RESPONSIVITAS DAN KAPASITAS EMBRIOGENESIS MIKROSPORA
BEBERAPA GENOTIPE CABAI (Capsicum spp.)
PADA SISTEM KULTUR SEBAR-MIKROSPORA
HAKIIM BASHAAR
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
ABSTRAK
HAKIIM BASHAAR. Responsivitas dan Kapasitas Embriogenesis Mikrospora Beberapa Genotipe Cabai (Capsicum spp.) pada Sistem Kultur Sebar-Mikrospora. Dibimbing oleh ENCE DARMO JAYA SUPENA dan HADISUNARSO.
Cabai besar kultivar Tanjung-2 dan cabai keriting kultivar Big Chili dari Capsicum annuum, serta cabai rawit tipe hijau kultivar Bara dan tipe putih kultivar Hot Chili dari Capsicum frutescens diuji responsivitas dan kapasitas embriogenesis mikrosporanya dengan prosedur kultur sebar-mikrospora untuk memproduksi tanaman haploid ganda (HG). Sebagai kontrol digunakan cabai besar HG Galaxy. Ciri morfologi sebagai penanda stadia mikrospora dengan populasi uninukleat akhir lebih dari 50 % pada beberapa genotipe cabai (Capsicum spp.) adalah ketika antera berwarna hijau kekuningan dengan warna ungu pada bagian ujungnya yang terdapat pada kuncup bunga saat daun mahkotanya sedikit lebih panjang dari daun kelopaknya. Induksi androgenesis berhasil dilakukan terhadap kultivar yang dicobakan kecuali pada cabai rawit Bara. Responsivitas terbaik diperlihatkan oleh cabai besar kultivar Tanjung-2 (58 %) yang tidak berbeda nyata dengan HG Galaxy (53 %) dengan rata-rata jumlah embrio lengkap masing-masing 2.2 dan 4.1 embrio per kuncup bunga. Secara umum responsivitas cabai besar lebih baik dibandingkan dengan cabai keriting, dan cabai keriting lebih baik daripada cabai rawit.
ABSTRACT
HAKIIM BASHAAR. Responsitivity and capacity of pepper (Capsicum spp.) microspore embryogenesis in shed-microspore culture system. Under supervision of ENCE DARMO JAYA SUPENA and HADISUNARSO.
Two cultivars of species Capsicum annuum (large hot pepper Tanjung-2 and curly pepper Big Chili) and two cultivars of species Capsicumfrutescens (green type of chili pepper Bara and white type of chili pepper Hot Chili) were tested for its responsitivity and microspore embryonic capacity in the shed-microspore culture procedure to produce double haploid (DH) plant. Large type DH Galaxy was used as control. Morphological marker for the proper developmental stages of microspores which contained more than 50 % in the late unicellular stage of pepper genotypes (Capsicum spp.) was the appearance of purple color on the tips of anthers from the flower buds when the length of petals slightly longer than that of sepals. Induction of androgenesis was occured in all cultivars tested except Bara. The best responses were showed by Tanjung-2 (58 %) which is not statistically different from Galaxy (53 %) with normal embryo yield 2.2 and 4.1 embryos per flower, respectively. Generally, large hot pepper was more responsive than curly pepper, and curly pepper was more responsive than chili pepper.
RESPONSIVITAS DAN KAPASITAS EMBRIOGENESIS MIKROSPORA
BEBERAPA GENOTIPE CABAI (Capsicum spp.)
PADA SISTEM KULTUR SEBAR-MIKROSPORA
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada Departemen Biologi
HAKIIM BASHAAR
G34102071
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008
Judul : Responsivitas dan Kapasitas Embriogenesis Mikrospora Beberapa
Genotipe Cabai (
Capsicum
spp.) pada Sistem Kultur Sebar-Mikrospora
Nama : Hakiim Bashaar
NIM
: G 34102071
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, MSi.
Ir. Hadisunarso
NIP 131851278
NIP 130779512
Mengetahui,
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr.Drh. Hasim, DEA
NIP 131578806
PRAKATA
Segala puji dan syukur penulis ucapkan ke-Hadirat Allah SWT atas rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Shalawat dan salam kepada suri tauladan terbaik Nabi Muhammad SAW dan semoga terlimpahkan pula kepada keluarga dan para sahabatnya serta orang-orang yang mengikuti jejak mereka sampai hari kemudian.
