LAPORAN PRAKTIKUM
SITOHISTO TEKNOLOGI
“ PEMBUATAN PREPARAT HISTOLOGI DENGAN TEKNIK SAYATAN “
Dosen Pembimbing : Dra. Hayati, M.Farm
Disusun oleh : Riski Nabillah Putri
1804034084 VI A
D-IV TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF. DR. HAMKA JAKARTA
BAB I PENDAHULUAN I.1 Latar Belakang
Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu kata, histos dan logos. Histos berarti jaringan dan logos adalah ilmu. Jadi Histologi adalah salah satu cabang dari ilmu Biologi yang membahas tentang jaringan (Bevelander dan Ramaley 1988). Jaringan itu sendiri adalah sekumpulan sel yang sama bentuk dan fungsinya. Untuk memahami histologi, sebelumnya seorang mahasiswa harus memahami terlebih dahulu ilmu anatomi tubuh manusia khususnya, kemudian sistem organ yang mendukung suatu organisme itu serta organ apa saja yang terlibat di dalam suatu sistem organ tersebut. Histologi juga membantu menegakkan diagnosa untuk suatu penyakit dengan melihat parameter histologinya, dengan cara biopsi jaringan dan kemudian membuat preparasi jaringannya.
Mikroteknik merupakan ilmu atau seni mempersiapkan organ, jaringan atau bagian jaringan untuk dapat diamati dan ditelaah. Penelaahan umumnya dilakukan dengan bantuan mikroskop, karena struktur jaringan secara terperinci pada galibnya terlalu kecil untuk dapat dilihat dengan mata telanjang.
Teknik pembuatan preaparat kususnya untuk jaringan hewan dan manusia ada 2 macam, yaitu teknik pembuatan preaparat dengan sayatan dan teknik pembuatan preparat tanpa teknik sayatan. Pembuatan preparat tanpa tehnik sayatan antara lain, yaitu preparat ulas dan preparat rentang, preaparat supravital, preparat utuh dan preparat urai.
I.2 Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dilakukan nya praktikum kali ini yaitu :
1. Mahasiswa dapat mengetahui cara pembuatan preparat dari jaringan.
2. Mahasiswa dapat memahami prosesing jaringan agar menjadi preparat
yang siap untuk diamati.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
II. 1 Definisi Histologi
Histologi berasal dari bahasa Yunani yaitu kata, histos dan logos. Histos berarti jaringan dan logos adalah ilmu. Jadi Histologi adalah salah satu cabang dari ilmu Biologi yang membahas tentang jaringan (Bevelander dan Ramaley 1988). Jaringan itu sendiri adalah sekumpulan sel yang sama bentuk dan fungsinya. Untuk memahami histologi, sebelumnya seorang mahasiswa harus memahami terlebih dahulu ilmu anatomi tubuh manusia khususnya, kemudian sistem organ yang mendukung suatu organisme itu serta organ apa saja yang terlibat di dalam suatu sistem organ tersebut. Ilmu ini berkembang seiring dengan berkembangnya ilmu fisika optik khususnya penemuan mikroskop dan ilmu teknik pewarnaan (histokimia) dan teknik pembuatan preparat dari organ dan jaringan hewan, sehingga kita dapat melihat jaringan yang menyusun dari satu organ baik dalam keadaan normal maupun patologis. Histologi juga membantu menegakkan diagnosa untuk suatu penyakit dengan melihat parameter histologinya, dengan cara biopsi jaringan dan kemudian membuat preparasi jaringannya.
