LAPORAN PRAKTIKUM SITOHISTO TEKNOLOGI
“PEMBUATAN PREPARAT HISTOLOGI
DENGAN TEKNIK SAYATAN”.
DISUSUN OLEH :
Nama
: Anastasia Fatihah Anindya
Kelas
: 5A
Nim
: 1804034075
PRODI D-4 ANALIS KESEHATAN
FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF DR HAMKA
JAKARTA
BAB I
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Mikroteknik adalah ilmu yang mempelajari tentang pembuatan preparat.Dalam setiap pembuatan preparat pada umumnya selalu dilakukan fiksasi terlebih dahulu.
Sedangkan fiksasi itu sendiri adalah suatu cara atau proses (metode) yang bertujuan untuk mematikan sel tanpa mengubah fungsi dan struktur di dalam selitu sendiri. Jika telah dilakukan fiksasi maka preparat yang dibuat akan menjadilebih awet dan tahan lama (Billi, 2008).
Dehidrasi adalah suatu cara atau proses (metode) pengurangan atau penghilangan air dari dalam sel. Penjernihan adalah suatu cara atau proses(metode) yang digunakan untuk menghilangkan warna asli suatu preparat supaya ketika pemberian warna yang baru menjadi lebih sempurna daripada warna aslinya.
Fungsi dari dehidrasi pada metode pembuatan preparat dengan penyelubungan agar parafin dapat terinfiltrasi dengan sempuna ( Della, 2008). Sediaan adalah benda yang akan diamati strukturnya.
Sifat–sifat dari sediaan ada yang sementara, semi permanen, dan permanen. Sumber sediaanadalah semua organisme atau yang pernah hidup baik itu tumbuhan, hewan,maupun manusia dan hasil pertumbuhannya (bagian atau keseluruhan tubuhorganisme). Garis besar pembuatan sediaan adalah pengambilan dan persiapanmaterial, fiksasi, pencucian, pewarnaan, dehidrasi, penjernihan, penempelan padagelas objek, dan pemberian nama.
Beberapa metode dalam pembuatan sediaanantara lain: sediaan utuh (Whole Mount), sediaan apus (Smear), sediaan remas (Squash), sediaan gosok, Maserasi, dan sediaan sayatan tanpa embedding maupundengan embedding (Parafin, seloidin, maupun resin) (Kusuma, 2008).
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Histoteknik merupakan proses membuat sajian histologi dari spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap untuk diamati atau dianalisa. Sediaan histologi dapat berupa irisan datar yang tipis dari jaringan atau organ yang telah difiksasi dan diwarnai di atas object glass.
Tujuan dari pembuatan sajian adalah untuk membuat preparat permanen sehingga dapat dipelajari struktur serta fungsi dari sel dan organisasinya dalam jaringan. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan coba yang mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari pertumbuhan dan perkembangan jaringan atau organ tubuh tertentu (Hammersen, 1990; Leeson dkk., 1996; Jusuf, 2009; Peckham, 2014).
Irisan datar tersebut nantinya akan memperlihatkan bentuk, ukuran dan lapisan yang beragam yang terdiri dari struktur seluler, fibrosa dan tubuler (Eroschenko, 2008).
Rangkaian proses pembuatan sajian histologi dimulai dari pengambilan organ setelah hewan dilakukan eutanasi kemudian organ dimasukan dalam larutan garam fisiologis dan selanjutnya organ dimasukan dalam larutan fiksatif (Suntoro, 1983).
Rangkaian proses pembuatan preparat histologi melalui beberapa tahapan diantaranya persiapan seperti euthanasia, nekropsi, fiksasi, trimming dilanjutkan tahap pemrosesan jaringan seperti dehidrasi, penjernihan, infiltrasi parafin, pengeblokan, pemotongan, pewarnaan, perekatan dan pelabelan (Jusuf, 2009).
Eutanasia adalah tindakan membunuh hewan dengan meminimalkan rasa sakit serta mempermudah kematian hewan yang menderita penyakit berat. Prosedur eutanasi yaitu hewan kehilangan kesadaran dalam waktu cepat, efek fisiologis rendah dan sesuai syarat dan tujuan penelitian. Eutanasia bisa dilakukan dengan cara fisik dan zat anastesi dengan inhalasi serta gas – gas bersifat non anastetik (Isbagio, 1992).