Meskipun luas lahan tanaman cabai di Indonesia relatif stabil yaitu lebih dari 150 000 ha per tahun, produktivitas cabai berfluktuasi. Ini menunjukkan ada persoalan dalam budidaya cabai. Skripsi ini berjudul “Responsivitas dan Kapasitas Embriogenesis Mikrospora Beberapa Genotipe Cabai (Capsicum spp.) pada Sistem Kultur Sebar-Mikrospora”, dan merupakan sebuah pendekatan teknologi dalam usaha meningkatkan produktivitas dan kualitas tanaman cabai Indonesia yang berbasis pada pengembangan kultivar lokal.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, MSi. dan Ir. Hadisunarso atas segala bimbingan dan fasilitas yang diberikan untuk menunjang penelitian penulis sampai terselesaikanya skripsi ini. Terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr. Ir. Juliarni, MAgr. selaku dosen penguji atas masukan untuk perbaikan karya ilmiah ini. Terima kasih penulis sampaikan kepada staf dan karyawan Departemen Biologi: Pak Joni, Pak Agus, Pak Edi, Mbak Yuni, Mbak Yeni atas bantuan dan kerjasamanya. Terima kasih penulis sampaikan kepada staf dan rekan-rekan penelitian di PPSHB : Pak Adi, Pak Mulya, Mbak Pepy, Pak Muzuni, mas Firda, mas Yasir, Mbahrelfi, mbak Budi, Popy, Ammay, Ussy, Jaya dan masih banyak rekan lainya yang tidak dapat penulis sebutkan. Saya senang bisa mengenal kalian dan menjalani masa-masa penelitian bersama yang tidak terlupakan. Terima kasih penulis sampaikan kepada teman-teman seperjuangan di “kota hujan”: “Bio ‘39”, Tedi, Arif RH, Zaki, Yudi, Bekti, Yandi, Hasyim, Putra, Selamet, Ode, Rozi, Gani, Rahmadi, Rusidi, Udin, Rama atas kebersamaan dan pengalaman yang menyenangkan selama ini, semoga kita bisa sukses bersama di masa-masa yang akan datang. Terima kasih kepada semua pihak yang telah membantu hingga selesainya studi penulis di “kampus rakyat” ini
Terakhir, rasa terima kasih dan hormat yang sebesar-besarnya penulis sampaikan kepada keluarga tercinta, Mamah, Papah, adik-adikku: Febrie Subhan, Okke Maulana, dan Ahmad Fathan Mubina. Serta tante Ela dan paman Eka atas segala doa, semangat dan kasih sayang yang membuat penulis dapat menyelesaikan skripsi ini.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Januari 2008
Hakiim Bashaar
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 29 Nopember 1983 merupakan anak pertama dari empat bersaudara, dari pasangan Endang Suardi dan Sri Sukmawati.
Tahun 1996 penulis lulus dari SD Negeri Pisangan II Ciputat. Tahun 1999 penulis lulus dari SLTP Negeri I Ciputat. Tahun 2002 penulis lulus dari SMU Widuri Jakarta Selatan dan pada tahun yang sama penulis diterima di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur SPMB.
Saat mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah Genetika Dasar untuk program sarjana selama tiga semester pada tahun ajaran 2005-2007, dan juga untuk program pascasarjana mahasiswa Biologi BUD selama dua semester pada tahun ajaran 2006/2007. Penulis juga menjadi ketua Bidang Kewirausahaan dari Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) pada tahun ajaran 2004/2005.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... vii
DAFTAR GAMBAR ... vii
PENDAHULUAN ... 1
BAHAN DAN METODE Bahan Tanaman dan Sumber Antera ... 1
Pengamatan Morfologi Kuncup Bunga dan Antera Serta Perkembangan Mikrospora ... 1
Prosedur Kultur Sebar-Mikrospora ... 2
Perkecambahan dan Pertumbuhan Tanaman ... 2
Pengamatan dan Analisis Data ... 2
HASIL Hubungan Morfologi Kuncup Bunga dan Antera dengan Stadia Mikrospora ... 2
Embriogenesis Mikrospora ... 2
Stadia Mikrospora dan Antera pada Kultur Cabai Rawit ... 3
PEMBAHASAN ... 6
SIMPULAN ... 6
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Tahapan perkembangan mikrospora pada beberapa fase perkembangan kuncup bunga tanaman cabai besar HG Galaxy………... 3 2 Penampilan beberapa genotipe cabai (Capsicum spp.) untuk vitalitas, responsivitas dan
kapasitas embriogenesis mikrospora pada kultur sebar-mikrospora………. 4 3 Tahapan perkembangan mikrospora pada beberapa stadia perkembangan kuncup bunga
tanaman cabai rawit (Capsicumfrutescens)……….. 5
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Morfologi bunga cabai HG Galaxy pada beberapa fase perkembangan a. Kuncup bunga sebelum dilepas daun kelopak dan mahkotanya, b. Kuncup bunga setelah dilepas daun kelopak dan mahkotanya. Garis skala = 5 mm………... 3 2 Embriogenesis mikrospora beberapa genotipe cabai (Capsicum spp.) dengan metode KSM
dan tanaman yang dihasilkan dari embriogenesis mikrospora : a. embrio HG Galaxy; b. embrio dan kecambah kultivar Tanjung-2; c. embrio kultivar Big Chili; d. embrio pada kultivar Hot Chili; e. tanaman berasal dari hasil KSM cabai kultivar Tanjung-2. Karakter-karakter embrio: el (embrio lengkap); et (embrio tidak lengkap); ek (embrio yang telah berkecambah). Garis skala: a-d = 3 mm, e = 4 cm... 4 3 Morfologi bunga cabai rawit kultivar Hot Chili pada beberapa fase perkembangan a.