II. 2 Mikroteknik
Mikroteknik merupakan teknik pembuatan sediaan atau preparat secara mikroskopis, tentunya pendekatan teoritis tidaklah memadai untuk memahami secara menyeluruh mengenai Mikroteknik, sebab yang namanya teknik lebih menekankan pemahaman pada wilayah aplikatifnya meskipun pada dasarnya landasan teoritis juga diperlukan dalam rangka memberikan beberapa petunjuk yang harus dilalui agar proses pembuatan sediaan sesuai dengan prosedural
kerja dan alasan penggunaan ataupun pemilihan bahan yang akan digunakan dalam pembuatan sediaan Mikroskopis. Metoda-metoda didalam Mikroteknik yang umum digunakan :
1. Sediaan utuh (Whole mounts) 2. Sediaan irisan (sectioning) 3. Sediaan uraian (teasing) 4. Sediaan ulasan (smearing)
Selain itu masih ada pula dikenal beberapa metoda lain seperti : 1. Sediaan rentang (spreading preparation)
2. Sediaan gosok – sediaan remasan (squash) 3. Sediaan supravital
II.3 Beberapa Spesies Hewan Yang Dapat Diuji Coba
1. Rodent (binatang pengerat)
Hewan pengerat yang yang digolongkan sebagai tikus, telah digunakan sebagai hewan laboratorium selama lebih dari 100 tahun. Beberapa, jenis tikus telah mengalami perubahan genetik untuk meminimalkan dan mengendalikan variabel asing yang dapat mengubah hasil penelitian dan untuk keperluan penelitian. tikus juga merupakan hewan yang reprodusible sehingga tersedia dalam jumlah yang cukup untuk penelitian yang memerlukan banyak hewan coba. Terdapat berbagai macam jenis tikus diantaranya :
a. Tikus Biobreeding Tikus ini merupakan tikus rentan terkena DM tipe 1, sehingga tikus ini banya digunakan dan banyak berperan dalam penemuan obat DM tipe 1
b. Tikus Putih Galur Sprague Dawley Keuntungan utama pada hewan ini adalah ketenangan dan kemudahan penanganan (jinak), Berat dewasa antara 250-300 g untuk betina, dan 450 – 520 g untuk jantan. Usia hidup antara 2, 5 – 3, 5 tahun. Ekornya lebih panjang daripada tikus galur
wistar,berkembang biak dengan cepat. Tikus ini paling banyak digunakan dalam penelitian – penelitian biomedis seperti toksikologi, uji efikasi dan keamanan, uji reproduksi, uji behavior/perilaku, aging, teratogenik, onkologi, nutrisi, dan uji farmakologi lainnya. Contoh contoh penelitian yang dilakukan antara lain Studi infeksi maternal dan fetal, Studi efek diet pre-natal tinggi garam pada keturunan , studi efek status seks dan hormonal pada stress yang diinduksi kerusakan memori, Studi gen ostocalcin spesifik stulang pada tikus, dan Studi eksitabilitas hippocampus selama siklus estrus pada tikus. Tikus ini pertama dihasilkan oleh peternakan Sprague Dawley- (kemudian menjadi Sprague Dawley-Animal Perusahaan) di Madison, Wisconsin pada tahun 1925.
c. Tikus Putih Galur Wistar
Tikus galur wistar memiliki bobot yang lebih ringan dan lebih galak daripada galur Sprague dawley. Tikus ini banyak digunakan pada penelitian toksikologi, penyakit infeksi, uji efikasi, dan aging. d. Tikus Mungil Alias Mencit Mencit berbeda dengan tikus, dimana ukurannya mini, berkembang biak sangat cepat, dan 99% gennya mirip dengan manusia. Oleh karena itu mencit sangat representative jika digunakan sebagai model penyakit genetic manusia (bawaan). Selain itu, mencit juga sangat mudah untuk di rekayasa genetiknya sehingga menghasilkan model yang sesuai untuk berbagai macam penyakit manusia. Selain itu, mencit juga lebih menguntungkan dalam hal kemudahan penanganan, tempat penyimpanan, serta harganya yang relatif lebih murah.
2. Kelinci
Kelinci juga merupakan hewan uji yang sering digunakan selain tikus. Contohnya kelinci albino Hewan ini biasanya digunakan untuk uji iritasi mata karena kelinci memiliki air mata lebih sedikit daripada hewan lain dan sedikitnya pigmen dimata karena warna albinonya menjadikan efek yang
dihasilkan mudah untuk diamati. Selain itu, kelinci juga banyak digunakan untuk menghasilkan antibody poliklonal.
