LAPORAN PRAKTIKUM
SITOHISTO TEKNOLOGI
“ FIKSASI JARINGAN “
Dosen Pembimbing : Dra. Hayati, M.Farm
Disusun oleh : Riski Nabillah Putri
1804034084 VI A
D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA JAKARTA
2020
BAB I PENDAHULUAN
I.1 Latar Belakang
Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu kata, histos dan logos. Histos berarti jaringan dan logos adalah ilmu. Jadi Histologi adalah salah satu cabang dari ilmu Biologi yang membahas tentang jaringan (Bevelander dan Ramaley 1988). Jaringan itu sendiri adalah sekumpulan sel yang sama bentuk dan fungsinya. Untuk memahami histologi, sebelumnya seorang mahasiswa harus memahami terlebih dahulu ilmu anatomi tubuh manusia khususnya, kemudian sistem organ yang mendukung suatu organisme itu serta organ apa saja yang terlibat di dalam suatu sistem organ tersebut. Histologi juga membantu menegakkan diagnosa untuk suatu penyakit dengan melihat parameter histologinya, dengan cara biopsi jaringan dan kemudian membuat preparasi jaringannya.
Mikroteknik merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang. Pembuatan sediaan merupakan suatu hal yang dapat dikatakan mudah, hingga sangat sulit tergantung dari pembagian tubuh yang akan diamati secara mikroskopis. Sediaan yang baik adalah suatu sediaan yang mampu menggambarkan kondisi sel atau jaringan layak ketika sel atau jaringan itu masih di dalam tubuh. Untuk menghindari atau memperkecil kerusakan sel dan jaringan ketika terlepas dai tubuh maka periu dilakukan suatu tindakan yang membuatnya tidak berubah yaitu "fiksasi". Fiksasi merupakan suatu hal yang menjadi salah satu faktor keberhasilan dalam suatu pembuatan sediaan.
I.2 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dilakukan nya praktikum kali ini yaitu :
1. Mahasiswa dapat mengetahui cara pembuatan fiksasi jaringan.
2. Mahasiswa dapat memahami prosesing fiksasi jaringan agar menjadi
preparat yang siap untuk diamati.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Definisi fiksasi mengubah komposisi kimia dan fisik asli dari jaringan. Selain mengubah sifat kimia sel dan jaringan yang digunakan, fiksasi dapat juga menyebabkan perubahan fisik pada komponen seluler dan ekstraseluler, mekanisme kerja dari fiksasi pada dasarnya adalah mengawetkan bentuk sel dan organel sehingga mendekati bentuk ketika masih utuh. Dengan pemberian cairan fiksasi, maka akan mengubah komposisi jaringan secara kimiawi ataupun secara fisik.
Struktur sel dan jaringan ditentukan oleh bentuk dan ukuran makromolekul di dalam dan sekitar sel. Makromolekul utama di dalam sel adalah protein dan asam nukleat, pada hewan vertebrata, makromolekul dipermuksaan luar sel dan diruang ekstraselular adalah glikoprotein dan proteoglika, dimana banyak bahan karbohidrat secara kovalen bergabung dengan molekul protein. Karbohidrat pada sel bersifat hidrofilik, dimana karbohidrat ini akan menyimpan bamyak air diruong ekstraseluler yang di ikat dengan ikatan hidrogen, selain kandungan tersebut, tentu saja tubuh kita ini terbentuk dari komponen beda air.
Fiksasi dapat dianggap sebagai "serangkaian kejadian kimiawi yang kompleks". Pada sel atau jaringan yang akan difiksasi tersusun atas sel dan komponen ekstraseluler, sel dan komponen ekstraseluler terdiri dari elemen peptida dan protein, lipid, dan fosfolipid (membran), karbohidrat dan kompleks karbohidrat, berbagai įenis RNA dan DNA sebagainya. Elemen-elemen ini akan bereaksi selama proses fiksasi dan akan tergantung pada jenis fiksasi yang digunakan, baik itu akan bereaksi secara kimia dengan fiksatif, distabilisasi oleh mekanisme "cross-linking".
