Lampiran A. Data Persentase Kesakitan Ikan. Ulangan Perlakuan I II III

(1)

Perlakuan

Ulangan

% Total Kesakitan % Rata-Rata Kesakitan

I II III Po(Kontrol) 0 0 0 0 0 pH 6,0 100 90 100 290 96,67 pH 6,5 80 100 90 270 90,00 pH 7,0 90 100 80 270 90,00 pH 7,5 80 90 100 270 90,00 pH 8,0 100 80 80 260 86,67 pH 8,5 60 60 70 190 63,33 Keterangan:

a. Waktu pengamatan dilakukan selama 6 hari dan dicatat kesakitan ikan setiap hari. b. Jumlah ikan pada awal perlakuan sebanyak 10 ekor per akuarium

(2)

Tests of Normality(b) Perlakuan

Kolmogorov-Smirnov(a) Shapiro-Wilk _Sig. Statistic df Sig. Statistic df

Kesakitan pH 6.0 0,384815 3 . 0,75 3 -4,2E-16 pH 6,5 0,174678 3 . 1 3 1 pH 7,0 0,174678 3 . 1 3 1 pH 7,5 0,174678 3 . 1 3 1 pH 8,0 0,384815 3 . 0,75 3 -4,2E-16 pH 8,5 0,384815 3 . 0,75 3 -4,2E-16 a. Liliefors significance Correction

b. Kesakitan is contant when perlakuan = Po. It has been omitted

Npar Tests Kruskal-Wallis Test Perlakuan N Mean Rank Kesakitan Po 3 2 pH 6,0 3 16,83333 pH 6,5 3 13,66667 pH 7,0 3 13,66667 pH 7,5 3 13,66667 pH 8,0 3 12,16667 pH 8,5 3 5 Total 21

Test Statisticsa,b

Kesakitan Chi-Square 14,18141 df 6 Asymp. Sig. 0,027674 a. Kruskal Wallis Test

(3)

Rank

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan Po pH 6,0 Total 3 3 6 2,00 5,00 6 15 a. Not corrected for ties

b. Grouping Variable: Perlakuan

Test Statisticb

Kesakitan

Mann-Whitney U 0

Wilcoxon W 6

Z -2,12132

Asymp. Sig. (2-tailed) 0,033895 Exact Sig. [2*(1-tailed

Sig.)] 0,1a

a. Not corrected for ties

Npar Test (Mann-Whitney Test) Rank

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan Po pH 6,5 Total 3 3 6 2,00 5,00 6 15 Test Statisticsb Kesakitan Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W 6 Z -2,08683

Sig.)] 0,1a

(4)

Rank

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan Po pH 7,0 Total 3 3 6 2,00 5,00 6 15 Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W 6 Z -2,08683 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,036904 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,1a a. Not corrected for ties

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan Po pH 7,5 Total 3 3 6 2,00 5,00 6 15 Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W 6 Z -2,08683

Sig.)] 0,1a

(5)

Rank

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan Po pH 8,0 Total 3 3 6 2,00 5,00 6 15

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan Po pH 8,5 Total 3 3 6 2,00 5,00 6 15 Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W 6 Z -2,12132

Sig.)] 0,1a

c. Not corrected for ties

d. Grouping Variable: Perlakuan Test Statistics(b)

Kesakitan

Mann-Whitney U 0

Wilcoxon W 6

Z -2,12132

(6)

Rank

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan pH 6,0 pH 6,5 Total 3 3 6 4,17 2,83 12,50 8,50 Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 2,5 Wilcoxon W 8,5 Z -0,94281

Sig.)] 0,4a

a. Not corrected for ties b. Grouping Variable:

Sig.)] 0,4a

(7)

Rank

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan pH 6,0 pH 7,5 Total 3 3 6 4,17 2,83 12,50 8,50

Sig.)] 0,400a

b. Grouping Variable: Perlakuan Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 2,5 Wilcoxon W 8,5 Z -0,94281 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,345779 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,4a

(8)

Rank

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan pH 6,0 pH 8,5 Total 3 3 6 5,00 2,00 15,00 6,00 Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 0 Wilcoxon W 6 Z -2,0226

Sig.)] 0,100a

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan pH 6,5 pH 7,0 Total 3 3 6 3,50 3,50 10,50 10,50 Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U 4,500 Wilcoxon W 10,500 Z ,000

Sig.)] 1,000a

(9)

Rank

Sig.)] 1,000a

Sig.)] 0,7

(10)

Rank

Asymp. Sig. (2-tailed) 1,000 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 1,000a a. Not corrected for ties

b. Grouping Variable: Perlakuan Test Statistics(b)

Kesakitan

Mann-Whitney U 0

Wilcoxon W 6

Z -1,99263

(11)

Ranks

Npar Test (Mann-Whitney Test) Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan pH 7,0 pH 7,5 Total 3 3 6 5,00 2,00 15,00 6,00 Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U ,000 Wilcoxon W 6,000 Z -1,993