II. 4 Teknik Pembuatan Preparat
Teknik pembuatan preaparat kususnya untuk jaringan hewan dan manusia ada 2 macam, yaitu teknik pembuatan preaparat dengan sayatan dan teknik pembuatan preparat tanpa teknik sayatan. Pembuatan preparat tanpa tehnik sayatan antara lain, yaitu preparat ulas dan preparat rentang, preaparat supravital, preparat utuh dan preparat urai.
A. Pembuatan Preparat Histologi dengan tehnik sayatan
Pembuatan preparat histologi dengan tehnik sayatan adalah suatu cara membuat preparat histologi menggunakan embedding dalam parafin dan mikrotom putar untuk menyayat. Adapaun tahapan atau persiapan yang herus dilakukan untuk membuat preparat histologi dengan tehnik sayatan adalah sebagai berikut :
1. Menyiapkan hewan percobaan untuk dibius
Sebelum melakukan pembiusan terhadap hewan percobaan, terlebih dahulu yang harus dipersiapkan adalah : Menyediakan kapas yang sudah dibasahi dengan eter sebagai bahan pembius hewan percobaan.
a. Memasukkan kapas yang sudah dibasahi dengan eter ka dalam wadah pembiusan.
b. Memasukan hewan percobaan ke dalam wadah pembiusan.
c. Menutup wadah, lalu hewan percobaan yang ada didalam wadah diamati hingga terlihat lemas.
2. Pengambilan Organ atau Jaringan
Organ ataupun jaringan yang diambil disesuaikan dengan kebutuhan dalam pengamatan.
3. Pencucian
Pencucian organ dilakukan dengan cara memasukkan organ yang diinginkan ke dalam larutan garam fisiologis (NaCl 0,9%).
4. Fiksasi
Fiksasi adalah suatu usaha untuk mempertahankan elemen – elemen sel atau jaringan agar tetap pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran. Fiksasi berfungsi untuk mempertahankan bentuk jaringan sedemikian rupa sehingga perubahan bentuk atau struktur sel jaringan yang terjadi hanya sekecil mungkin, menembus jaringan dengan cepat, bersifat mordent (mengikat) dan membantu indeks refraksi. Untuk dapat melakukan hal tersebut suatu larutan fiksasi harus dapat :
a. Menghentikan proses enzimatik sel tubuh secepatnya untuk mencegah autolisis. Autolisis adalah pengerusakan sel sendiri sesudah terjadi kematian sel dan disebabkan oleh kerja enzim yang terdapat di dalam sel itu sendiri. Autolisis ini dapat dihambat dengan mendinginkan jaringan dalam ternperatur di bawah 0°C atau dalam udara panas lebih dari 57°C, namun dalam suhu kamar akan dipercepat. Selain autolisis, kerusakan jaringan dapat terjadi akibat bakteri, baik disebabkan oleh bakteri yang ada (septikemi) ataupun bakteri komensial.
b. Mengkoagulasi protein jaringan sehingga menjadikan sel insoluble yang mencegah masuk atau keluarnya zat-zat dalam sel.
c. Membuat jaringan mudah diwarnai. Jaringan harus dimasukkan ke dalam larutan fiksasi secepat mungkin setelah diambil dari organ. Jika organ tersebut mudah membusuk misalnya otak, hati, paru, usus dan organ dalam lainnya, jangan ditunggu sampai operasi selesai. Daya penetrasi larutan fiksasi juga terbatas. Banyaknya larutan fiksasi minimal jaringan dapat berenang di dalamnya dan yang ideal jumlah larutan 10 x besar jaringan.
