OPTIMASI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK DAUN SIRSAK (Annona muricata L) DENGAN METODE EKSTRAKSI TEKANAN TINGGI
Witdiastuti1), Ike Yulia Wiendarlina2) dan A.E.Zainal Hasan3) 1)dan2) Program Studi Farmasi FMIPA Universitas Pakuan Bogor
3) Departemen Biofarmaka Institut Pertanian Bogor Universitas Pakuan, Bogor
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh variasi waktu ekstraksi dan perbandingan variasi jumlah serbuk simplisia dengan pelarut akuades pada metode ekstraksi tekanan tinggi terhadap aktivitas antioksidan. Penelitian dibuat 13 perlakuan menggunakan rancangan Response Surface Methodology (RSM) dengan kecocokan model Central Composite
Design (CCD). Hasil penelitian dari ke 13 perlakuan, waktu ekstraksi memiliki pengaruh terhadap
persen rendemen yang dihasilkan, dapat dilihat dari persamaan Y = -51,9692 + 24,2030 X1 +
1,2984 X2, waktu ekstraksi juga memiliki pengaruh terhadap nilai IC50 yang dihasilkan, dapat
dilihat dari Y = 171,983 + 13,828 X1 – 4,110 X2. Hasil analisa persentase rendemen ekstrak dan
nilai IC50 yang optimal menggunakan analisis RSM diduga memiliki waktu ekstraksi 6,3 menit
dan perbandingan serbuk simplisia dengan volume pelarut akuades 1:61,2. Sedangkan hasil aktivitas antioksidan di nilai IC50 optimal diduga pada waktu ekstraksi 4,3 menit dan perbandingan
serbuk simplisia dengan volume pelarut akuadest 1:78,2.
Kata kunci : Optimasi, daun sirsak, flavonoid, RSM (Response SurfaceMethodology) ABSTRACT
This study aims to determine the effect of variations in extraction time and determine the ratio variation amount of simplisia powder with solvent aquadest at high pressure extraction method of antioxidant activity. Research made 13 design Response Surface Methodology (RSM) to match with the model Central Composite Design (CCD). The results of the 13 treatment, the extraction time has an effect on percent of yield produced, could be seen from the equation Y = -51,9692 24,2030 X1 + 1,2984 X2, the extraction time also have an influence on produced IC50
values, can be seen from Y = 171,983 + 13,828 X1 - 4,110 X2. The results of analysis of the percentage of the yield of extract and optimal value of IC50 with RSM analysis suspected have an
extraction time of 6,3 min and simplisia powder ratio with the volume of solvent aquadest 1: 61,2. While the results of antioxidant activity in optimal IC50 value suspected the time of extraction of
4.3 minutes and comparison with the volume of solvent powder simplisia aquadest 1: 78,2.
Keywords: Optimization, Soursop, Flavonoid, RSM (Response SurfaceMethodology).
PENDAHULUAN
Tumbuhan yang dapat dibuat sebagai obat tradisional salahsatunya adalah sirsak. Secara empiris 3-5 lembar daun sirsak direbus dalam 600 mL air hingga menjadi 1 gelas air lalu
diminum dapat menurunkan
kolesterol (Zuhud, 2011).
Uji pendahuluan yang dilakukan oleh Purwatresna (2012) menyatakan bahwa pada daun sirsak (Annona muricata L.) memiliki
kandungan senyawa flavonoid, steroid, alkaloid, tanin dan saponin. Daun sirsak memiliki aktivitas sebagai hipotensi, antispasmodik, antikonvulsant, vasodilator, antimikroba dan antioksidan (Taylor, 2005). Senyawa golongan flavonoid pada daun sirsak mempunyai aktivitas sebagai antioksidan (Aqnes dkk, 2014).
Antioksidan adalah suatu senyawa yang mampu menunda,
memperlambat, atau menghambat reaksi oksidasi (Pokorny et al, 2001). Ekstraksi tekanan tinggi merupakan metode turunan dan penyederhanaan dari metode
Supercritical Fluid Extraction (SFE).
