Laporan Praktikum Sitohistoteknologi
Pembuatan Preparat Histologi Dengan Teknik Sayatan
Disusun Oleh :
Nama : Larasati Kirana Putri Kelas : 6 A
NIM : 1804034059
D IV ANALIS KESEHATAN FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF.DR.HAMKA JAKARTA
2021
BAB I
PENDAHULUAN
A. Definisi Histologi
Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu kata, histos dan logos. Histos berarti jaringan dan logos adalah ilmu. Jadi Histologi adalah salah satu cabang dari ilmu Biologi yang membahas tentang jaringan
(Bevelander dan Ramaley 1988). Jaringan itu sendiri adalah sekumpulan sel yang sama bentuk dan fungsinya. Untuk memahami histologi,
sebelumnya seorang mahasiswa harus memahami terlebih dahulu ilmu anatomi tubuh manusia khususnya, kemudian sistem organ yang
mendukung suatu organisme itu serta organ apa saja yang terlibat di dalam suatu sistem organ tersebut. Ilmu ini berkembang seiring dengan berkembangnya ilmu fisika optik khususnya penemuan mikroskop dan ilmu teknik pewarnaan (histokimia) dan teknik pembuatan preparat dari organ dan jaringan hewan, sehingga kita dapat melihat jaringan yang menyusun dari satu organ baik dalam keadaan normal maupun patologis. Histologi juga membantu menegakkan diagnosa untuk suatu penyakit dengan melihat parameter histologinya, dengan cara biopsi jaringan dan kemudian membuat preparasi jaringannya. Spektrum biologi dimulai dari tingkat Biomolekul yang menyatakan bahwa makhluk hidup disusun atas 4 biomolekul yaitu karbohidrat, lipid, protein dan 2 jenis asam nukleat yaitu Deoksiribosa Nucleic Acid (DNA) dan Ribosa Nucleic Acid
(RNA). Makna dari pernyataan bahwa makhluk hidup itu disusun oleh 4 biomolekul artinya makhluk hiodup itu mutlak mempunyai 4 biomolekul ini dan asam nukleatnya harus ada kedua duanya (DNA dan RNA). Virus tidak dikatakan makhluk hidup karena hanya memiliki hanya 2
biomolekul saja yaitu protein dan asam nukleat yang hanya salah satunya saja, yaitu DNA saja atau RNA saja. Dengan kata lain lain virus
dikatakan sebagai jasad non sellular (Yuwono 2008) atau ada juga yang menyatakan virus sebagai partikel non sel (Champhel dkk. 1999). Tingkat berikutnya adalah Sel didefinisikan sebagai unit strukturil dan fungsionil yang hidup. Satu sel sudah dikatakan hidup, karena secara struktural terdisi atas inti sel yang mengendalikan semua aktifitas sel yang dilakukan oleh organela yang terdapat di dalam sitoplasma. Setiap
organela melakukan aktivitas atau fungsinya sesuai perintah dari inti sel yang dikendalikan oleh DNA atau gen dan kekerja secara bersama-sama (sinergis), sehingga satu sel dapat melakukan aktivitas hidup. Sel
melakukan pertukaran zat, ada zat yang masuk sebagai input kemudian dimetabolism menjadi suatu produk (output) dan juga produk sisa yang harus dibuang dengan tujuan mempertahankan kondisi keseimbangan internal sel atau homeostasis. Sel melakukan reproduksi, dengan cara mewariskan sifat yang dibawa oleh seperangkat gen dengan tujuan mempertahankan generasinya, dan lain lain. Tingkat berikutnya adalah Jaringan, yang didefinisikan sebagai sekumpulan sel yang sama bentuk dan fungsinya. Artinya satu jaringan berarti hanya disusun oleh satu tipe sel saja dan fungsinya juga pasti sama pula. Tingkat berikutnya adalah Organ, yang merupakan kumpulan dari beberapa macam jaringan.