Berikut adalah jenis-jenis larutan fiksasi yang biasa digunakan dalam pemeriksaan suatu jaringan adalah :
a) Formaldehid
Formaldehid adalah suatu gas yang larut dalam air. Larutan ini bersifat asam dan tersedia dalam bentuk formaldehid 40% atau formalin, namun dengan konsentrasi ini tidak dapat dipakai untuk fiksasi karena terlalu cepat mengeraskan jaringan. Sebagai larutan fiksasi harus dicampurkan dalam air biasa atau larutan garam fisiologis, dengan perbandingan 1 bagian formalin dengan 9 bagian pelarut menjadi formal saline 10% atau lebih dikenal dengan formalin 10%. Untuk penyimpanan dalam jumlah besar dan waktu yang lama maka formaline 10% harus diberi garam buffer atau magnesium atau kalsiumkarbonat supaya tidak terjadi pembentukan endapan asam formik. Formalin mempunyai bau yang tidak enak dan dapat mengiritasim kulit, selaput lendir dan mata. Oleh karena itu dianjurkan memakai sarung tangan dengan udara terbuka waktu kita sedang mengelola materi berformalin.
b) Alkohol
Alkohol Merupakan larutan dengan daya dehidrasi yang kuat dan menyebabkan pengerasan dan pengerutan jaringan. Alkohol dapat mengkoagulasi protein dan presipitasi glukogen dan melarutkan lemak. Fungsi alkohol yang utama adalah sebagai bahan fiksasi sediaan sitologi namun dalam keadaan terpaksa dapat digunakan sebagai fiksasi sediaan histopatologi. Hal ini disebabkan daya tembus alkohol yang kurang baik oleh karena jaringan cepat menjadi keras dan mengkerut sehingga sediaan sukar dipulas. Dua jenis alkohol paling sederhana adalah methanol dan etanol.
Organ yang telah dicuci dengan larutan garam fisiologis, dimasukkan ke dalam larutan Boiun (maksimal 24 jam) dengan volume sekurang-kurangnya 10x volume jaringan yang akan difiksasi. Komposisi larutan Bouin :
- Larutan asam pikrat jenuh 75 ml - Formalin (Formaldehid 40%) 20 ml
- Asam Asetat Glasial 5 ml (ditambahkan pada saat digunakan).
Larutan stok asam pikrat jenuh : dibuat dengan cara melarutkan 1 gr serbuk asam pikrat dalam etanol 95% 100 ml
d) Neutral Buffered Formalin Komposisi :
- Formalin 10 ml
- Acid Sodium Phosphate monohydrate 0,40 gr - Anhydrous disodium phosphate 0,65 gr - Akuades 100 ml
Rumus yang digunakan untuk memonitor fiksasi baik atau buruk diuji dengan rumus:
d = k √t
Keterangan d = ketebalan jaringan (mm) t = waktu yang dibutuhkan/tersedia
k = ketetapan daya fiksir dari atas dan bawah (2 X ketetapan masing-masing fiksasi) Ketetapan fiksasi formalin 10% = 0.78
5. Dehidrasi
Dehidrasi bertujuan untuk penarikan molekul air dalam jaringan. Proses ini sangat penting terutama untuk jaringan – jaringan yang akan dibuat preparat irisan. Biasanya proses dehidrasi dilakukan setelah proses fiksasi selesai.
Cara melakukan dehidrasi : Proses dehidrasi dijalankan secara perlahan-lahan menggunakan alkohol bertingkat , dimulai dengan alkohol persentase rendah sampai dengan alkohol absolute. Dimulai dengan alkohol 70 %, 80 %, 95 %, alkohol absolute ( selama 30 menit). Waktu yang dipergunakan untuk setiap tingkat alkohol tergantung dari besar kecilnya jaringan . Alkohol absolute mempunyai kemampuan memperkeras jaringan. Sebagai ancar-ancar jaringan jangan ditinggalkan didalam alkohol tersebut lebih dari 1 atau 2 jam untuk jaringan berukuran biasa ( tebal 2-4 mm).