Asymp. Sig. (2-tailed) ,046 Exact Sig. [2*(1-tailed

Sig.)] ,100a

c. Not corrected for ties

d. Grouping Variable: Perlakuan Test Statistics(b)

Kesakitan

Mann-Whitney U 3,500

Wilcoxon W 9,500

Z -,471

(12)

Ranks

Npar Test (Mann-Whitney Test) Ranks

b. Grouping Variable: Perlakuan Test Statistics(b)

Kesakitan

Mann-Whitney U 3,500

Wilcoxon W 9,500

Z -,471

Sig.)] ,700a Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U ,000 Wilcoxon W 6,000 Z -1,993

(13)

Ranks

Perlakuan N Mean Rank Sum of Rank Kesakitan pH 8,0 pH 8,5 Total 3 3 6 5,00 2,00 15,00 6,00 Test Statistics(b) Kesakitan Mann-Whitney U ,000 Wilcoxon W 6,000 Z -2,023

Asymp. Sig. (2-tailed) ,043 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] ,100a a. Not corrected for ties

(14)

Amplikasi RNA dibagi menjadi dua reaksi protokol dalam mesin RT-PCR yaitu: a. Protokol suhu reaksi PCR tahap I:

42°C 30 menit; 94°C 2 menit, kemudian 94°C 30 detik; 62°C 30 detik; 72°C 30 detik, ulangi 20 siklus, kemudian tambahkan 72°C 30 detik; 20°C 30 detik pada akhir siklus.

b. Profil suhu reaksi PCR tahap 2 (Nested PCR):

94°C 20 detik; 62°C 20 detik; 72°C 30 detik, ulangi 30 siklus, kemudian tambahkan 72°C 30 detik; 20°C 30 detik pada akhir siklus.

Persiapan Reagent

a. RT-PCR Reaction: 8 µL/reaksi

RT-PCR Pre-Mixed Reagent : 7,0 µL IQzymeTM, 2 unit/µL : 0,5 µL Reverse Transcriptase (RT) Mix Enzim : 0,5 µL b. Nested PCR Reaction: 15 µL/reaksi

Nested PCR Pre-Mixed Reagent :14 µL IQzymeTM, 2 unit/µL : 1 µL

(15)

Metode menurut Malole et al., (2006)

Diambil organ mata dan otaknya Digerus dengan mortal

Ditambahkan NaCl fisiologis

Disentrifugasi pada 3.000 rpm selama 15 menit pada suhu 5°C

Diambil supernatan

Disaring dengan miliphore 0,45 µm

Ditambahkan antibiotik penicilin 10.000 IU dan Streptomicin µl tiap mililiter suspensi Disimpan dalam deef freezer suhu -40ºC Hasil

Inokulan baku virus Virus konsentrasi 10% Ikan kerapu macan positif VNN

(16)

50

Metode Menurut Reed and Muench dalam Amrullah (2004)

Diinfeksi virus VNN dengan konsentrasi masing-masing 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 sebanyak 0,1 ml/ekor Diamati gejala klinis dan dicatat kematian

Dihitung nilai FID50

Hasil

(17)

Metode Menurut Benjamin (1983) 1. Penentuan Hemoglobin

Dimasukkan ke dalam 2 cuvet

Dimasukkan sampel 10 µl ke dalam cuvet pertama Dimasukkan akuades 10 µl ke dalam cuvet kedua

Dihomogenkan masing-masing campuran dan dibiarkan selama 3 menit

Diatur spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm Diatur standar

Dinolkan spektrofotometer

Dimasukkan sampel dan dibaca hasilnya

2. Pemeriksaan Hematokrit (PCV)

Dimasukkan ke dalam tabung hemotokrit sebanyak ¾ tabung dan ditutup ujungnya dengan lilin

Disentrifugasi pada 11.000 rpm selama 5 menit

Dilakukan perhitungan nilai supranatan pada microhematocrite reader Working Reagent

Hasil

Darah

(18)

3. Pemeriksaan Eritrosit

Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue

Dihisap larutan Hayem sampai tanda 101 tanpa menimbulkan gelembung udara

Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan

Dibuang cairan yang tidak ikut terkocok

Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung, dimana tetesan pertama dibuang terlebih dulu

Diamati di bawah mikroskop

Dihitung jumlah sel darah merah pada 5 kotak menengah di bagian tengah kamar hitung

Dihitung jumlah eritrosit dengan Rumus: HPA= n x 10.000 Darah

(19)

Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue

Dihisap larutan Turk sampai tanda 11 tanpa menimbulkan gelembung udara

Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan

Dibuang cairan yang tidak ikut terkocok

Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung, dimana tetesan pertama dibuang terlebih dulu

Diamati di bawah mikroskop

Dihitung jumlah sel darah putih pada 4 kotak besar pada bagian pinggir kamar hitung

Dihitung jumlah leukosit dengan Rumus: HPA= n x 50 Darah

(20)

Metode Menurut Suntoro (1983)

Dicuci dengan NaCl 0,9%

Difiksasi (dimasukkan ke dalam fiksatif Buffer Neutral Formalin (BNF) 10% selama 1 jam)

Washing, (dengan menggunakan jaringan dimasukkan ke dalam alkohol 70, 80, 96% selama 1,5 jam

Dehidrasi dilakukan dengan merendam otak alkohol absolut I,II,III selama 1 jam

Clearing dilakukan dengan merendam otak dilakukan dengan xylol I,II,III se1ama 5 jam

Infiltrasi dilakukan dengan merendam otak pada parafin I,II yang dilakukan di dalam oven dengan suhu 56ºC selama 2 jam.

