Pr
Pr
in
in
s
s
ip
ip
im
im
un
un
ol
ol
og
og
i
i
pa
pa
d
d
a
a
pe
pe
m
m
er
er
ik
ik
s
s
aa
aa
n
n
lab
lab
ora
ora
tor
tor
ium
ium
kli
kli
nik
nik
Dewi K Paramita
Dewi K Paramita
Deparment of Histology and Cell Biology
Deparment of Histology and Cell Biology
Faculty of Medicine UGM
Faculty of Medicine UGM
Pr
Pr
in
in
si
si
p
p
im
im
un
un
ol
ol
og
og
i
i
pa
pa
da
da
pe
pe
me
me
ri
ri
ks
ks
aa
aa
n
n
la
la
bo
bo
ra
ra
to
to
ri
ri
um
um
kl
kl
in
in
ik
ik
1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi pada
1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi pada
bebera
bebera
pa teknik
pa teknik
pemeriksaan imunologi
pemeriksaan imunologi
2.Berbagai macam labeling dan
2.Berbagai macam labeling dan
dete
dete
ksi pada
ksi pada
pemeriksaan dengan teknik imunologi
pemeriksaan dengan teknik imunologi
3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia dan
3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia dan
immunofluorescence assay
Pr
Pr
in
in
si
si
p
p
im
im
un
un
ol
ol
og
og
i
i
pa
pa
da
da
pe
pe
me
me
ri
ri
ks
ks
aa
aa
n
n
la
la
bo
bo
ra
ra
to
to
ri
ri
um
um
kl
kl
in
in
ik
ik
1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi pada
1. Prinsip pengenalan antigen oleh antibodi pada
bebera
bebera
pa teknik
pa teknik
pemeriksaan imunologi
pemeriksaan imunologi
2.Berbagai macam labeling dan
2.Berbagai macam labeling dan
dete
dete
ksi pada
ksi pada
pemeriksaan dengan teknik imunologi
pemeriksaan dengan teknik imunologi
3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia dan
3. Contoh deteksi dengan imunohistokimia dan
immunofluorescence assay
T
T
ekn
ekn
ik
ik
Im
Im
uno
uno
log
log
i
i
(immunoassay)
(immunoassay)
Metode
Metode
deteksi antigen / protein
deteksi antigen / protein
dalam sel, jaringan atau
dalam sel, jaringan atau
pr
pr
ot
ot
ei
ei
n
n
t
t
er
er
la
la
ru
ru
t
t
ol
ol
eh
eh
antibodi
antibodi
se
se
ba
ba
g
g
ai
ai
re
re
ag
ag
en
en
sp
sp
es
es
if
if
ik
ik
(i
(i
nt
nt
er
er
ak
ak
si
si
an
an
ti
ti
ge
ge
n-
n-
an
an
ti
ti
bo
bo
di
di
)
)
ya
ya
ng
ng
div
div
is
is
ua
ua
li
li
sa
sa
si
si
de
de
ng
ng
an
an
ma
ma
rk
rk
er
er
y
y
an
an
g
g
di
di
la
la
be
be
l
l
pa
pa
da
da
an
an
ti
ti
bo
bo
di
di
,
,
mi
mi
sa
sa
ln
ln
y
y
a
a
pe
pe
w
w
ar
ar
na
na
fluorescent, enzim atau partikel emas, dll.