Kuncup bunga sebelum dilepas daun kelopak dan mahkotanya, b. Kuncup bunga setelah dilepas daun kelopak dan mahkotanya. Garis skala = 2 mm………... 5 4 Morfologi antera pada kultur kultivar Bara umur 7 minggu (a) dan HG Galaxy umur 4
PENDAHULUAN
Cabai merupakan tanaman sayuran terpenting di Indonesia baik dinilai dari nilai ekonomi maupun luas areal pertanamannya. Pada tahun 2004, luas areal pertanaman cabai mencapai 194 588 ha atau sekitar 19.9 % dari total luas areal tanaman sayuran (Deptan 2005). Produktivitas cabai pada tahun 2006 sebesar 5.0 ton/ha (http://faostat.fao.org). Pro-duktivitas ini ternyata masih lebih rendah apabila dibandingkan dengan rata-rata produk-tivitas negara di Asia seperti India (9.2 ton/ha), Thailand (14 ton/ha), dan Cina (20.6 ton/ha). Oleh karenanya diperlukan usaha untuk meningkatkan produktivitas dan kualitas tanaman cabai Indonesia, salah satunya adalah dengan mengembangkan kultivar lokal yang sudah banyak dikenal dan dibudidayakan oleh masyarakat.
Pengembangan kultivar lokal tanaman cabai melalui penelitian genetik dan pemuliaan memerlukan galur murni yang terjamin keseragaman genetiknya. Pem-bentukan galur murni dapat dilakukan secara konvensional melalui proses penyerbukan sendiri terkendali, namun dibutuhkan waktu sedikitnya 5-7 generasi. Teknologi haploid, yaitu regenerasi embrio dari gamet untuk menghasilkan tanaman haploid dan haploid ganda merupakan alternatif untuk mening-katkan efisiensi dan efektivitas pembentukan galur murni karena hanya membutuhkan 1-2 generasi (Ochoa-Alejo & Ramirez-Malagon 2001).
Penelitian untuk menghasilkan tanaman haploid dan HG pada cabai melalui kultur antera pada media padat telah banyak dilakukan, namun metode ini masih sangat bergantung pada genotipe, yaitu spesifik untuk jenis paprika (Sibi et al. 1979; Dumas de Vaulx et al. 1981; Gyulai et al. 2000). Metode kultur antera pada media padat ini dilaporkan tidak responsif pada kultivar cabai besar dan bahkan beberapa genotipe paprika (Qin & Rotino 1993, Ltifi & Wenzel 1994).
Supena et al. (2006a) berhasil mengem-bangkan prosedur untuk memproduksi tanaman haploid ganda varietas lokal cabai Indonesia dengan menggunakan metode kultur sebar-mikrospora. Prosedur ini menggunakan antera yang dikulturkan pada media dua lapis, yaitu media cair di atas media padat. Selanjutnya dalam masa inkubasi, antera akan membuka secara normal dan mikrosporanya tersebar ke media. Mikrospora ini kemudian akan berkembang
menjadi embrio, dan setelah dikecambahkan dan dipindahtanamkan akan menjadi tanaman utuh. Prosedur kultur sebar-mikrospora ini sangat potensial digunakan sebagai langkah awal untuk mengembangkan cabai varietas hibrida berbasis kultivar lokal maupun dicobakan pada spesies lain pada genus Capsicum.
Penelitian ini bertujuan mempelajari responsivitas dan kapasitas embriogenesis mikrospora beberapa genotipe cabai dari spesies Capsicum annuum L. maupun spesies Capsicum frutescens L. pada kondisi lokal di Bogor dengan menerapkan prosedur kultur sebar-mikrospora yang dikembangkan oleh Supena et al. (2006a)
BAHAN DAN METODE
Bahan Tanaman dan Sumber AnteraGenotipe cabai yang digunakan adalah cabai besar kultivar Tanjung-2 dan cabai keriting kultivar Big Chili yang termasuk spesies C. annuum; cabai rawit tipe hijau Bara dan cabai rawit tipe putih Hot Chili yang termasuk spesies C. frutescens, serta cabai besar haploid ganda (HG) Galaxy (Supena et al. 2006a) sebagai kontrol atau genotipe model. Penanaman cabai dan pemelihara-annya dilakukan pada lahan terbuka di Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB, Kampus IPB Darmaga, Bogor.