II. 2 Tujuan Fiksasi
Tujuan umum dari fiksasi jaringan adalah meniaga komponen sel dan jaringan seperti ketika sel itu masih dalam kondisi hidup, Dalam proses fiksasi dan langkah-langkah selaniutnya dalam pembuatan sediaan jaringan tentu
ada perubahan substansi pada komposisi dan tampilan komponen sel dan jaringan.
Secara teknis fiksasi bertujuan untuk mencegah atau menahan proses degenerafit yang dimulai segera setelah jaringan lepas dari kontrol tubuh dan kehilangan pasokan darahnya. Proses degeneratif ini kadangkala disebut dengan proses penurunan metabolisme atau penghentian metabolisme yang berujung terhadap kematian sel dan penghancuran sel. Selain dari proses degenerafif, kehilangan dan difusi zat terlarut didalam sel harus dihindari semaksimal mungkin dengan mekanisme pengendapan atau koagulasi komponen ini dengan mekanisme "cross linked ". Tahapan fiksasi mempunyai beberapa tuiuan sebagai berikut :
1. Menjaga struktur dan komponen kimiawi 2. Pencegahan kerusakan dan kematian. 3. Mengeraskan sel dan jaringan.
4. Pemadatan.
5. Opticaldiferensiasi 6. Efek pewarnaan. 7. Menempelkan sel.
II.3 Prinsip Fiksasi
Beberapa faktor yang harus dipenuhi oleh suatu proses fiksasi untuk memperoleh efek fiksasi yang baik.
1. Koagulasi
Koagulasi adalah proses pengumpulan partikel koloid didalam sel karena adanya, penambahan bahan kimia, atau pemberian perlakuan fisik seningga partikel-partikel tersebut bersifat netral dan membentuk endapan. Koagulasi pada proses fiksasi dapat terjadi pada protein yang ada didalam sel atau kandungan lainnya yang danggap perlu dipertahankan akibat defrasi yang terus berlangsung, Secara kimiawi, protein didalam sel diubah secara fungsional maupun structural. Pengubahan tersebut dapat dilakukan dengan cara koagulasi dan atau membentuk senyawa adiktif lain.
Pada penggunaan metode koagulasi untuk melakukan teknik fiksasi tidak semua zat dapat atau harus dikoagulasikan, contohnya penggunaan asam asetat sebagai komponen utama larutan fiksasi. Asam asetat dapat mengkoagulasikan kromatin namun tidak untuk protein. Dengan metode ini dapat meningkatkan sensitifitas pengukuran akibat banyaknya paparan sel terhadap antigen. Namun ketika metode koagulasi dikombinasikan maka efek dari fiksasi akan memberikan efek lainya pada sel seperti pengintrolan tekanan osmotik sel, mengontrol kadar keasaman, dan mengembalikan kembali volume sel yang membesar ataupun menyusut akibat pemberian zat lain.
2. Presipitas
Secara umum pengertian dari presipitas adalah endapan yang terjadi akibat koagulasi yang terjadi sebelumnya. Presipitas yang diharapkan ketika proses fiksasi adalah presipitasi protein, yang mana protein inilah yang menjadi salah satu faktor utama pembusukan. Presipitasi protein adalah pengendapan yang terjadi secara intersel akibat penggumpalan yang parsial. Presipitas ini disebabkan oleh berkurangnya tingkat kelarutan protein yang terjadi akibat adanya penambahan senyawa kimia yang berdampak terhadap perubahan senyawa kimia baru.
II. 4 Larutan Fiksasi
1. Formalin
Formalin merupakan nama dagang dari suatu larutan yang mengandung 40%b/v(=40%b/b) formaldehida (yang merupakan gas) didalam air. Sebagian besar formaldehida hadir sebagai polimer larut, yang dipolimerisasi pada suatu larutan. Formalin mengandung sekitar 10% metanol, yang ditambahkan oleh produsen untuk menghambat pembentukan polimer yang lebih tinggi, yang menghasilkan suatu larutan yang biasa disebut dengan paraformaldehida.
Ketika menyimpan formalin di tempat yang dingin, maka akan terdapat endapan bubuk putih. Formaldehid dalam larutan dapat melakukan reaksi dengan sendirinya (reaski cannizzaro) dan berubah menjadi metanol dan asam formiat. Formaldehida itu sendiri adalah senyawa yang bereaksi dengan protein dan ada pada konsentrasi yang sangat rendah yaitu 40% fomaldehida dalam larutan.