Misalnya satu organ pankreas yang merupakan satu organ yang termasuk dalam sistem endokrin, terdiri dari 3 macam jaringan, yaitu : 1. Jaringan yang disusun oleh sel α pankreas mensekresikan hormon glukagon,
berfungsi dalam konversi glikogen menjadi glukosa (meningkatkan kadar glukosa) 2. Jaringan yang disusun oleh β pankreas mensekresikan
hormon insulin, berfungsi dalam konvesri glukosa menjadi glikogen (menurunkan kadar glukosa) 3. Jaringan yang disusun oleh γ pankreas mensekresikan hormon somastatin, berfungsi sebagai penyeimbang dari aktivitas hormon glukagon dan insulin.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
a. TEKNIK PEMBUATAN PREPARAT
Teknik pembuatan preaparat kususnya untuk jaringan hewan dan manusia ada 2 macam, yaitu teknik pembuatan preaparat dengan sayatan dan teknik pembuatan preparat tanpa teknik sayatan. Pembuatan preparat tanpa tehnik sayatan antara lain, yaitu preparat ulas dan preparat rentang, preaparat supravital, preparat utuh dan preparat urai.
1. Pembuatan Preparat Histologi dengan teknik sayatan. Pembuatan preparat histologi dengan tehnik sayatan adalah suatu cara membuat preparat
histologi menggunakan embedding dalam parafin dan mikrotom putar untuk menyayat. Adapaun tahapan atau persiapan yang herus dilakukan untuk membuat preparat histologi dengan teknik sayatan adalah sebagai berikut :
Menyiapkan hewan percobaan untuk dibius. Sebelum melakukan pembiusan terhadap hewan percobaan, terlebih dahulu yang harus dipersiapkan adalah : Menyediakan kapas yang sudah dibasahi dengan eter sebagai bahan (agen) pembius hewan percobaan. Pengganti eter adalah ketamin.
a. Memasukkan kapas yang sudah dibasahi dengan eter dalam wadah pembiusan.
b. Memasukan hewan percobaan ke dalam wadah pembiusan. c. Menutup wadah, lalu hewan percobaan yang ada didalam wadah diamati hingga terlihat lemas dan tertidur.
2. Pengambilan Organ / Jaringan Organ ataupun jaringan yang diambil disesuaikan dengan kebutuhan dalam pengamatan.
a. Sediakan baki bedah (biasa digunakan adalah sterofoam) b. Sediakan jarum pentul
Cara nya :
Hewan yang sudah tertidur pulas di terlentangkan di atas baki sterofoam tadi.
Kaki kakinya ditusuk dengan jarum pentul
Lalu ambil pisau bedah di dalam kotak seperangkat alat bedah Biasa dengan gunting juga, lalu ada pinset nya juga
Lalu diangkat kulitnya dengan pinset
Lalu pelan-pelan digunting dengan pisau bedah
Yang terangkat pertama adalah kulit dan jaringan ikatnya Lalu dibawahnya ada otot, lalu bisep ototnya dibedah
Sehingga terlihat organ-organ dalam yang terdapat didalam tubuh hewan tersebut.
Setelah diambil organnya,misal yang diambil adalah hati. Itu keliatan pasti berdarah darah.
Dicuci hingga bersih dengan menggunakan garam fisiologis (NaCl 0,9%).
3. Pencucian
Pencucian organ dilakukan dengan cara memasukkan organ yang diinginkan ke dalam larutan garam fisiologis (NaCl 0,9%)
Cara pembuatan garam fisiologis (NaCl) pure - Diambil NaCl 0,9 gram
- Ditambahkan aquadest didalam gelas ukur sebanyak 100 mL 4. Fiksasi
Fiksasi adalah suatu usaha untuk mempertahankan elemen –
elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Fiksasi berfungsi untuk
mempertahankan bentuk jaringan sedemikian rupa sehingga perubahan bentuk / struktur sel jaringan yang terjadi hanya sekecil mungkin, menembus jaringan dengan cepat, bersifat mordent (mengikat) dan membantu indeks refraksi. Untuk dapat melakukan hal tersebut suatu larutan fiksasi harus dapat :
o Menghentikan proses enzimatik sel tubuh secepatnya untuk mencegah autolisis. Autolisis adalah pengerusakan sel sendiri sesudah terjadi kematian sel dan disebabkan oleh kerja enzim yang terdapat di dalam sel itu sendiri. Autolisis ini dapat dihambatdengan mendinginkan jaringan dalam ternperatur di bawah 0°C atau dalam udara panas lebih dari 57°C, namun dalam suhu kamar akan dipercepat. Selain autolisis,
kerusakan jaringan dapat terjadi akibat bakteri, baik disebabkan oleh bakteri yang ada (septikemi) ataupun bakteri komensial.