Pengamatan Morfologi Kuncup Bunga dan Antera Serta Perkembangan Mikrospora
Pengamatan untuk menentukan tahapan perkembangan mikrospora dilakukan pada tanaman model HG Galaxy, yang selanjutnya digunakan sebagai standar pada penelitian ini. Bunga cabai dikelompokkan menjadi enam tahap perkembangan berdasarkan morfologi kuncup bunga dan warna ungu pada antera. Mikrospora diisolasi dari masing-masing antera kelompok kuncup bunga untuk selanjutnya DNA inti sel mikrospora di-warnai dengan 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Stadium perkembangan mikrospora diamati dibawah mikroskop fluoresens (Nikon Eclipse E-600) dengan filter UV.
Pengamatan tahapan perkembangan mikrospora cabai rawit dilakukan setelah hasil akhir kultur menunjukan responsivitas sangat rendah pada cabai rawit putih Hot Chili dan tidak didapatkannya pertumbuhan embrio pada cabai rawit hijau Bara.
Prosedur Kultur Sebar-Mikrospora
Media. Media yang digunakan adalah
media dua lapis (Supena et al. 2006a) yaitu lapisan bawah berupa media padat yang mengandung komponen Nitsch (Nitsch & Nitsch 1969) dan maltosa 20 g/l dengan penambahan arang aktif 10 g/l, dan agar gelrite 2 g/l. Sedangkan pada lapisan atas berupa media cair dengan komponen sama seperti pada media padat, kecuali tanpa arang aktif dan agar. Untuk mengatasi kontaminasi digunakan kombinasi antibiotik rifampisin (10 mg/l) dan timentin (400 mg/l).
Isolasi Antera. Kuncup bunga yang
digunakan sebagai sumber eksplan adalah kuncup bunga dengan antera yang mengandung lebih dari 50 % mikrospora stadium uninukleat akhir (Supena et al. 2006a). Karakterisasi untuk stadia ini adalah adanya warna ungu pada antera, yaitu pada kelompok perkembangan ke-2 dan ke-3 (Gambar 1). Kuncup bunga diberi pra-perlakuan suhu dingin dengan interval 5-10oC selama satu hari yang diletakkan pada wadah tertutup yang berisi kertas lembab. Proses isolasi antera dilakukan pada kondisi steril di dalam laminar. Kuncup bunga didesinfeksi selama 1 menit dalam etanol 70 %, kemudian dibilas 2 kali dalam akuades steril. Desinfeksi dilanjutkan dalam NaOCl 2 % selama 15 menit dengan penambahan Tween-20 0.05 % (v/v), kemudian dibilas 3 kali dalam akuades secara bertahap selama 1, 5, dan 10 menit. Proses isolasi antera dari kuncup bunga yang sudah disterilisasi dilakukan dengan cara mengelupas kelopak dan mahkota serta melepaskan filamennya. Pada setiap cawan petri dikulturkan satu kuncup bunga (5-6 antera)
Inkubasi dan Produksi Embrio. Antera
hasil isolasi dikulturkan dalam sistem media dua lapis dan diinkubasi pada suhu dingin dengan interval 6-11oC selama seminggu, selanjutnya dipindahkan pada suhu 25-28oC dan diinkubasi dalam kondisi gelap. Embrio yang terbentuk dalam masa inkubasi dipanen pada 7-8 minggu setelah kultur untuk selanjutnya dikecambahkan.
Perkecambahan dan Pertumbuhan Tanaman
Embrio dikecambahkan di dalam medium yang mengandung elemen MS ½ konsentrasi (Murashige & Skoog 1962), sukrosa 20 g/l dan 6-benzylaminopurin (BA) 0.1 μM, di-padatkan dengan gelrite 2 g/l. Kultur dilaku-kan pada botol kultur berdiameter 6 cm dan diinkubasi pada suhu 25-28oC dengan
pen-cahayaan selama 16 jam. Setelah tiga sampai empat minggu bibit yang telah berdaun 4-5 helai dan memiliki perakaran yang baik dipin-dahkan ke dalam botol plastik bening berdiameter 8 cm dan tinggi 11 cm dengan media campuran tanah, kasting dan arang sekam (1:1:1) setebal 4-5 cm yang dilembabkan dengan air. Kemudian botol ditutup dengan botol plastik bening dengan ukuran yang sama pada posisi terbalik dan diantara dua botol dililitkan plastik untuk menutup celah udara. Selanjutnya botol penutup dibuka secara bertahap. Tanaman pada stadium berdaun 5-6 helai siap diaklimatisasi dan ditanam didalam pot di rumah kaca.