Prinsip teknik imunologi
Deteksi
antigen/protein
:
antigen
dikenali
oleh
antibodi
(Ab)
spesifik
sebagai probe
Molekul antibodi
tidak
nampak
divisualisasi
dengan label
Antibodi
Daerah pengenalan spesifik
terhadap antigen
Sumber antigen/protein yang akan dideteksi
Sel
Jaringan
Protein terlarut (dalam darah blood, serum, cairan
Macam teknik pemeriksaan imunologi &
sumber antigen
Sumber antigen
Teknik imunodeteksi
Jaringan
Imunohistochemistry
(IHC)
Protein terlarut
ELISA
Immunoblotting
immunoprecipitation
Sel
FACS
Komponen penting pada teknik
imunologi
antigen
Antibodi primer
Antibodi sekunder (jika perlu)
Label : Enzim,
fluorescence
, dll
Metode dasar pada teknik imunologi
Direct
Indirect
Sandwich
Direct method
(metode langsung)
Label pada antibodi
primer
Keuntungan:
Cepat
Spesifik
Kerugian:
Perlu antobodi primer
Indirect method
(metode tidak langsung)
Label pada antibodi sekunder
Keuntungan
Lebih sensitif
Antibodi sekunder
dapat
digunakan untuk
bermacam-macam
immunoassay
(jika
antibodi primer dari spesies
yang sama)
Kerugian:
Reaksi silang antibodi sekunder
dengan Ig
endogenous
pada
spesimen
Capture
atau
Sandwich
(ELISA)
•
Untuk mendeteksi substansi
yang jumlahnya sangat kecil,
contoh: sitokin
•
Antibodi primer spesifik yang
mengenali antigen dilekatkan
pada plate
Faktor penting pada teknik imunologi
Pengenceran antibodi (konsentrasi antibodi)
Inkubasi antibodi
Waktu
Suhu
Enzim & substrat, fluorochrom & filter
Kontrol positif
Label pada immunoassay
LabelRadioaktif
Coloidal gold
Virus particle
Ferritin
Fluorescent
Enzyme
Label pada immunoassay
Immunoassay Label
Westernblotting Enzim (HRP atau alkaline phosphatase)
ELISA Enzim, biotin/streptavidine Immunofluorescence Fluorescence dyes
Immunohistochemistry Enzim, biotin/streptavidine
Pemilihan deteksi antibodi:
Pemilihan deteksi antibodi:
direct
atau
indirect
Direct:
label pada antibodi primer
Aplikasi : flow cytometri
Keuntungan:
Lebih spesifik
background staining lebih
sedikit
Indirect
:
Label pada antibodi sekunder
Aplikasi : imunostaining
Keuntungan:
Lebih sensitif amplifikasi sinyal signifikan
Aplikasi lebih felksibel label dapat bermacam-macam
Label dapat berupa fluorescence, biotin, atau enzim yang
dikonjugasi pada antibodi sekunder.
Kerugian:
Background lebih tinggi
nonspecific binding dari antibodi primer dan sekunder
Keuntungan & kerugian
Bagian dari antibodi yang di label
Gugus amin primer (-NH2) pada residu lisin di daerah N terminus.
Gugus sulfuhydril (-SH) pada residu sistein terbentuk secara selektif pada ikatan bisulfid di daerah hinge region
Residu karbohidrat yang mengandung cis-diol dapat dioksidasi (-CHO)
menjadialdehid aktif terlokalisasi pada daerah Fc banyak ditemukan pada antibodi poliklonal
Pemilihan tipe sinyal untuk deteksi:
substrat kolorimetrik atau fluorescence
Labeling dengan enzim
Keuntungan : shelf life yang panjang Sensitivitas tinggi
Visualisasi langsung tidak membutuhkan alat yang canggih (contoh alat: spektrofotometer)
Dibanding label radioaktif tidak berbahaya
Label enzim yang kecil dapat melewati membran memungkinkan untuk deteksi intraseluler
Visualisasi enzim dengan substrat dapat bertahan lama hingga bertahun-tahun
Kerugian :
Melibatkan multiple assay steps
Kadang menggunakan sustrat yang berbahaya
Memungkinakan adanya gangguan dari enzim endogenus Enzim memberikan resolusi yang buruk pada
Labeling dengan enzim:
HRP v.s AP
HRP AP
Ukuran 40 kDa 140 kDa
Harga Relatif murah Relatif mahal Stabilitas
(penyimpanan)
Stabil pada suhu < 0°C
Tidak stabil pada suhu < 0°C
Macam substrat Banyak Sedikit/terbatas Kinetika Cepat lambat
pH 5-7 8-10
Labeling dengan biotin
Biotin adalah vitamin dengan berat 244 dalton
Banyak ditemukan di jaringan dan darah
Mempunyai afinitas yang besar dengan protein
avidin, streptavidin
ikatan terjadi cepat dan tidak
terganggu dengan perubahan pH extrem, pelarut
organik dan agen denaturasi lain.