o Mengkoagulasi protein jaringan sehingga menjadikan sel insoluble yang mencegah masuk atau keluarnya zat-zat dalam sel.
o Membuat jaringan mudah diwarnai. Jaringan harus dimasukkan ke dalam larutan fiksasi secepat mungkin setelah diambil dari organ. Jika organ tersebut mudah membusuk misalnya otak, hati, paru, usus dan organ dalam lainnya, jangan ditunggu sampai operasi selesai. Daya penetrasi larutan fiksasi juga terbatas. Banyaknya larutan fiksasi minimal jaringan dapat berenang di dalamnya dan yang ideal jumlah larutan 10 x besar jaringan.
Berikut adalah jenis-jenis larutan fiksasi yang biasa digunakan dalam pemeriksaan suatu jaringan adalah :
a. Formaldehid :
Formaldehid adalah suatu gas yang larut dalam air. Larutan ini bersifat asam dan tersedia dalam bentuk formaldehid 40% atau formalin, namun dengan konsentrasi ini tidak dapat dipakai untuk fiksasi karena terlalu cepat mengeraskan jaringan. Sebagai larutan fiksasi harus dicampurkan dalam air biasa atau larutan garam
fisiologis, dengan perbandingan 1 bagian formalin dengan 9 bagian pelarut menjadi formal saline 10% atau lebih dikenal dengan
formalin 10%. Untuk penyimpanan dalam jumlah besar dan waktu yang lama maka formaline 10% harus diberi garam buffer atau magnesium atau kalsiumkarbonat supaya tidak terjadi pembentukan endapan asam formik. Formalin mempunyai bau yang tidak enak dan dapat mengiritasim kulit, selaput lendir dan mata. Oleh karena itu dianjurkan memakai sarung tangan dengan udara terbuka waktu kita sedang mengelola materi berformalin.
b. Alkohol :
Alkohol Merupakan larutan dengan daya dehidrasi yang kuat dan menyebabkan pengerasan dan pengerutan jaringan. Alkohol dapat mengkoagulasi protein dan presipitasi glukogen dan melarutkan lemak. Fungsi alkohol yang utama adalah sebagai bahan fiksasi sediaan sitologi namun dalam keadaan terpaksa dapat digunakan
sebagai fiksasi sediaan histopatologi. Hal ini disebabkan daya
tembus alkohol yang kurang baik oleh karena jaringan cepat menjadi keras dan mengkerut sehingga sediaan sukar dipulas. Dua jenis alkohol paling sederhana adalah methanol dan etanol.