Larutan fiksasi yang paling umum digunakan untuk histopatplohi adalah larutan 4% formaldehid yang biasa disebut dengan formalin 10%. Untuk memastikan bahwa penggunaan formalin mencapai pH yang netral maka dilakukan dengan menambahkan garam sehingga disebut dengan netral buffered formalin, atau NBF. Larutan NBF melakukan kerjanya sebagai agen infeksi bukan dengan koagulasi, tetapi dengan menambahkan ke sel-rantai dasar asam amino, terutama lisin, dan ikatan peptida dari atom amida nitrogen.
Untuk ukur jaringan yang kecil (10x10x3mm) ketika difiksasi menggunakan NBF selama 12-24 jam pada umumnya akan menunjukkan kondisi sitoplasma dan inti yang baik dan rinci. Penggunaan formaldehida sebagiam besar akan sempurna terfiksasi dalam waktu 24 jam, tetapi reaksi silang ini akan terus berlanjut selama hingga kurang lebih dua minggu. Untuk spesimen yang lunak seperti otak manusia secara keseluruhan membutuhkan waktu 2-6 minggu ketika difiksasi di NBF hingga menjadi cukup kuat untuk dipotong-potong.
Aspek yang perlu dipertimbangkan adalah suhu, ukuran wadah penyimpanan, rasio volume, konsentrasi garam buffer, pH, dan waktu inkubasi. Fiksasi formalin biasanya dilakukan pada suhu kamar, menggunakan wadah spesimen rendah dan lebar untuk memunggkinkan penetrasi yang optimal dan kemudahan dalam pengambilan spesimen oleh teknisi. Pilihan terbaik untuk rasio volume adalah 1:20 dan dimensi jaringan sebesar 3-4mm. Untuk mencegah
Pembekakan atau penyusunan dari sel-sel maka larutan dibuat isotonik dengan pH 7,2 - 7,4 dianjurkan dan juga untuk mempertahankan ultrastruktur sel serta meminimalkan distorse sel.
2. Larutan Bouin
Pol Andre Bouin (1870-1962) menemukan beberapa campuran fiksatif ditahun-tahun 1895-1900. larutan fiksasi yang sering dikaitkan dengan namanya adalah larutan bouin yang pertama kali dilaporkan pada tahun 1897. Larutan bouin sendiri sendiri berisi 10% formaldehida (25% formalin), asam asetat 0,9 M dan 0,04 M asam pirukat yang dilarutkan didalam air. Asam pikrat menembus jaringan aga lambat, mengentalkan protein dan dapat menyebabkan beberapa penyusutan. Selain penggunaan asam pikrat akan menyebabkan jaringan menjadi berwarnan kuning. pH larutan bouin berkisar 1,5 - 2. Penetralan menggunakan larutan bouin ini lebih cepat dari pada penggunaan NBF. Efek komplementer dari ketiga komponen penyusun larutan bouin ini bekerja baik untuk mempertahankan morfologi sel, spesimen biasanya direndem dalam larutan bouin selama 24 jam.namun ketika penyimpanan terlalu lama didalam campuran ini dapat menyebabkan hidroklisis dan hilangnya DNA dan RNA.