Embedding dilakukan dengan meletakkan otak pada kaset berbentuk segi empat yang telah dipersiapkan sebelumnya sebagai cetakan. Setelah itu, menuang parafin yang telah cair ke dalam kaset tersebut, dan diberi label.

Otak

(21)

Cutting dilakukan dengan memotong blok-blok parafin yang telah di

holder pada mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan

ukuran ketebalan 4 µm.

Attaching dilakukan dengan mengambil beberapa pita parafin dengan

skapel, kemudian diletakkan pada gelas objek, dan dicelupkan pada air dingin dan air hangat. Kemudian diletakkan di atas waterbath beberapa detik untuk melekatkan pita parafin pada objek glass.

Deparafinasi, dilakukan dengan cara mencelupkan preparat ke dalam xylol I, II, III selama 3 menit

Dealkoholisasi, dilakukan dengan mencelupkan preparat ke dalam alkohol absolut I, II, III selama 3 menit

Pewarnaan sediaan otak diwarnai dengan menggunakan Hematoxilin Eosin. Pewarnaan dilakukan dengan cara gelas objek dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxilin Erlich selama 3 menit lalu dicuci dengan dengan air mengalir

Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam.

Diusahakan supaya tidak terdapat gelembung udara. Diamati di bawah mikroskop

Pita Parafin

Hasil Blok parafin

(22)

Dimasukkan 20 mg sampel otak ke dalam tabung mikro 1,5 ml Dilarutkan dengan 500 µl RNA Extraction Solution

Digerus sampai hancur, didiamkan pada suhu kamar selama 5 menit Ditambahkan 100 µl CHCl3, kemudian divortex 20 detik. Biarkan pada suhu kamar selama 3 menit lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit.

Dipipet 200 µl dari fase atas (bagian jernih) ke dalam tabung mikro 0,5 µl yang berisi 200 µl 2-propanol

Divortex sebentar, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 10 menit, lalu dibuang isopropanol tersebut

Dicuci pelet dengan 0,5 ml etanol 75%, kemudian di spin down 9000 rpm selama 5 menit untuk mendapatkan pelet RNA, kemudian dituang etanol dan dikeringkan pelet

Dilarutkan dengan 200 µl ddH2O Otak

(23)

Disiapkan reagent RT-PCR dan Nested PCR sesuai dengan sampel. Untuk setiap campuran reaksi perlu mempertimbangkan 3 standar positif (103, 102 dan 101) dan 1 kontrol negatif (ddH2O atau ragi tRNA).

Dipipet 8 µl reagen RT-PCR ke dalam tabung mikro dan diberi label Ditambahkan 2 µl ekstrak sampel RNA atau standar ke masing-masing campuran reaksi

Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses tahap I (First PCR

Reaction)

Ditambahkan 15 µl reagen Nested PCR untuk setiap tabung setelah tahap I selesai

Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses tahap II (Nested PCR

Reaction)

Ditambahkan 5 µl 6X loading dye untuk masing-masing tabung dan dihomogenkan

(24)

Ditimbang gel agarose sebanyak 2 g

Dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan dilarutkan dengan 100 ml TAE Dipanaskan di dalam microwave sampai berubah bening

Didinginkan pada temperatur ruang sampai temperatur 50°C

Dituang dalam kotak gel dengan ketinggian 0,3-0,5 cm dan ketebalan 0,8 cm

Dimasukkan sisir plastik (comb) ke dalam gel agarose Diangkat comb pada saat gel sudah memadat

Ditambahkan buffer elektroforesis ke dalam kotak gel sampai garis pembatas

Dimasukkan 5 µl marker ke sumur pertama, diikuti kontrol negatif dan sampel sebanyak 8 µl satu per satu

Dilakukan proses elektroforesis pada tegangan 100-150 volt sampai warna biru mencapai ¾ bagian gel

Dikeluarkan gel dari kotak gel

Direndam gel ke dalam campuran 10 µl Ethidium Bromida dan 100 ml akuabides selama 10 menit

Diangkat gel dan dicuci dengan akuades steril

Diletak pada transilluminator UV gelombang untuk membaca hasil akhir

(25)

Sterilisasi Kolam penampungan akuarium

Sentrifugasi PCR Vorteks

Microwave Elektroforesis UV-Transmillator