6. Penjernihan (Clearing)
Penjernihan adalah suatu proses yang dilakukan setelah tahapan dehidrasi yang berfungsi untuk membuat jaringan menjadi jernih dan transparan. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya dan juga sebagai perantara masuknya jaringan kedalam paraffin. Zat yang sering dipakai Xylol, tapi bisa juga dipakai : benzol, benzene, toluol dan lain-lain.. Untuk jaringan otak dan limfonoid lebih baik menggunakan koloform. Waktu yang digunakan untuk proses penjernihan tergantung pada ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan. Penjernihan biasanya dilakukan secara bertahap. Setelah jaringan selesai didehidrasi di dalam alkohol absolut, selanjutnya organ dimasukkan ke dalam larutan campuran alkohol absolut : xilol (1 ; 1) selama 30 menit, lalu dilanjutkan di dalam xilol selama 30 menit.
7. Embedding
Embeding (Penanaman) adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Tujuan tahap embeding ini adalah untuk mengisi jaringan dengan parafin
sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup. Cara melakukan embedding : Dilakukan dengan merendam organ di dalam inkubator dengan suhu tetap (60°C) dalam parafin cair yang diisikan pada botol film. Organ kemudian diletakkan dalam botol film berisi parafin cair sebanyak 2 kali pengulangan, masingmasing selama 2 jam.
8. Penyayatan (Sectioning)
Pencetakan dilakukan dengan cara merendamkan organ dalam cetakan blok parafin, setelah mengering lalu dipotong ( pemotongan blok parafin menggunakan pisau yang telah di panaskan di atas api, dengan tujuan agar parafin tidak rusak) sesuai sedemikian rupa berbentuk persegi dan di lekatkan pada sebuah balok kayu yang berukuran kecil, blok tersebut di beri label dan siap di sayat menggunakan mikrotom. Merendam organ dalam cetakan blok parafin,lalu blok tersebut diberi label dan siap di sayat menggunakan rotary microtom. Tebal sayatan yang umum berkisar 6 – 15 mikron ( 1 mikron = 0,001 mm ).
9. Penempelan dan Afiksasi
(Affixing) (Dasumiati 2008) : Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek. Media pelekat yang umumnya digunakan adalah Mayers albumin yang formulanya adalah sebagai berikut :
1. Putih telur sebanyak 5o bagian
2. Gliserin sebanyak 50 bagian
3. Kristal Tymol beberapa butir
10. Pewarnaan (Staining)
Umumnya dalam pewarnaan histopatologi digunakan cat Hematoxylin-Eosin (HE) disamping cat khusus (PAS, gomori, ZN, Malory, dll) dan cat yang lebih khusus yaitu immunohistokimia (ER, PR, CD20, LMP, dll). Pewarnaan yang digunakan adalah Haematoksilin eosin (HE). Pewarnaan dilakukan di dalam staining jar dengan seri larutan sebagai berikut: a. Deparafinisasi
b. Preparat masuk ke Xylol I, II, dan III masing-masing 3 menit.Setelah itu dikeringkan pinggir jaringan dengan kain kasa.
c. Rehidrasi Preparat masuk ke alkohol 100%, 95%, 80%, 70% masing-masing 2 menit
d. Preparat masuk ke air mengalir 3 menit (air mengalir ditampung dalam wadah ). Sebelumnya dicelupkan ke dalam dua mangkok air 3 celup e. Pengecatan Inti 7 menit.
Preparat masuk ke dalam Meyer Hematoksilin f. Preparat masuk ke air mengalir 3 menit (air mengali ditampung dalam wadah ). Sebelumnya dicelupkan ke dalam dua mangkok air 3 celup.
g. Counter Stain .
Preparat dimasuk ke larutan Eosin 7 celup
h. Preparat Masuk ke air wadah I, II, dan III 3 celup i. Dehidrasi
Preparat masuk ke dalam alkohol 70 %, 80%, 95%,100% 3 celup Setelah itu dikeringkan dengan kain kasa sekitar jaringan dan tunggu sampai kering.
j. Clearing
11. Mounting
Mounting yaitu penutupan kaca objek setelah ditetesi Entellan atau Canada Balsam tujuan Memberi warna cerah dan sebagai pelindung dan pengawet jaringan dari mikroba dan bakteri.
