II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Ikan Mas (Cyprinus carpio)
Ikan mas merupakan ikan yang mempunyai nilai ekonomis penting, dagingnya banyak disukai orang, mudah dipelihara, dapat memanfaatkan makanan buatan, relatif tahan terhadap penyakit, pertumbuhannya relatif cepat dan mempunyai toleransi yang besar terhadap kisaran suhu dan oksigen telarut, dan mudah dipijahkan (Hardjamulia & Suseno 1975). Ikan mas mula-mula didatangkan dari China dan Rusia, kemudian didatangkan juga dari Eropa pada tahun 1972 dan 1930, Taiwan pada tahun 1970, serta dari Jepang pada tahun 1980 (Bardach 1972). Data statistik mengindikasikan bahwa produksi ikan mas hampir mendekati batas puncaknya. Bagaimanapun juga, ikan mas merupakan salah satu komoditas penting (FAO 2010), sehingga perlu ada inovasi untuk memenuhi permintaan akan ikan mas.
2.2 Hormon Pertumbuhan (Growth Hormone (GH))
GH merupakan polipeptida yang disekresikan oleh bagian anterior dari kelenjar pituitari yang memacu pertumbuhan tubuh, khususnya dengan merangsang pelepasan somatomedin, dan mempengaruhi metabolisme protein, karbohidrat, dan lipid. Menurut Biotechnology Industry Organization (2007), GH manusia pertama kali ditemukan pada tahun 1920 oleh Evans dan Long. Kemudian, pada tahun 1979 hormon tersebut disintesis untuk pertama kali. GH bekerja dengan merangsang sintesis protein dan pemecahan lemak (untuk energi). Hormon ini merupakan peptida yang besar yang terdiri dari 191 asam amino dan relatif spesies-spesifik. Sekresi hormon pertumbuhan dikendalikan oleh hipothalamus. Somatotropin menggambarkan hormon pertumbuhan yang biasa diproduksi di hewan, sedangkan somatropin menggambarkan hormon pertumbuhan yang diproduksi oleh teknologi DNA rekombinan (Wikipedia 2009a). Sekresi GH dirangsang oleh growth hormone releasing hormone (GHRH), ghrelin, protein pakan, kandungan gula darah yang rendah, peningkatan sekresi androgen, dan arginin, sedangkan yang menghambat antara lain somatostatin, konsentrasi hormon pertumbuhan dan insulin like growth factor 1
4 (IGF-1) yang bersirkulasi, kandungan gula darah yang tinggi, glukokortikoid, dan estradiol ataupun estrogen lainnya. Lokasi tempat produksi hormon-hormon pada adenohipofisis teleostei ditunjukkan pada Gambar 1. Kandungan GH dalam tubuh ikan berkisar antara 0,2-111,2 ng/ml plasma darah (Björnsson et al. 1988; Takahashi et al. 1991; Farbridge et al. 1992; Björnsson et al. 1998; Björnsson et
al. 2000; Einarsdottir et al. 2002; Arnesen et al. 2003; Drennon et al. 2003;
Nordgarden et al. 2005).
Beberapa pengaruh hormon pertumbuhan dalam tubuh antara lain meningkatkan retensi kalsium, meningkatkan massa otot, merangsang lipolisis, meningkatkan sintesis protein, merangsang pertumbuhan dari seluruh organ internal kecuali otak, berperan dalam pemenuhan homeostasi, mengurangi pengambilan glukosa oleh hati, merangsang glukoneogenesis dalam hati, berkontribusi dalam pemeliharaan dan fungsi dari islet pankreatik, dan merangsang sistem imun. Selain pertumbuhan yang lambat, kekurangan hormon pertumbuhan juga dapat menghambat pematangan seksual.
Gambar 1. Lokasi tempat produksi hormon-hormon pada adenohipofisis teleostei (Rosenfeld et al. 2007); PRL= prolactin, TSH= thyroid-stimulating
hormone, GH= growth hormone, FSH= follicle-stimulating hormone,
LH= luteinizing hormone, N= neurohypophysts, PI= pars intermidia, PPD= proximal pars distalis, RPD= rostral pars distalis
5 2.3 Teknologi Protein Rekombinan
DNA rekombinan merupakan hasil dari suatu fragmen DNA yang mengandung gen yang akan diklon dan diinsersikan pada molekul DNA sirkular yang disebut vektor (Brown 2003). Vektor tersebut bertindak sebagai wahana yang membawa gen masuk ke dalam sel tuan rumah yang bisa berupa bakteri maupun sel jenis lainnya. Dalam sel inang tersebut, vektor melakukan replikasi dan menghasilkan banyak kopi atau tiruan yang identik, baik vektor itu sendiri maupun gen yang dibawanya. Ketika sel inang membelah, kopi molekul DNA rekombinan diwariskan pada progeni dan terjadi replikasi vektor selanjutnya. Pembelahan sel tersebut akan menghasilkan koloni atau klon sel yang identik. Kloning dan ekspresi GH rekombinan telah berhasil didapatkan dari beberapa ikan antara lain ikan rainbow trout (Sekine et al. 1985), ikan tuna (Lin et al. 1995), ikan indian catfish (Anathy et al. 2001), ikan mas (Li et al. 2003), ikan mas koki (Chan et al. 2003), ikan beronang (Funkenstein et al. 2005), dan ikan nila merah (Acosta et al. 2007).
