengembang yang digunakan adalah toluen: etil asetat: dietil amin (7:2:1). Plat disemprot dengan reagen Dragendorf, lalu diamati pada cahaya tampak, UV254 nm, dan UV365 nm. Alkaloid memberikan warna coklat di bawah sinar tampak dan pada UV365 nm memberikan warna flouresen kuning atau biru.
c. Terpenoid dan Steroid
Larutan pengembang yang digunakan adalah heksana : etil asetat (95 : 5).
Plat dikeringkan, kemudian disemprot dengan SbCl3 dalam kloroform untuk steroid dan Lieberman Burchard untuk terpenoid, selanjutnya diamati pada sinar tampak, UV254 nm, dan UV365 nm. Terpenoid dan steroid memberikan warna ungu di bawah cahaya tampak dan UV254 nm.
d. Antrakuinon
Larutan pengembang yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air (100 : 13,5 :10). Plat dikeringkan, kemudian disemprot dengan pereaksi KOH etanolik 5%, kemudian diamati pada cahaya tampak, UV254 nm, dan UV365 nm.
Antrakuinon akan memberikan warna kuning pada cahaya tampak, dan flouresen kuning pada UV365 nm.
e. Tanin (polifenolik)
Larutan pengembang yang digunakan adalah etil asetat : metanol : air (100 : 13,5 : 10). Deteksi menggunakan reagen penyemprot FeCl3 1%, kemudian diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm.
f. Asam Lemak
Uji terhadap asam lemak menggunakan larutan pengembang benzene : dietil eter (95 : 5). Plat dikeringkan, dideteksi dengan reagen penyemprot 0,5 % rodamin B dalam etanol, lalu diamati pada cahaya tampak, UV254 nm, dan UV 365 nm. Asam lemak memberikan warna ungu di bawah UV 254 nm dan UV 365
nm.
commit to user
g. Saponin
Uji terhadap saponin menggunakan larutan pengembang kloroform : metanol : air (64 : 50 : 10). Plat dikeringkan kemudian disemprot dengan SbCl3
dalam kloroform, lalu diamati pada cahaya tampak, UV 254 nm, dan UV 365 nm.
Saponin memberikan warna merah violet pada cahaya tampak dan biru atau hijau di bawah UV 365 nm.
7. Kromatografi Gas-Spektrometer Massa (GC-MS)
Uji GC-MS dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa antibakteri dalam fraksi teraktif antibakteri daun pacar kuku (Lawsonia inermis Linn.). Spesifikasi alat GC-MS adalah sebagai berikut
jenis kolom :AGILENTJ%W DB-1 panjang kolom : 30 meter
diameter kolom : 0,25 mm gas pembawa : Helium
jenis pengionan : EI (Electron Impact) suhu kolom : 70 °C
Suhu injektor : 310 °C
E. Teknik Pengumpulan dan Analisis Data
Fraksi yang teraktif antibakteri diketahui dari uji aktivitas antibakteri berdasarkan data diameter daerah hambat. Fraksi tersebut kemudian dilakukan uji banding dengan antibiotik tetrasiklin HCl, selanjutnya dilakukan skrining fitokimia melalui uji KLT. Informasi mengenai senyawa antibakteri dalam fraksi teraktif ekstrak etanol daun pacar kuku (Lawsonia inermiss Linn.) diperoleh dari data kromatogram GC-MS yaitu dengan membandingkannya dengan data library yang ada. Data-data diameter daerah hambat dari variasi konsentrasi hasil pengujian aktivitas antibakteri fraksi-fraksi daun pacar kukudianalisis dengan metode T-Test sehingga menghasilkan informasi ada tidaknya perbedaan aktivitas antibakteri fraksi-fraksi yang diujikan.