BAB III METODOLOGI III. 1 Metode
Metode yang digunakan dalam praktikum ini yaitu dengan teknik atau metode histopatologi baik dari proses fiksasi, dehidrasi, clearing, impregnasi ,embedding, dan Mounting.
III. 2 Prinsip
Jaringan segar yang diambil segera difiksasi dengan formalin 10%, Xilol, alkohol bertingkat , dan paraffin selama ± 21 – 24 jam. Pada proses fiksasi akan mempertahankan bentuk jaringan agar mudah untuk melalukan proses embedding. Jaringan yang sudah difiksasi di embedding dengan paraffin, kemudian dipotong dengan ketebalan tertentu dan diwarnai untuk memperjelas jaringan yang diamati.
III. 3 Alat dan Bahan
A. Alat No .
Nama Alat Gambar Fungsi
1. Tissue Prosesor Sebagai tempat untuk memfiksasi jaringan yang diambil. Terdapat 12 chamber yaitu formalin 10%, Xylol, Alkohol bertingkat, dan paraffin.
2. Parafin block Sebagai tempat untuk embedding jaringan yang sudah di fiksasi.
3. Cool block Sebagai tempat
untuk
membekukan paraffin pada jaringan yang diembedding.
4. Mikrotom Sebagai alat
untuk pemotongan jaringan dengan ketebalan tertentu, sesuai kebutuhan pemeriksaan.
5. Water Bath Sebagai tempat
untuk mengembangka n jaringan agar tidak terlihat mengkerut dan agar jaringan tidak terlipat.
6. Hot Plate Sebagai alat agar
merekatkan jaringan dengan objek glass agar tidak mudah lepas saat diwarnai 7. Objek Glass Sebagai tempat untuk meletakkan jaringan yang sudah di potong 8. Cover Glass Sebagai penutup jaringan diatas objek glass sebelum dilakukan pengamatan di mikroskop
9 Kuas Sebagai alat
untuk membantu pengambilan jaringan yang sudah dipotong dari mikrotom ke waterbath, dan untuk membersihkan mikrotom dari
sisa paraffin hasil
pemotongan.
10. Kaset Sebagai tempat
untuk meletakkan jaringan yang didah diembedding, terdapat 2 macam kaset yaitu kaset plastic dan kaset metal.
11 Pinset Alat untuk
membantu pengambilan jaringan saat melakukan embedding 12 Pisau mikrotom Sebagai alat untuk pelengkap dari mikrotom yang berperan penting dalam proses pemotongan jaringan yang
sudah di embediing.
13. Mikroskop Sebagai alat
bantu untuk mengamati jaringan yang sudah dipotong. B. Bahan
No Nama Bahan Fungsi
1. Tikus Putih (mencit) Sebagai bahan percobaan dalam proses pembuatan preparat dari jaringan. 2. Formalin 10% Xylol Alkohol Bertingkat (70% - Absolute) Parafin
Bahan ini digunakan dalam proses fiksasi jaringan yang telah diambil untuk mempertahankan bentuk jaringan.
3. Parafin Bahan yang digunakan dalam proses embedding jaringan. 4. Xylol / Xylen Digunakan dalam proses
pewarnaan yang berfungsi untuk mengeluarkan cairan yang terdapat dalam jaringan. 5. Alkohol Bertingkat 70%
- Absolute
Digunakan dalam proses
pewarnaan yang berfungsi untuk mengeluarkan sisa cairan yang masih terdapat dalam jaringan. 6. Hematoxilin Bahan warna untuk mewarnai
jaringan terutama pada inti sel akan berwarna biru.
7. Eosin Bahan warna untuk mewarnai jaringan terutama pada sitoplasma akan berwarna merah muda. 8. Akuadest Untuk membersihkan zat warna
sebelum dilanjutkan ke proses pewarnaan clearing.
9. Bahan entelan Bahan yang teksturnya seperti lem yang digunakan untuk merekatkan jaringan, mengawetkan warna, dan mempertajam indeks warna saat pengamatan di mikroskop. 10. Label Bahan untuk pemberian nama
pasien, no jaringan.