c. Larutan Bouin
Organ yang telah dicuci dengan larutan garam fisiologis, dimasukkan ke dalam larutan Boiun (maksimal 24 jam) dengan volume sekurang-kurangnya 10x volume jaringan yang akan difiksasi. Komposisi larutan Bouin :
- Larutan asam pikrat jenuh 75 ml - Formalin (Formaldehid 40%) 20 ml
– Asam Asetat Glasial 5 ml (ditambahkan pada saat digunakan). Larutan stok asam pikrat jenuh : dibuat dengan cara melarutkan 1 gr serbuk asam pikrat dalam etanol 95% 100 ml
d. Neutral Buffered Formalin Komposisi : - Formalin 10 ml
- Acid Sodium Phosphate monohydrate 0,40 gr - Anhydrous disodium phosphate 0,65 gr
- Ad akuades 100 ml
Rumus yang digunakan untuk memonitor fiksasi baik atau buruk diuji dengan rumus: d = k √t
Keterangan
d = ketebalan jaringan (mm)
t = waktu yang dibutuhkan/tersedia
k = ketetapan daya fiksir dari atas dan bawah (2 X ketetapan masing-masing fiksasi)
Ketetapan fiksasi formalin 10% = 0.78
5. Dehidrasi Dehidrasi bertujuan untuk penarikan molekul air dalam jaringan. Proses ini sangat penting terutama untuk jaringan – jaringan yang akan dibuat preparat irisan. Biasanya proses dehidrasi dilakukan setelah proses fiksasi selesai. Cara melakukan dehidrasi : Proses dehidrasi
dijalankan secara perlahan-lahan menggunakan alkohol bertingkat , dimulai dengan alkohol persentase rendah sampai dengan alkohol absolute. Dimulai dengan alkohol 70 %, 80 %, 95 %, alkohol absolute ( selama 30 menit). Waktu yang dipergunakan untuk setiap tingkat alkohol tergantung dari besar kecilnya jaringan . Alkohol absolute mempunyai kemampuan memperkeras jaringan. Sebagai ancar-ancar jaringan jangan ditinggalkan didalam alkohol tersebut lebih dari 1 atau 2 jam untuk jaringan berukuran biasa ( tebal 2-4 mm).
6. Penjernihan (Clearing)
Penjernihan adalah suatu proses yang dilakukan setelah tahapan dehidrasi yang berfungsi untuk membuat jaringan menjadi jernih dan transparan. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau
mentranparankan jaringan agar dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya dan juga sebagai perantara masuknya jaringan kedalam paraffin. Zat yang sering dipakai Xylol, tapi bisa juga dipakai : benzol, benzene, toluol dan lain-lain.. Untuk jaringan otak dan limfonoid lebih baik menggunakan koloform. Waktu yang digunakan untuk proses penjernihan tergantung pada ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan. Penjernihan biasanya dilakukan secara bertahap. Setelah jaringan selesai didehidrasi di dalam alkohol absolut, selanjutnya organ dimasukkan ke dalam larutan
campuran alkohol absolut : xilol (1 ; 1) selama 30 menit, lalu dilanjutkan di dalam xilol selama 30 menit.
7. Embedding
Embeding (Penanaman) adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan
menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Tujuan tahap embeding ini adalah untuk mengisi jaringan dengan parafin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.
Cara melakukan embedding : Dilakukan dengan merendam organ di dalam inkubator dengan suhu tetap (60°C) dalam parafin cair yang diisikan pada botol film. Organ kemudian diletakkan dalam botol film
berisi parafin cair sebanyak 2 kali pengulangan, masing-masing selama 2 jam.
8. Penyayatan (Sectioning)
Pencetakan dilakukan dengan cara merendamkan organ dalam cetakan blok parafin, setelah mengering lalu dipotong ( pemotongan blok parafin menggunakan pisau yang telah di panaskan di atas api, dengan tujuan agar parafin tidak rusak) sesuai sedemikian rupa berbentuk persegi dan di lekatkan pada sebuah balok kayu yang berukuran kecil, blok
tersebut di beri label dan siap di sayat menggunakan mikrotom. Merendam organ dalam cetakan blok parafin,lalu blok tersebut diberi label dan siap di sayat menggunakan rotary microtom. Tebal sayatan yang umum berkisar 6 – 15 mikron ( 1 mikron = 0,001 mm ).
Cara melakukan pemotongan :
a. Sebelum dilakukan pemotongan, blok jaringan dimasukan kedalam plastik yang diisi air dan letakkan di freezer ±15 menit atau diberi batu es.
b. Blok dijepit pada mikrotom kemudian dipotong dengan pisau mikrotom. Kemiringan : ±300 , Tebal blok paraffin ± 2-5mikron. c. Hasil pemotongan (berupa pita/irisan tipis yang saling bersambung) dimasukkan kedalam waterbath yang diisi air yang sudah dihangatkan 500 C, kemudian diambil dengan kaca objek (Meletakkan potongan di waterbath tidak boleh terbalik).