Langkah-langkah untuk mendapatkan DNA rekombinan terdiri dari beberapa tahap yaitu isolasi gen yang akan diinsersikan, preparasi vektor, pembuatan sel kompeten, ligasi, transformasi, isolasi plasmid ataupun cracking, dan kloning (Glick & Pasternak 2003). Isolasi gen merupakan langkah awal untuk mendapatkan DNA rekombinan. Gen tersebut diisolasi dari organisme yang akan digunakan dengan menggunakan primer yang disusun berdasarkan data dari bank gen. Jika gen yang akan diisolasi dari suatu spesies tertentu telah diketahui urutan nukleotidanya, maka primer yang akan digunakan untuk mengisolasi gen target dapat langsung disusun berdasarkan data tersebut. Akan tetapi, jika data mengenai gen suatu spesies belum ada, maka primer dapat disusun berdasarkan data nukleotida dari gen target yang sama tetapi berasal dari beberapa spesies yang berbeda.
Brown (2003) menyatakan bahwa vektor merupakan molekul DNA sirkular yang terdapat bebas dalam sel bakteri. Seluruh vektor memiliki paling sedikit 1 rangkaian DNA yang dapat bertindak sebagai asal replikasi sehingga mampu memperbanyak diri di dalam sel dan tidak tergantung pada kromosom bakteri. Vektor yang terbaik untuk wahana kloning ialah vektor yang memiliki ukuran
6 kurang dari 10 kb. Akan tetapi, pada keadaan tertentu dapat digunakan plasmid yang lebih besar untuk kloning.
Salah satu vektor yang biasa digunakan sebagai vektor kloning adalah pGEM-T Easy (Gambar 2) dan sebagai vektor ekspresi adalah pCold I DNA (Takara) (Gambar 3). Sebagai vektor kloning, pGEM-T Easy memiliki kelebihan timin yang menggantung di ujungnya yang terbuka sehingga penempelan gen insersi tidak memerlukan enzim restriksi, sedangkan pCold I sebagai vektor ekspresi merangsang ekspresi gen yang diinsersikan dengan memanfaatkan promotor turunan yang berasal dari gen cspA yang merupakan salah satu gen
cold-shock. Karena vektor ini memanfaatkan promotor turunan dari E. coli, maka
banyak strain E. coli yang dapat dimanfaatkan sebagai host ekspresi. pCold I mengandung TEE, sekuens His-Tag, dan situs pembelahan Faktor Xa (Takara 2009).
7 Gambar 3. Peta vektor pCold I (Takara 2009)
2.4 Efek rGH pada Pertumbuhan Ikan
Penggunaan rGH untuk memacu pertumbuhan ikan sudah banyak dilakukan. Pemberian 0,5% rGH dalam pakan yang diberikan selama 12 minggu pada juvenil ikan sea bream hitam menunjukkan perbedaan bobot sebesar 41,67% dari ikan kontrol setelah pemeliharaan selama 18 minggu (Tsai et al. 1997). Menurut Sekine et al. (1985), pemberian rGH pada ikan rainbow trout dapat meningkatkan pertumbuhan sebesar 50% dibandingkan dengan ikan rainbow trout yang tidak diberi perlakuan rGH, sedangkan pada benih ikan beronang, pemberian rGH sebesar 0,5 µg/g bobot tubuh sebanyak 1 kali per minggu selama 4 minggu dapat meningkatkan bobot tubuh sebesar 20% dari kontrol (Funkenstein et al. 2005).
Pemberian rGH ikan mas sebesar 0,1 µg/g bobot tubuh yang diproduksi dalam Pichia pastoris pada benih ikan nila dapat meningkatkan bobot tubuh sebesar 53,1% dibandingkan dengan kontrol (Li et al. 2003). Pemberian rGH tersebut dilakukan baik melalui injeksi (Sekine et al. 1985; Tsai et al. 1995;
8 Leedom et al. 2002; Li et al. 2003; Funkenstein et al. 2005), melalui pakan (Tsai
et al. 1997; Xu et al. 2001), ataupun melalui perendaman (Acosta et al. 2007).
2.5 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
merupakan metode yang cepat, murah, dan mudah dikerjakan untuk mengkuantifikasi, membandingkan, dan mengkarakterisasi protein berdasarkan berat molekul dan pergerakan elektroforetiknya (Bollag et al. 1996; Wikipedia 2009b). Bahan pembuat gelnya yaitu polyacrylamide, merupakan material yang sama yang digunakan dalam pembuatan lapisan elektroda dan contact lens. PAGE merupakan gel sintetis, transparan, kuat, dan dapat dibuat untuk berbagai ukuran pori. Ukuran pori ini dibuat berdasarkan berat protein yang akan dianalisa.
Tabel 1. Rentang resolusi optimal PAGE (Bollag et al. 1996) Konsentrasi Akrilamid (% gel) Resolusi Pemisahan (kDa) 15 12,5 10 7,5 5 15-45 15-60 18-75 30-120 60-212
SDS merupakan agen pemisah yang biasa digunakan untuk mengubah sifat protein asli menjadi polipeptida individual. Tanpa SDS, protein berbeda dengan berat molekul yang sama akan mengalami migrasi yang berbeda sesuai dengan perbedaan rasio massa, dimana masing-masing protein memiliki nilai isoelektrik dan berat molekul partikular sesuai dengan struktur primernya (Wikipedia 2009b).