Penggunaan larutan bouin ini sangat cocok ketika sediaan hendak dilakukan pewarnaan menggunakan pewarnaan trichrome. Pewarnaan trichrome menggunakan kombinasi tiga pewarna dengan tambahan asamphospotungstic atau phosphomolibdic sebagai bagian dari peningkatan warna sitoplasma, serta kolagen dan komponen lainnya dari jaringan. Adapun larutan-larutan yang sering digunakan sebagai larutan fiksasi adalah sbb: a. Netral Bufer Formalin 10%
b. Larutan bouin
a) Larutan Bouin
Organ yang telah dicuci dengan larutan garam fisiologis, dimasukkan ke dalam larutan Boiun (maksimal 24 jam) dengan volume sekurang-kurangnya 10x volume jaringan yang akan difiksasi. Komposisi larutan Bouin :
- Larutan asam pikrat jenuh 75 ml - Formalin (Formaldehid 40%) 20 ml
- Asam Asetat Glasial 5 ml (ditambahkan pada saat digunakan). Larutan stok asam pikrat jenuh : dibuat dengan cara melarutkan 1 gr serbuk asam pikrat dalam etanol 95% 100 ml
b) Neutral Buffered Formalin Komposisi :
- Formalin 10 ml
- Acid Sodium Phosphate monohydrate 0,40 gr - Anhydrous disodium phosphate 0,65 gr - Akuades 100 ml
BAB III METODOLOGI III. 1 Metode
Metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu, melakukan fiksasi jaringan
III. 2 Prinsip
Jaringan segar yang diambil segera difiksasi dengan formalin 10%, Xilol, alkohol bertingkat , dan paraffin selama ± 21 – 24 jam. Pada proses fiksasi
akan mempertahankan bentuk jaringan agar mudah untuk melalukan proses embedding. Jaringan yang sudah difiksasi di embedding dengan paraffin, kemudian dipotong dengan ketebalan tertentu dan diwarnai untuk memperjelas jaringan yang diamati.
III. 3 Alat dan Bahan
A. Alat No .
Nama Alat Gambar Fungsi
1. Tissue Prosesor Sebagai tempat untuk memfiksasi jaringan yang diambil. Terdapat 12 chamber yaitu formalin 10%, Xylol, Alkohol bertingkat, dan paraffin. 2. Parafin block Sebagai tempat untuk embedding jaringan yang sudah di fiksasi.
3. Cool block Sebagai tempat
untuk
membekukan paraffin pada jaringan yang diembedding.
4. Mikrotom Sebagai alat untuk pemotongan jaringan dengan ketebalan tertentu, sesuai kebutuhan pemeriksaan.
5. Water Bath Sebagai tempat
untuk mengembangka n jaringan agar tidak terlihat mengkerut dan agar jaringan tidak terlipat.
6. Hot Plate Sebagai alat
agar
merekatkan jaringan dengan objek glass agar tidak mudah lepas saat diwarnai 7. Objek Glass Sebagai tempat untuk meletakkan jaringan yang sudah di potong
8. Cover Glass Sebagai penutup jaringan diatas objek glass sebelum dilakukan pengamatan di mikroskop
9 Kuas Sebagai alat
untuk membantu pengambilan jaringan yang sudah dipotong dari mikrotom ke waterbath, dan untuk membersihkan mikrotom dari sisa paraffin hasil pemotongan.
10. Kaset Sebagai tempat
untuk meletakkan jaringan yang didah diembedding, terdapat 2 macam kaset yaitu kaset plastic dan kaset metal.
11 Pinset Alat untuk membantu pengambilan jaringan saat melakukan embedding 12 Pisau mikrotom Sebagai alat untuk pelengkap dari mikrotom yang berperan penting dalam proses pemotongan jaringan yang sudah di embediing.
13. Mikroskop Sebagai alat
bantu untuk mengamati jaringan yang sudah dipotong. B. Bahan
No Nama Bahan Fungsi
1. Tikus Putih (mencit) Sebagai bahan percobaan dalam proses pembuatan preparat dari jaringan. 2. Formalin 10% Xylol Alkohol Bertingkat (70% - Absolute) Parafin
Bahan ini digunakan dalam proses fiksasi jaringan yang telah diambil untuk mempertahankan bentuk jaringan.
Bouin
3. Parafin Bahan yang digunakan dalam proses embedding jaringan. 4. Xylol / Xylen Digunakan dalam proses
pewarnaan yang berfungsi untuk mengeluarkan cairan yang terdapat dalam jaringan. 5. Alkohol Bertingkat 70%
- Absolute
Digunakan dalam proses
pewarnaan yang berfungsi untuk mengeluarkan sisa cairan yang masih terdapat dalam jaringan. 6. Hematoxilin Bahan warna untuk mewarnai
jaringan terutama pada inti sel akan berwarna biru.
7. Eosin Bahan warna untuk mewarnai jaringan terutama pada sitoplasma akan berwarna merah muda. 8. Akuadest Untuk membersihkan zat warna
sebelum dilanjutkan ke proses pewarnaan clearing.