Macam – macam bentuk pemotongan jaringan :
a. Longitudinal Section / LS atau memotong vertikal dari atas ke bawah b. Transversal Section / XS atau memotong horizontal dari kanan ke kiri c. Miring
9. Penempelan dan Afiksasi (Affixing) (Dasumiati 2008) :
Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan
penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek. Media pelekat yang umumnya digunakan adalah Mayers albumin yang formulanya adalah sebagai berikut :
Putih telur sebanyak 5o bagian
Kristal Tymol beberapa butir
Akuades beberapa tetes
10. Pewarnaan (Staining)
Umumnya dalam pewarnaan histopatologi digunakan cat Hematoxylin-Eosin (HE) disamping cat khusus (PAS, gomori, ZN,
Malory, dll) dan cat yang lebih khusus yaitu immunohistokimia (ER, PR, CD20, LMP, dll).
Pewarnaan yang digunakan adalah Haematoksilin eosin (HE). Pewarnaan dilakukan di dalam staining jar dengan seri larutan sebagai berikut:
a. Deparafinisasi
b. Preparat masuk ke Xylol I, II, dan III masing-masing 3
menit.Setelah itu dikeringkan pinggir jaringan dengan kain kasa. c. Rehidrasi Preparat masuk ke alkohol 100%, 95%, 80%, 70%
masing-masing 2 menit
d. Preparat masuk ke air mengalir 3 menit (air mengalir ditampung dalam wadah ). Sebelumnya dicelupkan ke dalam dua mangkok air 3 celup
e. Pengecatan Inti 7 menit. Preparat masuk ke dalam Meyer Hematoksilin
f. Preparat masuk ke air mengalir 3 menit (air mengali ditampung dalam wadah ). Sebelumnya dicelupkan ke dalam dua mangkok air 3 celup.
g. Counter Stain . Preparat dimasuk ke larutan Eosin 7 celup h. Preparat Masuk ke air wadah I, II, dan III 3 celup
i. Dehidrasi Preparat masuk ke dalam alkohol 70 %, 80%, 95%,100% 3 celup Setelah itu dikeringkan dengan kain kasa sekitar jaringan dan tunggu sampai kering
j. Clearing Preparat masuk Ke Xylol I, dan II masing-masing 2 menit.
11. Mounting
Yaitu penutupan kaca objek setelah ditetesi Entellan atau Canada Balsam tujuan Memberi warna cerah dan sebagai pelindung dan
BAB III PROSEDUR
A. Alat dan Bahan : Alat :
- Alat untuk pemotongan/pengambilan organ (seperangkat alat bedah).
- Alat untuk infiltrasi paraffin (oven, beaker glass dan pinset). - Alat untuk embedding (pinset, kotak kotak kecil 1,5 x 1,5 cm). - Alat untuk sectioning (mikrotom dan kuas). - Alat untuk affixing (objek glass, pipet tetes dan hot plate).
- Alat untuk staining/pewarnaan (staining jar, kertas label dan tissue). - Alat untuk mounting (cover glass). - Alat untuk pengamatan
(mikroskop). Bahan :
- Organ hewan seperti usus, jantung, paru-paru, ginjal, lambung, ovarium, tertis, hati, dan uterus.
- Kloroform atau eter.
- NaCl 0,9% / fisiologis atau larutan ringer.
- FAA (Formalin Alkohol Acetid Acid) atau formalin 10%.
- Alkohol 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 96% dan 100%. - Meyer albumin (Albumin dan Glyserin).
- Larutan Xylol. - Parafin.
- Pewarna Eosin. - Pewarna Hematoxilin. - Canada Balsam.