III. 4 Prosedur Kerja
Cara kerja dari pembuatan preparat dari jaringan ini dibagi menjadi 4 tahap yaitu :
A. Proses Pengambilan jaringan
1. Disiapkan alat dan bahan yang diperlukan diatas meja kerja. 2. Disiapkan mencit (tikus putih) yang akan digunakan sebagai
bahan percobaan dari praktikum.
3. Dibius mencit ( tikus putih) dengan menggunakan kloroform 4. Diposisikan mencit yang sudah mati terlentang dengan kaki
bagian atas dan bagian bawah ditusuk agar tidak bergerak pada saat proses pembedahan.
5. Dimulai proses pembedahan dari bawah perut mencit kemudian vertical ke atas dengan menggunakan pisau bedah.
6. Diambil organ-organ mencit seperti hati, ginjal, pancreas, ovarium dll.
7. Diambil jaringan yang dibersihkan dengan Xylen. Kemudian disimpan dalam botol yang berisi alcohol jika belum dikalukan proses fiksasi.
B. Proses Histopatologi jaringan
Proses Histopatologi jaringan dibagi dalam beberapa tahap yaitu:
1. Difiksasi dengan alat tissue prosesor yang terdiri dari 12 chamber yang berisi Formalin 10%, Xylol, Alkohol Bertingkat (70% - Absolute) dan Parafin.
a. Dinyalakan alat Tissue Prosesor sampai alat siap untuk digunakan .
b. Disetting alat sesuai dengan kebutuhan pemakaian.
c. Disimpan jaringan yang didalam botol dimasukkan ke dalam kaset yang telah berisi label sesuai dengan nama jaringan. d. Dimasukan kaset ke dalam chamber yang berisi Formalin 10
%. Alat akan bekerja secara otomatis dalam proses fiksasi ini. e. Ditekan tombol start untuk memulai proses pada tissue
prosesor.
f. Ditunggu dalam waktu ± 21 – 24 jam dalam proses fiksasi ini. g. Setelah 24 jam dikeluarkan kaset dari chamber terakhir
dengan cara manual.
h. Dalam tissue prosesor ini terdapat berbagai macam tahapan yaitu
a) Fiksasi untuk mempertahankan struktur sel sehingga menjadi stabil secara fisik dan kimiawi dan mencegah terjadi dialysis atau pembengkakan pada rupture. Menggunakan Formalin 10%.
b) Dehidrasi untuk menghilangkan atau menarik air dalam jaringan dengan cara mulai konsentrasi terendah
sampai konsentrasi tinggi. Menggunakan alcohol dari konsentrasi 70%- Absolute.
c) Clearing untuk menarik keluar kadar alcohol yang berada dalam jaringan, memberi warna yang bening pada jaringan dan juga sebagai perantara mesuknya kedalam paraffin. Menggunakan Xylol.
d) Infiltrasi Parafin untuk mengisi rongga atau pori-pori yang ada pada jaringan setelah setelah ditinggal cairan sebelumnya.
2. Embedding dengan alat paraffin block yang berisi paraffin yang sudah dicairkan.
a. Dinyalakan alat paraffin block 30 menit sebelum pemakaian, agar paraffin yang terdapat dalam alat bisa mencair.
b. Dikeluarkan jaringan dari kaset plastic yang digunakan saat fiksasi apabila ingin memulai proses embedding.
c. Diambil kaset metal dengan pinset dan kaset diisi dengan sedikit paraffin.
d. Diletakkan jaringan yang telah difiksasi pada kaset metal dengan memperhatikan posisi jaringan. Jika terdapat jaringan yang cassinoma posisi jaringan tersebut menghadap ke kaset metal.
e. Diisi kembali dengan paraffin.
f. Ditutup dengan kaset plastic, diisi kembali dengan paraffin sampai penuh.
g. Dipindahkan kaset ke cool block dengan suhu 8oC yang ada
pada alat paraffin block selama 1-2 menit agar paraffin dapat sedikit membeku.
h. Dipindahkan kaset ke alat cool block dengan suhu yang sama seperti freezer. Selama 10 menit agar blok paraffin benar-benar sudah membeku.
i. Dibuka kaset metal dapat apabila blok paraffin sudah membeku.
j. Jaringan yang sudah di embedding siap untuk proses pemotongan.