Pengamatan dan Analisis Data
Perkembangan kultur diamati setiap minggu. Setelah kultur berumur 7-8 minggu, embrio yang terbentuk diamati dan dihitung. Embrio dikelompokkan ke dalam dua kate-gori yaitu embrio lengkap dan embrio tidak lengkap. Embrio lengkap merupakan embrio yang memiliki radikula, hipokotil, kotiledon, epikotil dan plumula yang akan berkembang menjadi tanaman normal. Sedangkan embrio tidak lengkap adalah embrio yang tidak mempunyai kotiledon.
Data hasil pengamatan dianalisis meng-gunakan analisis sidik ragam dan uji beda nyata terkecil (BNT) dengan program komputer SPSS versi 14.0.
HASIL
Hubungan Morfologi Kuncup Bunga dan Antera dengan Stadia Mikrospora
Hubungan perkembangan stadia mikro-spora dengan ciri morfologi kuncup bunga dan warna antera pada tanaman model haploid ganda (HG) Galaxy disajikan pada Gambar 1 dan Tabel 1. Mikrospora stadia uninukleat akhir didapati sebesar 48.5 % pada tahap ke-1 perkembangan kuncup bunga. Persentase ini semakin meningkat pada tahap ke-2 (60.1 %) dan ke-3 (66.7 %), dan kemudian menurun pada tahap ke-4 (42.8 %). Mikrospora stadia uninukleat akhir tidak dapat diamati lagi pada tahap ke-5 dan ke-6, karena pada tahap ini mikrospora telah menjadi polen dan bahkan juga terdapat mikrospora yang sudah tidak berinti.
Embriogenesis Mikrospora
Embriogenesis mikrospora melalui me-tode KSM berhasil dilakukan pada tanaman cabai kontrol serta tiga dari empat genotipe
Gambar 1 Morfologi bunga cabai HG Galaxy pada beberapa fase perkembangan. a. Kuncup bunga sebelum dilepas daun kelopak dan mahkotanya, b. Kuncup bunga setelah dilepas daun kelopak dan mahkotanya. Garis skala = 5 mm.
Tabel 1 Tahapan perkembangan mikrospora pada beberapa fase perkembangan kuncup bunga tanaman cabai besar HG Galaxy
Keterangan : UL: uninukleat awal, UH: uninukleat pertengahan, UR: uninukleat akhir, BL: binukleat awal, BH: binukleat pertengahan, PM: polen matang dengan inti generatif dan vegetatif, PT: Polen tidak berinti. Data merupakan rata-rata dari 20-25 sel mikrospora.
yang dicobakan dalam penelitian ini. Hasil analisis memperlihatkan bahwa terdapat pengaruh genotipe terhadap respon embriogenesis dan vitalitas kultur. Respon embriogenesis terbesar dimiliki oleh kultivar Tanjung-2 sebesar 58 % yang tidak berbeda nyata dengan HG Galaxy (53 %) dan Big Chili (44 %), sedangkan respon terkecil terdapat pada Hot Chili sebesar 19 % serta tidak menunjukkan respon (0 %) terdapat pada Bara (Tabel 2).
Dalam hal vitalitas kultur (ketahanan terhadap kontaminasi) tanaman kontrol lebih tahan dibandingkan dengan vitalitas keempat genotipe lainnya. Pada HG Galaxy 60 % dari petri yang dikulturkan terbebas dari kontaminasi. Nilai vitalitas kultur terendah terdapat pada kultivar Big Chili (26 %) dan Hot Chili (24 %) (Tabel 2). Jumlah embrio responsif per petri terbanyak dihasilkan oleh HG Galaxy yaitu 7.1 embrio dan yang terkecil dihasilkan oleh kultivar Hot Chili yaitu 1.3
embrio (Tabel 2). Hasil ini menunjukkan bahwa genotipe berpengaruh terhadap kemampuan produksi embrio. Untuk kualitas embrio yang dihasilkan, yang diukur dari persentase embrio lengkap (Gambar 2a-c), kultivar Tanjung-2 (64.4 %) memiliki nilai yang tidak berbeda dengan HG Galaxy (57.5 %).
Tanaman hasil metode kultur sebar-mikrospora berhasil didapatkan dari cabai kultivar Tanjung-2 (Gambar 2e). Hasil pengamatan jumlah kloroplas pada sel penjaga stomata daun didapatkan rata-rata 10.2 buah kloroplas per stomata (2 sel penjaga).