Molekul kecil
dapat dikonjugasi dengan banyak
protein tanpa mengganggu aktivitas protein
Labeling dengan biotin:
IHC Avidin-biotin method
Labeling
dengan fluorescent
Molekul antibodi dapat
dilabel dengan berbagai
macam probe flourecent
Setiap probe fluorescent
mempunyai spektrum
sinyal eksitasi dan emisi
Contoh labeling dengan fluorescein
isothiocyanate (FITC)
Fluorescenct probes
The maximum excitation and
emission wavelength of
commonly used fluorescent
Contoh metode imunohistokimia dan
immunofluorescence assay
EBNA1-IHC (OT1x Mab)
LMP1-IHC (OT21C Mab)
Contoh Prosedur imunohistokimia
LABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method
I. DeparafinisationXylene (2 x 10 mins)
Ethanol absolute (2 x 5 mins) 95% ethanol (2 x 5 mins)
II. H2O2/ methanol (15 mins) RINSE with DISTILLED WATER Tris buffer wash (2 x 10 mins) III. Antigen Retrieval
Tris buffer wash (2 x 10 mins) IV. Blocking solution (10 min)
(Normal non-immune serum) Tris buffer wash (2 x 10 mins)
V. IHC staining proper
Primary Antibody (variable) Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Biotinylated Link Antibody (30 mins) Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Streptavidine-Peroxidase (30 mins) Tris buffer wash (2 x 10 mins)
DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins) Rinse with water
Hematoxyline
Rinse with water (dan/ atau dehidrasi) Mounting
Meminimalisir
background staining
Bloking aktivitas
endogenous peroxidase
peroxidase dan pseudo-peroxidase pada jaringan normal
Contoh Prosedur imunohistokimia
LABELED STREPTAVIDIN-BIOTIN Method
I. DeparafinisationXylene (2 x 10 mins)
Ethanol absolute (2 x 5 mins) 95% ethanol (2 x 5 mins)
II. H2O2/ methanol (15 mins) RINSE with DISTILLED WATER Tris buffer wash (2 x 10 mins) III. Antigen Retrieval
Tris buffer wash (2 x 10 mins) IV. Blocking solution (10 min)
(Normal non-immune serum) Tris buffer wash (2 x 10 mins)
V. IHC staining proper
Primary Antibody (variable) Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Biotinylated Link Antibody (30 mins) Tris buffer wash (2 x 10 mins)
Streptavidine-Peroxidase (30 mins) Tris buffer wash (2 x 10 mins)
DAB/AEC - Chromogens (5-10 mins) Rinse with water
Hematoxyline
Rinse with water (dan/ atau dehidrasi) Mounting
Meminimalisir
background staining
Bloking
non-specific background staining
Paling sering terjadi: Protein melekat pada kolagen &
jaringan ikat
diatasi denga pemberian
non-immune
serum
Sebab lain : pengenceran antibodi yang tidak tepat
(terlalu pekat), langkah pencucian yang tidak tepat,
langkah deparafinisasi yang tidak tepat.
Immunoassay with fluorescence labeled
Immunofluorescence assay (IFA): teknik imunostaining
dengan label fluorescence
pengamatan dengan
mikroskop fluorescence
Immunofluorescence Assay
Labeled antibody with a
fluorescence visible marker:
i.e. Fluorescein isothianate
(FITC)
Disadvantage:
Limited to frozen sections
Requires special microscopy
Poor morphologic resolution