9. Bahan entelan Bahan yang teksturnya seperti lem yang digunakan untuk merekatkan jaringan, mengawetkan warna, dan mempertajam indeks warna saat pengamatan di mikroskop. 10. Label Bahan untuk pemberian nama
pasien, no jaringan.
III. 4 Prosedur Kerja
Cara kerja dari pembuatan preparat dari jaringan ini dibagi menjadi 4 tahap yaitu :
A. Proses Pengambilan jaringan
1. Disiapkan alat dan bahan yang diperlukan diatas meja kerja. 2. Disiapkan mencit (tikus putih) yang akan digunakan sebagai
3. Dibius mencit ( tikus putih) dengan menggunakan kloroform 4. Diposisikan mencit yang sudah mati terlentang dengan kaki
bagian atas dan bagian bawah ditusuk agar tidak bergerak pada saat proses pembedahan.
5. Dimulai proses pembedahan dari bawah perut mencit kemudian vertical ke atas dengan menggunakan pisau bedah. 6. Diambil organ-organ mencit seperti hati, ginjal, pancreas,
ovarium dll.
7. Diambil jaringan yang dibersihkan dengan Xylen. Kemudian disimpan dalam botol yang berisi alcohol jika belum dikalukan proses fiksasi.
B. Proses Histopatologi jaringan
Proses Histopatologi jaringan dibagi dalam beberapa tahap yaitu: 1. Difiksasi dengan alat tissue prosesor yang terdiri dari 12 chamber
yang berisi Formalin 10%, Xylol, Alkohol Bertingkat (70% - Absolute) dan Parafin.
a. Dinyalakan alat Tissue Prosesor sampai alat siap untuk digunakan .
b. Disetting alat sesuai dengan kebutuhan pemakaian.
c. Disimpan jaringan yang didalam botol dimasukkan ke dalam kaset yang telah berisi label sesuai dengan nama jaringan. d. Dimasukan kaset ke dalam chamber yang berisi Formalin 10
%. Alat akan bekerja secara otomatis dalam proses fiksasi ini.
e. Ditekan tombol start untuk memulai proses pada tissue prosesor.
f. Ditunggu dalam waktu ± 21 – 24 jam dalam proses fiksasi ini.
g. Setelah 24 jam dikeluarkan kaset dari chamber terakhir dengan cara manual.
h. Dalam tissue prosesor ini terdapat berbagai macam tahapan yaitu
a) Fiksasi untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi stabil secara fisik dan kimiawi dan mencegah terjadi dialysis atau pembengkakan pada rupture. Menggunakan Formalin 10%.
b) Dehidrasi untuk menghilangkan atau menarik air dalam jaringan dengan cara mulai konsentrasi terendah sampai konsentrasi tinggi. Menggunakan alcohol dari konsentrasi 70%- Absolute.
c) Clearing untuk menarik keluar kadar alcohol yang berada dalam jaringan, memberi warna yang bening pada jaringan dan juga sebagai perantara mesuknya kedalam paraffin. Menggunakan Xylol.
d) Infiltrasi Parafin untuk mengisi rongga atau pori-pori yang ada pada jaringan setelah setelah ditinggal cairan sebelumnya.
e) Larutan Bouin
Organ yang telah dicuci dengan larutan garam fisiologis, dimasukkan ke dalam larutan Boiun (maksimal 24 jam) dengan volume sekurang-kurangnya 10x volume jaringan yang akan difiksasi. Komposisi larutan Bouin :
- Larutan asam pikrat jenuh 75 ml - Formalin (Formaldehid 40%) 20 ml
- Asam Asetat Glasial 5 ml (ditambahkan pada saat digunakan).
- Larutan stok asam pikrat jenuh : dibuat dengan cara melarutkan 1 gr serbuk asam pikrat dalam etanol 95% 100 ml
f) Prosedur untuk fiksasi jaringan adalah sebagai berikut :
1. Dipotong spesimen jaringan/organ dengan ukuran kurang lebih 4 mm
2. Direndam dengan larutan fiksasi sesuai dengan tujuan pewarnaan atau komponentarget
3. Ditunggu hingga tahap fiksasi selesai sempurna 4. Dicuci dengan air mengalir atau aquades (jika diperlukan)
5. Dilakukan tahap selanjutnya.
Diambil sampel jaringan (contoh hati), kemudian dipotonglah hati tersebu tdengan ukuran kurang lebih 0,5 x 0,5 x 0,5 cm sebanyak 4 buah. Dari 4 buah potongan-potongan hati tersebut, dilakukan tahap fiksasi dengan waktu yang berbeda.