Stadia Mikrospora dan Antera pada Kultur Cabai Rawit
Rendahnya respon embriogenesis pada cabai rawit kultivar Hot Chili serta tidak terjadinya respon pada kultivar Bara pada awalnya diduga disebabkan oleh pemilihan stadia mikrospora yang tidak tepat
Tahap perkembangan kuncup bunga
Warna ungu pada antera Tahapan perkembangan mikrospora (%)
UL UH UR BL BH PM PT
1 Belum ada 6.0 45.5 48.5 0 0 0 0
2 Hanya tipis pada bagian ujung 14.2 25.7 60.1 0 0 0 0 3 Sekitar ¼ panjang antera 0 33.3 66.7 0 0 0 0 4 Seluruh antera berwarna ungu 0 0 42.8 28.6 28.6 0 0 5
Warna ungu memucat pada kuncup dengan mahkota
yang akan mekar 0 0 0 0 0 68.0 32.0 6 Warna ungu memucat pada kuncup yang baru mekar 0 0 0 0 0 35.0 65.0
4 5 6 3 2 1
a
b
berdasarkan ciri morfologi kuncup bunga dan warna ungu dari tanaman model HG Galaxy. Namun, berdasarkan hasil pengamatan diketahui bahwa lebih dari 50 % mikrospora cabai rawit kultivar Hot Chili dan Bara terdapat pada stadia uninukleat akhir. Nilai ini masih berada dalam standar HG Galaxy (Gambar 3 dan Tabel 3). Mikrospora stadia uninukleat akhir kultivar Hot Chili sebesar 71.4 % terdapat pada tahap perkembangan kuncup bunga ke-2 dan semakin meningkat hingga tahap ke-4 (100 %). Data yang sama juga terlihat pada kultivar Bara, yaitu stadia uninukleat akhir sebesar 77.8 % terdapat pada
tahap perkembangan ke-3 dan meningkat pada tahap perkembangan ke-4 (85.7 %). Dengan demikian penggunaan tahap perkembangan ke-2 dan ke-3 pada cabai rawit telah mewakili stadia mikrospora yang diinginkan.
Penampilan morfologi tanaman kultivar Bara menunjukkan pertumbuhan yang sehat dan tahan terhadap penyakit keriting, tetapi perkembangan anteranya dalam kultur in vitro tidak seperti antera yang berasal dari tanaman cabai lainya (Gambar 4a). Dinding antera dapat membuka secara normal dan tidak ter-kontaminasi sampai 7-8 minggu setelah kultur tetapi embrio tidak dihasilkan dari antera ini.
Tabel 2
Penampilan beberapa genotipe cabai (Capsicum spp.) untuk vitalitas, responsivitas dankapasitas embriogenesis mikrospora pada kultur sebar-mikrospora
Keterangan: 1= 1 kuncup bunga (5-6 antera) per petri; 2 = dari jumlah petri awal, 3 = dari jumlah petri tidak kontaminasi. Angka yang diikuti dengan huruf yang sama pada kolom yang sama, tidak berbeda nyata berdasarkan hasil uji BNT pada ά = 0.05.
Gambar 2 Embriogenesis mikrospora beberapa genotipe cabai (Capsicum spp.) dengan metode KSM dan tanaman yang dihasilkan dari embriogenesis mikrospora : a. embrio HG Galaxy; b. embrio dan kecambah kultivar Tanjung-2; c. embrio kultivar Big Chili; d. embrio pada kultivar Hot Chili; e. tanaman berasal dari hasil KSM cabai kultivar Tanjung-2. Karakter-karakter embrio: el (embrio lengkap); et (embrio tidak lengkap); ek (embrio yang telah berkecambah). Garis skala: a-d = 3 mm, e = 4 cm
Genotipe Jumlah total kultur (petri)1 Kultur tidak kontaminasi 2 (%) Kultur terjadi respon embriogenesis 3 (%) Rata-rata embrio per kuncup Rata-rata embrio lengkap per kuncup Embrio lengkap (%) Galaxy 103 60 a 53 a 7.1 4.1 57.5 Tanjung-2 94 48 ab 58 ab 3.5 2.2 64.4 Big Chili 68 26 b 44 ab 1.9 0.6 33.3 Hot Chili 66 24 b 19 bc 1.3 0.3 25.0 Bara 79 42 ab 0 c 0 0 0
e
el
et
ek
b
et
d
a
el
et
et
c
el
el
Gambar 3 Morfologi bunga cabai rawit kultivar Hot Chili pada beberapa fase perkembangan. a. Kuncup bunga sebelum dilepas daun kelopak dan mahkotanya, b. Kuncup bunga setelah dilepas daun kelopak dan mahkotanya. Garis skala = 2 mm.
Tabel 3 Tahapan perkembangan mikrospora pada beberapa stadia perkembangan kuncup bunga tanaman cabai rawit (Capsicumfrutescens)
Keterangan : UL: uninukleat awal, UH: uninukleat pertengahan, UR: uninukleat akhir, BL: binukleat awal, PM: polen matang dengan inti generatif dan vegetatif, PT: Polen tidak berinti. Data merupakan rata-rata dari 15-20 sel mikrospora.
Gambar 4 Morfologi antera pada kultur kultivar Bara umur 7 minggu (a) dan HG Galaxy umur 4 minggu (b). Garis skala = 0.9 mm.