Metode ekstraksi tekanan tinggi menggunakan tekanan dengan rentang 1 hingga 15 bar, dan
ditemukan secara efektif
mempersingkat waktu ekstraksi dan meningkatkan efisiensi proses (Zhang
et al., 2004). Selain metode ekstraksi,
waktu dan jumlah pelarut juga mempengaruhi mutu ekstrak yang dihasilkan.
Pada penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh variasi waktu ekstraksi terbaik dan perbandingan jumlah serbuk simplisia daun sirsak (Annona muricata L) yang digunakan terhadap aktivitas antioksidan yang di ekstraksi dengan metode tekanan tinggi.
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai Juni 2015 bertempat di Laboratorium Farmasi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pakuan, Bogor dan Laboratorium Biofarmaka, Institut Pertanian Bogor (IPB).
Metode
1 Pembuatan Simplisia
Daun sirsak yang diperoleh dari BALITRO. Daun dikeringkan dengan
menggunakan oven, sampai
didapatkan simplisia kering. Simplisia yang sudah disortasi kering kemudian digrinder dan diayak dengan ayakan mesh 80.
2. Ekstraksi Daun Sirsak
2.1 Penentuan Pengaruh Waktu Ekstraksi
10 g serbuk simplisia daun sirsak diekstraksi dengan autoklaf dan akuades sebagai penyari dengan perbandingan penyari 1:30. Tekanan autoklaf diatur pada 1 atm. Ekstraksi pada waktu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12 dan 15 menit. Larutan disaring, filtrat ditambahkan dengan maltodextrin (1:1), dikeringkan dengan vaccum
dryer. Serbuk dibuat dalam larutan
1000 ppm dan dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan dari ekstrak kering yang didapat untuk mengetahui pengaruh waktu terhadap ekstraksi
2.2 Penentuan Perbandingan
Nisbah Terbaik
Perbandingan jumlah simplisia yang digunakan yaitu 1:10, 1:20, 1:30, 1:40 dan 1:50 dari 300 mL akuadest. Di Ekstraksi selama waktu terbaik dengan alat autoklaf yang diukur tekanannya pada 1 atm. Larutan disaring. Filtrat ditambah dengan maltodextrin (1:1), dikeringkan dengan vaccum dryer. Serbuk dibuat dalam larutan 1000 ppm dan dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan dan didapatkan pengaruh perbandingan jumblah serbuk simplisa dengan pelarut pada ekstraksi (Nisbah).
3. Analisis Fitokimia Ekstrak
Kering Daun Sirsak 3.1 Uji Alkaloid
Ekstrak ditambahkan dengan larutanbasa amonia 1% dan kloroform di dalam tabung reaksi, dikocok, kemudian lapisan kloroform (lapisan bawah) dipipet dan ditambahkan HCl 2 N lalu dikocok. Larutan yang didapat dibagi tiga, yaitu sebagai blanko dan sisanya direaksikan masing-masing dengan pereaksi
Mayer dan Dragendorff. Hasil positif dengan pereaksi Mayer menimbulkan endapan putih dan dengan pereaksi Dragendorff menimbulkan endapan berwarna jingga (Soebagio dkk., 2007).
3.2 Uji Flavonoid
Ekstrak ditambahkan dengan serbuk Mg dan HCl 2N kemudian dipanaskan di atas penangas air, setelah itu ditambahkan dengan amil alkohol, dikocok hingga tercampur rata. Hasil positifnya adalah tertariknya warna kuning-merah pada lapisan alkohol (Soebagio dkk., 2007).
3.3 Uji Tanin
Sebanyak 3 mL larutan ekstrak uji dibagi kedalam 3 bagian yaitu tabung A, tabung B,tabung C. Tabung A digunakan sebagai blanko, tabung B direaksikan dengan larutan besi (III) klorida 10%, warna biru tua atau hitam kehijauan menunjukkan adanya tanin dan polifenol, sedangkan pada tabung C hanya ditambahkan garam gelatin. Apabila terbentuk endapan pada tabung C maka larutan ekstrak positif mengandung tanin ( Marliana dkk, 2005).