C. Ratio Antara Jaringan Dengan Volume Larutan Fiksasi
Rasio yang tinggi antara larutan fiksatif dengan jaringan akan memastikan proses fiksasi yang baik. Rasio optimal volume larutan fiksasi dengan jaringan adalah 20:1. Dalam praktek sehari-hari masih didapatkan rasio yang lebih rendah dari ini. Dalam hal ini, yang terbaik adalah untuk mengganti cairan fiksatif secara periodik beberapa kali selama proses fiksasi.
D. FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI FIKSASI
Adapun sejumlah faktor yang akan mempengaruhi tingkat efektivitas dan kecepatan fiksasi jaringan adalah sbb:
1. suhu atau temperatur
2. Penetrasi larutan : waktu penetrasi dan tingkat penetrasi 3. Dimensi spesimen
4. Rasio volume terhadap spesiem 5. Tingkat keasaman (pH)
Berikut adalah tiga hal penting untuk fiksasi yang baik dan dua puluh peraturan yang harus dikuti untuk memastikan pencapaiannya : 1. Kondisi ketika jaringan segar
a. Dimasukan jaringan secepat mungkin
b. Dihentikan metabolisme dengan pendinginan c. Jaringan seger dapat bersifat infeksius
d. Jangan biarkan spesimen mengering e. Jangan mendistorsi jaringan
f. Diberi label secara lengkap dan akurat
2. Penentuan larutan fiksasi yang tepat a. Fixative harus menembus dari semua sisi b. Rongga harus terbuka
c. Berfusi beberapa spesimen
d. Fiksasi oleh berfusi melalui sistem vaskuler pada organ yang masih utuh atau pada hewan percobaan kecil akan menghasilkan hasil yang sangat baik.
e. Ketebalan organ (maksimal 4mm) f. Lakukan agitasi pada proses g. Rasio volume: rasio jaringan h. Berikan waktu yang cukup i. Penggunaan suhu
Jawablah Pertanyaan Berikut
1.) Jika saudara membeli formalin PA 40%, kemudian saudara mengambil 100 ml formalin PA. Lalu ditambahkan akuades sampai 1000 ml. Maka berapa persen konsentrasi formalin yang saudara buat ?
Jawab : V1 . K1 = V2 . K2 100 x 40 = 1000 x K2 4000 = 1000 K2 K2 = 4000 / 1000 K2 = 4%
2.) a.) Berapa gram asam pikrat yang saudara butuhkan jika saudara ingin membuat asam pikrat jenuh dengan penambahan etanol 95% sebanyak 500 ml ?
Jawab :
% volume = massa zat campuran x 100% Volume seluruh campuran
95 % = massa asam pikrat (gr/ml) x 100% 500 ml
Massa as. pikrat = 475 gr
2.) b.) Jika saudara mempunyai asam pikrat jenuh sebanyak 500 ml, berapa ml larutan Bouin yang saudara peroleh?
Diketahui = Perbandingan as. pikrat : Formalin : as. asetat glasial
75 ml : 20 ml : 5 ml
15 ml : 5 ml : 1 ml
- Asam pikrat jenuh 500 / 15 ml = 33,33 ml
- Formalin
5 ml x 33,3333 ml = 166,67 ml
- Asam asetat glasial
1 ml x 33,33 ml = 33,33 ml
Total larutan Bouin yang diperoleh = 500 ml + 166,67 ml + 33,33 ml = 700 ml
DAFTAR PUSTAKA
1. Alwi, M. A. 2016. Fiksasi 2 Minggu Pada Gambaran Histologi Organ Ginjal, Hepar, Dan Pankreas TIKUS. Skripsi.
2. Harjana, T. 2011. Histologi. Jurusan Biologi Fakultas MIPA: Universitas Negeri Yogyakarta.
3. http://bppsdmk.kemkes.go.id/pusdiksdmk/wpcontent/uploads/2017/11/Sito histoteknologi-SC.pdf