Eutanasi yang dilakukan dengan metode fisik misalnya stunning dan cervical dislocation. Stunning dilakukan dengan memberikan sengatan listrik pada tulang tengkorak pusat dengan tenaga yang cukup besar. Cervical dislocation dilakukan dengan cara memberikan tekanan ke bagian posterior dasar tulang tengkorak dan sumsum tulang belakang sehingga bagian posterior dasar tulang tengkorak dan sum – sum tulang belakang terpisah (Isbagio, 1992).
karbon monoksida (CO) dapat menyebabkan perubahan irreversible pada hemoglobin sel darah merah sehingga terjadi paralisa pada jantung dan pusat respirasi, akibatnya hewan mati antara 3 – 5 menit.
Penggunaan karbon dioksida (CO2) mengakibatkan dilatasi pembuluh otak sehingga kolaps akan terjadi pada waktu 3 – 10 detik pada hewan anjing. Pemberian nitrogen akan menyebabkan paralisa pada pusat pernafasan yang diikuti kolaps hingga akhirnya mati (Isbagio, 1992).
Metode parafin adalah metode pembuatan preparat dengan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan yang tipis. Preparat parafin ini dilakukan karena jaringan merupakan bahan yang lunak. Metode paraffin merupakan metode Irisan /sayatan (Sectioning) yang banyak dan umum digunakan, dengan metode ini hampir semua jaringan dapat dipotong dan jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti. Metode parafin merupakan preparat/ sediaan permanen baik pada tumbuhan ataupun pada hewan. Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya.
Pembuatan preparat jaringan dengan metode parafin melalui beberapa tahapan, sebagai berikut:
1. Pembiusan (Narcose)
Pembiusan (Narcose) merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-kelenjar (endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya. Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah: Eter, biasanya digunakan untuk membius kelinci, tikus, marmut, dan anjing. Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera. Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, Morfin HCl, aseton- CHCl3, methane, klereton, alkohol, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium.
2. Diseksi (Collecting)
Diseksi (Collecting) adalah proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses pencucian (washing).
Pencucian (Washing) jaringan yang diambil pada hewan perlu dilakukan pencucian karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara.
Pencucian (Washing) merupakan tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan, pada pembuatan preparat tumbuhan tidak dilakukan pencucian. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai: NaCl 0.8-0.9%, Larutan Ringer, dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin. Komposisi larutan ringer adalah: (NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas), (NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin). NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15 menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan menyebabkan pembengkakan sel.
Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut: 1). objek yang diambil dalam kondisi sehat,
2). objek yang diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan, 3). menggunakan pisau yang tajam,
4). ukuran jaringan yang diambil kurang lebih 0.5 cm. 5. langsung dicuci dan difiksasi.
4. Fiksasi (Fixation)
Fiksasi (fixation) adalah usaha mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif.
Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi agar jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan. Fiksatif yang sering digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah FAA (Formaldehyde Acetic Acid).
Formula FAA untuk jaringan tumbuhan adalah: Ethil alkohol (50 ml), Asam asetat grasial (5 ml), Formalin (10 ml), Akuades (35 ml). FAA ini juga dapat digunakan untuk jaringan hewan. Formula FAA untuk jaringan hewan adalah: Formalin (10 ml), Alkohol 70% (90 ml), Asam asetat grasial (2 ml).
BAB III
PROSEDUR
a. Alat yang digunakan
1. Gelas ukur 2. Gunting bedah 3. Pinset bedah
4. Wadah untuk hewan 5. Handscoon 6. Baki bedah 7. Tisu 8. Timbangan 9. Kertas 10. Steroform 11. Jarum Pentul
b. Bahan yang digunakan
1. Eter
2. Sampel : Hewan Tikus
4. Larutan fiksasi - alcohol
- formaldehid - larutan bouin
- Neutral Buffered Formalin
c. Tahapan Pembuatan Preparat
• Menyiapkan hewan percobaan
- Disiapkan alat dan bahan
- Disiapkan kapas yang sudah dibasahi dengan menggunakan eter (sbg agen pembius) - Disiapkan hewan percobaan (Tikus).
• Cara membius :
1. disiapkan wadah pembiusan untuk ukuran tikus dengan bobot 200-300 Gram, dengan menggunakan toples.
2. dimasukkan kapas yang sudah dibasahi eter ke dalam wadah 3. dimasukkan tikus ke dalam wadah tersebut kemudian di tutup 4. kemudian tikus akan tertidur.