Genotipe Tahap perkembangan kuncup bunga
Tahapan perkembangan mikrospora (%) UL UH UR BL PM PT Hot Chili (cabai rawit putih) 1 100 0 0 0 0 0 2 0 28.6 71.4 0 0 0 3 0 25.0 75.0 0 0 0 4 0 0 100 0 0 0 5 0 0 25.0 75.0 0 0 6 0 0 0 0 91.0 9.0 Bara (cabai rawit hijau) 1 100 0 0 0 0 0 2 29.4 52.9 17.6 0 0 0 3 0 22.2 77.8 0 0 0 4 0 0 85.7 14.3 0 0 5 0 0 0 0 100 0 6 0 0 0 0 100 0
4
5
6
3
2
1
b
a
a
b
PEMBAHASAN
Salah satu faktor yang sangat mempe-ngaruhi keberhasilan induksi androgenesis melalui kultur antera ataupun isolasi mikro-spora adalah penggunaan stadia per-kembangan mikrospora yang tepat. Untuk cabai, stadia kuncup bunga atau antera yang tepat adalah yang mengandung lebih dari 50 % mikrospora tahap uninukleat akhir (Supena et al. 2006a). Hasil pengamatan pada HG Galaxy, ciri morfologi bunga untuk stadia populasi mikrospora tersebut adalah ketika daun mahkotanya sedikit lebih panjang dari kelopaknya, dan ketika antera berwarna hijau kekuningan dengan warna ungu pada ujungnya. Hasil ini sesuai dengan yang dilaporkan oleh Supena et al. (2006a) dan berlaku umum untuk kultivar cabai besar (Sibi et al. 1979, Andrezejewski & Mol 1985, Dolcet-Sanjuan et al. 1997, Tipirdamaz & Ozkum Ciner 2001, Kim et al. 2004, Supena et al. 2006a). Kedua ciri morfologi bunga ini selanjutnya digunakan untuk genotipe cabai lainnya dan bahkan terbukti berlaku untuk spesies yang berbeda yaitu C. frutescens.
Pengaruh genotipe terhadap induksi androgenesis pada penelitian ini terlihat dari variasi respon yang dihasilkan oleh masing-masing genotipe. Secara umum terlihat bahwa responsivitas dan kapasitas embriogenesis mikrospora cabai besar lebih baik dibanding-kan dengan cabai keriting, dan cabai keriting lebih baik daripada cabai rawit. Rendahnya responsivitas dan kapasitas embriogenesis mikrospora pada kultivar Hot Chili serta tidak terjadi respon pada Bara dalam penelitian ini, kemungkinan disebabkan oleh pengaruh genotipe, karena dugaan faktor lain seperti tidak samanya stadia perkembangan mikro-spora cabai rawit dengan menggunakan standar ciri morfologi dan warna antera cabai besar, tidak terbukti. Selain itu, meskipun kultur yang tidak terkontaminasi pada kultivar Bara mencapai 42 %, tidak ditemukan respon sama sekali.
Tingginya tingkat kontaminasi yang terjadi pada penelitian ini diduga berhubungan dengan kondisi pertumbuhan tanaman. Penggunaan lahan terbuka sebagai tempat tanam dan dugaan adanya bakteri endofitik merupakan alasan mengapa masih terdapat tingkat kontaminasi yang cukup tinggi dalam penelitian ini. Bakteri endofitik merupakan bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman. Bakteri ini umumnya tidak segera mengkon-taminasi kultur pada periode-periode awal, tetapi mengkontaminasi pada periode selanjutnya (Leifert & Cassells 2001).
Penggunaan kombinasi antibiotik Rifampisin (10 mg/l) dan Timentin (400 mg/l) belum sepenuhnya mampu mengatasi kontaminasi kultur, walaupun menurut laporan Supena et al. (2006b) kombinasi antibiotik Rifampisin (10 mg/) dan Timentin (200 mg/l) sudah mampu menekan kontaminasi hingga 82 % pada kultur antera cabai yang ditumbuhkan di rumah kaca.
Cabai rawit kultivar Hot Chili dan Bara termasuk tanaman menahun, sehingga memiliki masa generatif yang panjang. Pada penelitian ini kedua kultivar tersebut masih digunakan melebihi periode pembungaan optimal untuk kultivar cabai besar dan keriting yang berkisar antara 4-5 bulan. Penggunaan kuncup bunga dari tanaman tua pada kultur kedua kultivar cabai rawit tersebut kemungkinan mempengaruhi respon yang terjadi pada penelitian ini.