B. Cara Kerja Metode : Parafin
1. Narkosis : Hawan dibius dengan kloroform atau eter, bedah dan ambil organ yang diperlukan.
2. Washing (Pencucian) : Masing-masing organ tersebut dicuci dengan larutan NaCl 0,9% fisiologis selama 30 menit.
3. Fiksasi : Masing-masing organ dimasukkan ke dalam botol-botol film, kemudian difiksasi dengan larutan FAA atau formalin 10% selama 3 jam.
4. Dehidrasi : Masing-masing organ tersebut dimasukkan ke dalam alcohol bertingkat yakni 30%, 50%, 70%, 80%, 90% dan 96% masing-masing selama 30 menit.
5. Clearing (Penjernihan) : Organ dimasukkan ke dalam xylol selama ±45 menit hingga kelihatan transparan.
6. Infiltrasi : Menyusupkan media penanaman ke dalam jaringan. Media penanaman disimpan di dalam oven bersuhu 58˚C. Langkah pada infiltrasi adalah :
a. Xylol : Parafin (3:1) selama 15 menit. b. Xylol : Parafin (1:1) selama 15 menit. c. Xylol : Parafin (1:3) selama 15 menit.
7. Embedding (Penanaman) : Disiapkan kotak-kotak kecil
(1,5x1,5cm), dimasukkan masing-masing organ ke dalam kotak-kotak kecil paraffin yang telah disediakan, kemudian dimasukkan paraffin cair setelah itu disimpan ke dalam kulkas hingga padat dan siap disayat selama ±15 menit.
8. Sectioning (Penyayatan) : - Blok dipasang pada holder, rapikan sisi atas sejajar dengan sisi bawah. - Holder dipasang pada mikrotom. - Sayat dengan ketebalan ±4-8 m.
9. Affixing (Penempelan) : - Bersihkan gelas benda dengan alcohol 70% agar bebas lemak.
- Teteskan albumin pada gelas benda, gosok rata.
- Beri aquades secukupnya. - Letakkan pita sayatan (coupes) di atas aquades. - Pindahkan gelas benda ke atas hot plate dengan suhu ±50˚C, atur posisi pita organ, biarkan sampai aquades kering. 10. Staining :
- Deparafinasi : Jaringan dimasukkan ke dalam xylol selama 3x2 menit.
- Rehidrasi : Dengan alcohol dari tinggi ke rendah (96%, 80%, 70%, 50%, dan 30% masing-masing beberapa celupan.
- Cuci dengan air mengalir, setelah itu celupkan ke dalam aquades salama 5-10 menit.
- Warnai dengan hematoxilin (15 detik), kemudian cuci dengan air mengalir. Cek di bawah mikroskop. - Warnai lagi dengan eosin
selama 15 menit, cuci lagi dengan air mengalir. Kemudian cek di bawah mikroskop.
- Dehidrasi : Dengan alcohol bertingkat 70%, 80%, 90%, dan 96% (3x beberapa menit).
- Clearing : Dengan xylol selama 3x beberapa menit.
11. Mounting : Tutup dengan Canada Balsam dan gelas penutup, hindari terbentuk gelembung udara.
12. Labelling
SOAL:
a. Jika dibutuhkan larutan garam fisiologis 0,9% ssbanyak 1000 mL, berapa gr NaCl yg ditimbang?
b. Jika ingin membuat asam pijrat jenuk sebanyak 500 mL, berspa gr asam pijrst yg ditimbang dan berapa byk etanol 95% yg dibutuhkan c. Jika formalin 40%, diambil 10 mL, lalu ditambahkan akuades sampai 100 mL. Jadi berapa konsentrasi formalin itu sekarang? Jawaban soal !
A) 0,9% Nacl = masa Nacl x 100% 1000
Masa Nacl = 0,9 x 1000 100 = 9 gram
B) 95% etanol= masa asam pikrat x 100% 500
Masa asam pikrat = 95x 500 100 = 475 gram C) %1 x V1 = %2 x V2 10 x 40% = 100x %2 %2 = 40 x 10 = 4% 100