3.4 Uji Steroid
Pemeriksaan steroid pada ektrak ditambahkan dengan eter lalu dikocok.Lapisan eter diambil dan diuapkan dengan cawan penguap diatas penangas air.Filtrat yang didapat ditambahkan dengan pereaksi Lieberman-Burchard. Hasil positif untuk senyawa steroid ialah timbulnya warna hijau (Soebagio dkk., 2007).
4. Uji Aktivitas Antioksidan
(Molyneux, 2004)
4.1 Pembuatan Larutan
1. Larutan DPPH 1 mM
Ditimbang sebanyak 39,432 mg serbuk DPPH, kemudian dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL dan dilarutkan dengan metanol hingga batas (sebelumnya labu ukur sudah dilapisi aluminium foil).
2. Larutan standar induk untuk Asam Askorbat
Ditimbang ±100 mg asam askorbat dimasukkan ke dalam labu ukur 100 mL, kemudian dilarutkan dengan metanol sampai tanda batas (1000 ppm).
3. Larutan blanko
Dipipet sebanyak 1 mL larutan DPPH 1 mM, ditambahkan metanol
sampai 10 mL, kemudian
dihomogenkan. Larutan blanko diinkubasi pada suhu sekitar 25-30oC (suhu kamar) selama 30 menit
4.2 Penentuan Panjang
Gelombang Maksimum
DPPH
Dipipet 1 mL larutan DPPH 1mM ke dalam labu ukur 10 mL, ditambahkan metanol hingga batas. Larutan diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar, selanjutnya diukur serapan pada daerah 500-520 nm.
4.3 Optimasi Waktu Inkubasi
Dipipet sebanyak 1 mL larutan standar induk vitamin C 100 ppm kemudian ditempatkan dengan metanol sampai tanda batas 10 mL, dihomogenkan. Ditambahkan 1 mL larutan DPPH 1mM, kemudian didiamkan selama waktu optimum pada suhu kamar. Serapan diukur pada panjang gelombang maksimum pada 10, 20, 30, 40, 50 dan 60 menit
sehingga diperoleh waktu serapan optimum yang stabil.
4.4 Pembuatan Deret Larutan
Standar Asam Askorbat
Larutan standar asam askorbat dengan konsentrasi 1; 2; 3; 4 dan 5 ppm dari larutan 1000 ppm, kemudian ditepatkan dengan metanol sampai
tanda batas 10 mL lalu
dihomogenkan. Ditambahkan 1 mL larutan DPPH 1 mM, diinkubasi selama 30 menit dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang yang telah ditentukan.
4.5 Pembuatan Larutan Uji
Dipipet sejumblah ekstrak kering daun sirsak setara 100 mg pada waktu ekstraksi. Dimasukkan kedalam labu ukur 100 mL dan dilarutkan dengan metanol sampai tanda batas (1000 ppm) lalu larutan di saring menggunakan kertas whatman. Dibuat deret 10, 30, 50 dan 70 ppm. Pada labu ditambahkan 1 mL larutan DPPH 1 mM, encerkan menggunakan metanol dan dihomogenkan. Deret larutan uji didiamkan selama waktu
optimum pada suhu kamar
(sebelumnya labu ukur dibungkus alumunium foil). Dilakukan pula pembuatan larutan uji pada ekstraksi dengan perbandingan jumblah serbuk simplisia dengan pelarut seperti diatas.
4.6 Pengujian Antioksidan dengan metode DPPH
Pengujian DPPH menggunakan persamaan :
Nilai IC50 (inhibitor
concentration) diperoleh dari
potongan garis antara 50% daya
hambat dengan sumbu konsentrasi menggunakan persamaan linear (y = bx + a), dimana y = 50 dan x menunjukan IC50.
2 Rancangan Penelitian (Analisis Data)
Pengolahan data yang dihasilkan dengan metode RSM. Response Surface Methodology (RSM) adalah suatu metode optimasi untuk mempelajari hubungan antara respon dengan beberapa faktor yang berpengaruh, memiliki tujuan untuk mengoptimalkan respon tersebut (Montgomery, l99l).