3. Pemotongan Jaringan (Cutting) menggunakan alat mikrotom dengan 2 macam pisau.
a. Disetting alat sesuai kebutuhan pemakaian seperti ketebalan dari pemotongan, kemiringan pisau.
b. Dipotong jaringan yang sudah siap diletakkan dengan benar pada alat.
c. Dilakukan proses Treaming dengan kemiringan 0,5, dan ketebaan yang bervariasi.
d. Dilakukan proses treaming sampai pada hasil potongan pita paraffin sudah Nampak jaringan yang sama seperti pada blok paraffin.
e. Dilakukan pemotongan jaringan setelah proses treaming selesai
f. Diganti pisau 1 dengan pisau 2 dengan keadaan pisau yang lebih tajam dengan ketebalan 0,3mm.
g. Diputar tuas pada mikrotom sampai jaringan terpotong tipis dan dalam keadaan utuh.
h. Ditarik jaringan yang terpotong kebawah dengan kuas, agar dapat terlihat jaringan yang bagus untuk diambil.
i. Diambil jaringan yang bagus dengan menggunakan kuas dan direntangkan pada waterbath yang berisi aquadest dan 5 ml
etanol dengan suhu 52oC
j. Dibiarkan jaringan mengembang dengan sempurna dalam waterbath.
k. Diambil jaringan dengan menggunakan objek glass yang besih dan kering.
l. Dicelupkan objek glas kewaterbath dan dengan hati- hati di dekatkan ke jaringan kemudian objek glass diangkat maka jaringan akan menempel pada objek glass.
m. Ditiriskan jaringan diatas tissue sebelum dilakukan pengeringan dengan hot plate.
4. Pengeringan pada alat hotplate.
Proses ini berfungsi untuk mengurangi kadar etanol di dalam jaringan, dan untuk merekatkan jaringan dengan objek glass agar pada saat proses pewarnaan jaringan tidak mudah lepas.
a. Ditiriskan jaringan yang sudah ada di objek glass dan
diletakkan diatas hot plate dengan suhu 75OC selama 25
menit.
b. Diangkat objek glass Jika sudah 25 menit dan siap untuk proses pewarnaan.
JAWAB PERTANYAAN BERIKUT !
a. Jika dibutuhkan garam fisiologis 0,9 % sebanyak 1000 ml, berapa gram NaCl y mang harus ditimbang ?
Jawab :
% NaCl = massa (gr) x 100 / Vol 0,9 % = massa x 100 / 1000 900 = massa x 100
massa = 900 / 100 massa = 9 gram
b. Jika ingin membuat asam pikrat jenuh sebanyak 500 ml, berapa gram asam pikrat yang harus ditimbang dan berapa banyak etanol 95% yang dibutuhkan ?
Jawab : Diketahui :
Kelarutan asam pikrat 12,7 gram/L Ditanya :
a. Berapa gram asam pikrat yang ditimbang ? b. Berapa ml etanol 95% yang dibutuhkan ? Jawab :
Gram = 12, 7 gram = X Gram 1000 ml 500 ml X gram = 12, 7 gram x 500 ml 1000 ml X gram = 6350 gram 1000
X gram = 6, 35 gram asam pikrat yang harus ditimbang
Dan etanol 95% yang diperlukan yaitu, ∑ ml x 12,7 gr = 6,35 gr x 1000 ml ∑ ml = 6,35 gram x 1000 ml 12, 7 gram ∑ ml = 6530 ml 12, 7
c. Jika formalin 40% diambil 10 ml, lalu ditambahkan akuades sampai 100 ml. Jadi berapa konsentrasi formalin itu sekarang ?
Jawab : V1 . a % = V2 . b% 10 ml . 40 = 100 ml . b% 400 ml = 100 ml . b% b% = 400 ml / 100 ml b = 4 %