5. di amati apabila nafas tikus sudah turun naik maka tikus sudah tidur
• Pengambilan organ / Jaringan :
1. disiapkan alat dan bahan
2. disiapkan baki bedah, biasanya digunakan steroform lalu di siapkan jarum pentul
3. hewan yang sudah dibius dan sudah tertidur pulas, di letakkan hewan tersebut di atas baki steroform tersebut, kemudian dalam posisi terlentang (yang dibedah bagian abdomen / perut ) 4. di bagian kaki ditusuk dengan jarum pentul, lalu di ambil pisau bedah/pinset bedah
5. di angkat kulit abdomen dengan menggunakan pinset bedah, lalu secara perlahan di gunting kulit nya dengan menggunakan gunting bedah.
6. kulit jaringan ikat adalah bagian pertama yang tergunting, lalu dibawah nya ada otot, di bagian lapisan otot di bedah kemudian akan terlihat organ organ dalam yang terdapat di dalam hewan tersebut.
7. kemudian di ambil organ nya, misal organ hati, maka akan terlihat berdarah. Organ tsb di cuci terlebih dahulu dengan garam fisiologis (NaCl 0,9%).
• Pembuatan NaCl 0,9% :
1. disiapkan alat dan bahan
2. di ambil sebanyak 0,9 gram NaCl 3. di tambahkan aquadest sampai 100 mL 3. dimasukkan ke dalam gelas ukur.
• Pencucian
1. di siapkan alat dan bahan
2. di ambil salah satu organ dari hewan tersebut
3. organ tersebut di cuci terlebih dahulu dengan menggunakan garam fisiologis atau NaCl 0,9%
4. setelah organ di cuci dengan menggunakan NaCl 0,9%, organ tersebut di keluarkan dari wadah
5. kemudian organ dikeringkan dengan tisu atau kertas. • Fiksasi :
1. disiapkan alat dan bahan
2. di siapkan larutan fiksasi, sehari sebelum pembedahan - larutan NaCl
- larutan fiksasi
a. harus mampu menghentikan proses enzimatik dalam tubuh secepatnya untuk mencegah otolitis (perusakan sel sendiri)
b. mempertahankan sel seperti sel masih hidup walaupun sel nya sudah mati.
- formaldehid
Sebagai larutan fiksasi harus dicampurkan dalam air biasa atau larutan garam fisiologis, dengan perbandingan 1 bagian formalin dengan 9 bagian pelarut menjadi formal saline 10% atau lebih dikenal dengan formalin 10%
Alkohol dapat mengkoagulasi protein dan presipitasi glukogen dan melarutkan lemak. Fungsi alkohol yang utama adalah sebagai bahan fiksasi sediaan sitologi namun dalam keadaan terpaksa dapat digunakan sebagai fiksasi sediaan histopatologi.
- larutan bouin
Organ yang telah dicuci dengan larutan garam fisiologis, dimasukkan ke dalam larutan Boiun (maksimal 24 jam) dengan volume sekurang-kurangnya 10x volume jaringan yang akan difiksasi.
Komposisi larutan Bouin :
- Larutan asam pikrat jenuh 75 ml - Formalin (Formaldehid 40%) 20 ml
- Asam Asetat Glasial 5 ml (ditambahkan pada saat digunakan).
Larutan stok asam pikrat jenuh : dibuat dengan cara melarutkan 1 gr serbuk asam pikrat dalam etanol 95% 100 ml
- Neutral Buffered Formalin
Komposisi : - Formalin 10 ml
- Acid Sodium Phosphate monohydrate 0,40 gr - Anhydrous disodium phosphate 0,65 gr - Ad akuades 100 ml
SOAL DAN JAWABAN
Jawab pertanyaan berikut,
a. Jika dibutuhkan larutan garam fisiologis 0,9% ssbanyak 1000 mL, berapa gr NaCl yg ditimbang?
Jawab :
0,9 x 10 = 9 Gram
Et aquadest 1000 mL (10x100 = 1000)
b. Jika ingin membuat asam pijrat jenuk sebanyak 500 mL, berspa gr asam pikrat yg ditimbang dan berapa banyak etanol 95% yg dibutuhkan ?
Jawab :
Asam pikrat jenuh = 1gram asam pikrat/100mL Etanol 95% 500mL : 100 mL = 5
1gram x 5 = 5gram
c. Jika formalin 40%, diambil 10 mL, lalu ditambahkan akuades sampai 100 mL. Jadi berapa konsentrasi formalin itu sekarang?
Diketahui : V1 = 10 ml V2 = 100 ml %1 = 40% Ditanya : %2 ? Jawab : V1 . %1 = V2. %2 10 . 40% = 100. %2 %2 = 40 . 10 / 100 = 4%