Tanaman dari embrio yang dihasilkan melalui metode kultur sebar-mikrospora berhasil didapatkan pada kultivar Tanjung-2. Untuk menentukan tingkat ploidi tanaman ini dilakukan penghitungan jumlah kloroplas per stomata daun yang mengacu pada Supena et al. (2006b). Berdasarkan hasil penghitungan, tanaman ini memiliki rata-rata 10.2 kloroplas per stomata yang menunjukkan tanaman haploid. Jumlah kloroplas ini mendekati nilai yang diukur oleh Supena et al. (2006b) yaitu rata-rata 9.0 untuk tanaman haploid dan 17.0 untuk tanaman haploid ganda atau diploid pada cabai kultivar Galaxy.
SIMPULAN
Ciri morfologi sebagai penanda lebih dari 50 % mikrospora stadia uninukleat akhir pada beberapa genotipe cabai (Capsicum spp.) adalah ketika antera berwarna hijau kekuningan dengan warna ungu pada bagian ujungnya yang terdapat pada kuncup bunga dengan daun mahkotanya sedikit lebih panjang daripada daun kelopaknya. Induksi androgenesis berhasil dilakukan terhadap tiga kultivar anggota C. annuum dan satu kultivar anggota C. frutescens. Responsivitas terbaik diperlihatkan oleh cabai besar kultivar Tanjung-2 dengan nilai responsivitas (58 %) yang tidak berbeda nyata dengan nilai responsivitas HG Galaxy (53 %). Sedangkan rata-rata jumlah embrio lengkap kultivar Tanjung-2 2.2 dan HG Galaxy 4.1 embrio per kuncup bunga. Secara umum responsivitas cabai besar lebih baik dibandingkan dengan cabai keriting, dan cabai keriting lebih baik daripada cabai rawit.
DAFTAR PUSTAKA
Andrzejewski RP, Mol R. 1985. Embryological analysis of developmental stages in floral buds of sweet pepper (Capsicum annuum L.). Bull of the Polish Acad of Sci Bio Sci 33:1-6.
[Deptan] Departemen Pertanian. 2005. Statistik Pertanian 2005. Jakarta: Deptan. Dolcet-Sanjuan R, Claveria E, Huerta A.
1997. Androgenesis in Capsicum annuum L.-Effects of carbohydrate and carbon dioxide enrichment. J Amer Soc Hort Sci 122: 468-475.
Dumas de Vaulx R, Chambonnet D, Pochard E. 1981. Culture in vitro d’anthères du
piment (Capsicum annuum L.):
amélioration des taux d’obtention de plantes chez différents génotypes par des traitements à +35 oC.
Agronomie 1: 859-864. (Dalam bahasa Perancis dilengkapi dengan abstrak berbahasa Inggris)
Gyulai G, Gémesné JA, Sági ZS, Venezel G, Pintér P, Kristóf Z, Törjék O, Heszkey I, Bottka S, Kriss J, Zatykó L. 2000. Doubled haploid development and PCR-anlaysis of F1 hybrid derived DH-R2 paprika (Capsicum annuum L.) lines. Plant Physiol 156:168-174.
Kim M, Kim J, Yoon M, Choi DI, Lee KM. 2004. Origin of multicellular pollen and pollen embryos in cultured anthers of pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cell Tiss Org Cult 77: 63-72.
Leifert C, Cassells AC. 2001. Microbial Hazards in Plant Tissue and Cell Cultures. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 37:133-138.
Ltifi A, Wenzel G. 1994. Anther culture of hot and sweet pepper (Capsicum annuum L.): Influence of genotype and plant growth temperature. Capsicum and Eggplant Nwsl 13: 74-77.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assay with tobacco tissue culture. Physiol Plant 15:473-497.
Nitsch JP, Nitsch C. 1969. Haploid plants from pollen grains. Science 163: 85-87. Ochoa-Alejo N, Ramirez-Malagon R. 2001. In
vitro chili pepper biotechnology. In Vitro Cell Dev Biol-Plant 37:701-729.
Qin X, Rotino GL. 1993. Anther culture of several sweet and hot pepper genotypes. Capsicum and Eggplant Nwsl 12: 59-62. Sibi M, Dumas de Vaulk R, Chambonnet D.
1979. Obtention de plantes haploïdes par androgenèse in vitro chez le piment (Capsicum annuum L.). Ann Amelior Plantes 29:583-606. (Dalam bahasa Perancis dilengkapi dengan abstrak berbahasa Inggris)
Supena EDJ, Suharsono S, Jacobsen E, Custers JBM. 2006a. Succesful development of a shed-microspore culture protocol for double haploid production in Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.). Plant Cells Rep 25:1-10.
Supena EDJ, Muswita W, Suharsono S, Custers JBM. 2006b. Evaluation of crucial factors for implementing shed-microspore culture of Indonesian hot pepper (Capsicum annuum L.) cultivars. Scientia Horticulturae 107: 226-232.
Tipirdamaz R, Ciner O. 2002. The effect of cold treatment and charcoal on the in vitro androgenesis of pepper (Capsicum annuum L.). Turk J Bot 26: 131-139.
