METODE PEMBUATAN PREPARAT KHUSUS

1

METODE PEMBUATAN

PREPARAT KHUSUS

Sediaan sementara/non permanen  supravital Sediaan permanen

Utuh/wholemount Irisan

Metode beku Metode seloidin Metode parafin

Metode seloidin-parafin

Rentang/spread Apus/oles/smear Gosok  tulang

MACAM-MACAM SEDIAAN/PREPARAT

Metode beku

Utk mengamati sel hidup

Harus segera diamati/tdk bisa tahan lama

Menggunakan zat warna non toksik dgn pelarut yang non toksik pula (akuades)

 Neutral red 1%

 Janus green 0,25%

 Metilen blue 0,25%

Hasil: sel hidup transparan, sel mati menyerap warna

Aplikasi: pengamatan viabilitas sel

Metode Supravital

5

Spermatozoa Sel mukosa mulut

mati hidup

Bahan: jaringan tipis (jaringan pengikat)

Pleura

Mesenterium Peritonium Pericardium

Jaringan subcutan

Tahapan:

1. Pengambilan jaringan 2. Spreading

3. Fiksasi:

Metil alkohol (3-5’) Formol calsium (30’)

4. Staining:

Mallory-Acid Fuchsin Mallory Azan

Hematoxylin Azure II-Eosin

Metode Rentang ( Spread )

Mesenterium

Spread Stains Spread Stains

Mallory-Acid Fuchsin &

Mallory Azan  serabut2 jaringan pengikat, fibroblas, makrofag, & sel2 jar pengikat yang lain

Hematoxylin Azure II-

Eosin  sel Mast pd

mesenterium

9

Cara: membuat olesan/selaput tipis (film) di atas gelas benda

Bahan: substansi cair (darah, eksudat jaringan yang meradang, cairan sperma)

Tahapan:

1. Pembuatan selaput/film tipis 2. Fiksasi

3. Staining

4. Mounting (additional)  clarite, permount, canada balsam

Aplikasi: pengamatan sitologi darah, pemeriksaan kualitas spermatozoa (morfologi)

Metode Apus/Oles ( Smear )



 

Smear Fixation Smear Fixation

1. Setelah film kering  fiksatif cairan

Metil alkohol Alkohol absolut Alkohol eter

2. Sebelum film kering  fiksatif gas (osmic acid 2%)

Lama fiksasi:

Tipis: 3-4’

Tebal: 5-10’

13

Smear Stains Smear Stains

Anilin basa Gram

Acid fast

Giemsa 3% (pewarnaan Romanowsky)

Eosin-metilen blue

(pewarnaan May Grunwald)

 proses fiksasi &

pewarnaan dilakukan bersama2

Kombinasi Giemsa 3% &

eosin-metilen blue

(pewarnaan Pappenheim)

JENIS SEL DARAH WARNA METODE PEWARNAAN

Eritrosit Merah muda

Merah muda

Merah muda keunguan

Romanowsky May Grunwald Pappenheim Leukosit (nukleus) Ungu kebiru-biruan

Biru muda Ungu tua

Romanowsky May Grunwald Pappenheim Leukosit (sitoplasma) Sangat ungu muda

Biru muda

Romanowsky Pappenheim Leukosit eosinofil (granula) Ungu tua

Merah menyala Merah menyala

Romanowsky May Grunwald Pappenheim Leukosit basofil (granula) Ungu muda

Biru keungu-unguan Ungu

Romanowsky May Grunwald Pappenheim

Leukosit netrofil (granula) Ungu muda Romanowsky, May Grunwald,

15

Aplikasi Metode Smear Aplikasi Metode Smear

Pap smear  epitel vagina/cervix

Zat warna: Papanicolaou (cresyl violet 1%)

Kromosom dr leukosit medulla osseum (sumsum tulang) femur/tibiotarsus

1. Injeksi intramuscular kolkisin 0,5%

2. 1,5-2 jam kmd hwn dibunuh, diambil tulang femur/tibiotarsus,

3. Tulang diambil sumsumnya, diberi lart hipotonis (buffer fosfat pH 7/lart. Ringer)

4. Sentrifuge 400 rpm, 5’, supernatan dibuang & diganti fiksatif Carnoy (AAG+metanol: 1:3), didiamkan 5’

5. Cara no 4 dilakukan 2x

6. Smear  zat warna Giemsa / asetokarmin

Papanicolaou stain

1. Hematoxyllin Harris 2. Orange G 95%

3. Eosin Y, Light Green SF, Bismark Brown

Staining Interpretation

Nuclei Blue

High Keratin Cells Orange

Superficial Cells Pink

Erythrocytes Dark Pink

Parabasal Cells Blue/Green

Dilakukan utk pembuatan preparat tulang keras  tdk bs diiris Metode sangat mudah dikerjakan  digosok dgn kertas amplas hingga tipis (transparan)

Sel-sel & komponen jar yang lain hilang, hy tinggal bekas2nya saja

Sebelum digosok, sebaiknya tulang direndam terlebih dulu dlm air (maserasi) selama + 2 hari

Metode Gosok

19

Tulang keras bs diiris apabila telah dihilangkan zat kerasnya (zat kapur/kalsium)

Zat penghilang kalsium (agen dekalsifikan) berupa asam:

Asam nitrat 1-5%  plg byk digunakan karena mampu menarik Ca dgn cepat & tdk melemahkan warna

HCl 8%

Asam format 5-10%

Dekalsifikasi dpt dikerjakan bersama dgn proses fiksasi atau sesudah fiksasi

Metode Dekalsifikasi

Fiksatif: lart Bouin, formalin 10%

Dekalsifikasi dilakukan selama 24-48 jam  utk

mempercepat proses dekalsifikasi cairan dekalsifikan hrs diganti2

Utk mengecek kesempurnaan dekalsifikasi dgn ditusuk jarum

Stl dekalsifikasi sempurna agen dekalsifikasn hrs dihilangkan  dpt melemahkan warna

Menghilangkan asam nitrat: merkuri dlm alkohol 70%  dilakukan 2x setiap 6 jam

Menghilangkan asam format: sodium sulfat 5%/ litium sulfat 5% lalu dicuci dgn air mengalir

Clearing: kloroform, toluol

21

Jarang dilakukan dlm mikroteknik hewan

Dilakukan utk mengamati jaringan yang sel-selnya mudah lepas

– Lien

– Sumsum tulang – Jaringan tumor

– Kelenjar ludah Drosophila utk melihat kromosom  pewarna Carmin

Cara: menekan gelas penutup (jar ada di bwh gelas penutup) dgn ibu jari

Metode Pencet ( Squash )

Utk mengamati/mempelajari keseluruhan bagian tubuh → tanpa pengirisan

Biasanya utk spesimen yang berukuran kecil/msh dlm tahap perkembangan (embrio)

Tidak perlu diiris (sectioning) Aplikasi:

– Pengamatan organogenesis embrio ayam (< 96 jam) – Membedakan jenis tulang rawan & sejati (pengamatan

Metode Wholemount

23

Pengambilan blastoderm embrio 1. Fiksasi  Lart. Bouin

2. Washing  alkohol 70%

3. Dehidrasi  alkohol bertingkat (70-100%) 4. Clearing  xilol/toluol 5. Staining  zat warna

tunggal

6. Mounting  canada balsem/enthelan

yolk

blastoderm albumen

Digunakan utk pengamatan proses osifikasi (membedakan jar. cartilago & osseum)

Tahapan:

1. Fixation  alkohol 96%

2. Evisceration

3. Removing fat  aceton

4. Staining  alizarin red, alcian blue 5. Washing

6. Clearing  KOH

7. Mounting  glyserin 100%

Hasil:

Ossified skeleton: purple-red

Wholemount Fetus Mammalia

27

Sekian