HASIL DAN PEMBAHASAN 1. Hasil Pembuatan Simplisia Daun
Sirsak
Penetapan kadar air simplisia diperoleh 9,15%. Kadar air ekstrak kering berdasarkan waktu ekstraksi berkisar antara 3,75%-5,65% dan berdasarkan perbedaan nisbah berkisar antara 4,47-5,96% dan berdasarkan rancangan perlakuan dengan metode RSM (berkisar antara 3,10%-4,88%. Rata-rata kadar abu yang diperoleh adalah 1,97%.
2. Hasil Ekstraksi
Ekstraksi yang dilakukan pada penelitian terdiri dari 2 faktor, yaitu faktor waktu ekstraksi (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, dan 12 menit) dan perbandingan nisbah bahan baku(g) dalam pelarut 300 ml (1:10, 1:20 1:30, 1:40 dan 1:50).
3. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kering Daun Sirsak.
Pengujian dilakukan setelah didapatkan panjang gelombang maksimum DPPH yaitu pada 515nm dan waktu inkubasi optimum pada 30 menit.Pada penelitian ini digunakan pembanding berupa Vitamin C. Persamaan Vitamin C adalah y= 7,2626x + 12,145 dan nilai r2= 0,9995
Dari persamaan linier didapatkan nilai IC50 asam askorbat sebesar 8,401
µg/mL.
3.1 Hasil Berdasarkan Waktu Ekstraksi
Gambar 2.Penentuan Waktu
Ekstraksi Terbaik
Dari grafik di atas dapat dilihat bahwa dengan perbandingan penyari 1:30 didapatkan waktu ekstraksi terbaik adalah pada waktu 6 menit. Penentuan ini didasari pada menit ke-6 didapatkan nilai IC50 sebesar 69,14
µg/mL.
Tabel 1. Hasil Persen (%) Rendemen
Ekstrak Kering Daun Sirsak.
Pada Tabel 1 dapat dilihat bahwa persen (%) rendemen tertinggi terjadi pada menit ke-6.Peningkatan waktu ekstraksi dapat menurunkan aktivitas antioksidan dan persen (%) rendemen yang dihasilkan.
Waktu ekstraksi pada menit ke-6 yang menghasilkan nilai aktivitas antioksidan maksimum, lalu digunakan sebagai penentuan pengaruh perbandingan nisbah bahan baku(g) dalam pelarut 300 ml (1:10, 1:20 1:30, 1:40 dan 1:50) simplisia terhadap aktivitas antioksidan.
3.2 Hasil Ekstrak Kering
Berdasarkan Perbandingan Nisbah
Gambar 3. Penentuan Perbandingan
Nisbah Terbaik
Dari grafik dapat dilihat bahwa dengan waktu ekstraksi 6 menit perbandingan nisbah terbaik adalah 1:50 yaitu 6 gram serbuk simplisia dalam 300 mL akuadest. Penentuan ini didasari pada hasil nilai IC50
terkecil yang didapatkan. Pada perbandingan nisbah 1:50 didapatkan nilai IC50 sebesar 89,75 µg/mL. Tabel 2. Hasil Persen (%) Rendemen
Ekstrak Kering Daun sirsak
69,14 0 50 100 150 200 250 300 350 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 15 N ila i I C 5 0 waktu (menit) nilai IC 50 89,75 0 50 100 150 200 250 01.10 01.20 01.30 01.40 01.50 N ila i I C 5 0 Perbandingan Nisbah nilai IC 50
Tabel 1 dilihat bahwa persen (%) rendemen tertinggi terjadi pada perbandingan nisbah 1:50 sebesar 63,34%. Hasil ini menyatakan bahwa semakin sedikit serbuk simplisia yang digunakan maka menghasilkan persen (%) rendemen yang semakin besar.
4. Hasil Analisis Fitokimia Tabel 3. Hasil Uji Fitokimia
Flavonoid memberikan hasil positif dengan membentuk warna jingga pada lapisan amil alkohol. Hasil ini sesuai dengan penelitian Ideasanti dkk (1995) dimana hasil isolat golongan flavonoid pada daun sirsak adalah flavonol.
Hasil menunjukan bahwa pengaruh perlakuan lama waktu ekstraksi dan perbandingan nisbah tidak mempengaruhi kandungan senyawa-senyawa yang terdapat di dalam ekstrak kering daun sirsak.
5. Hasil Optimasi Waktu dan
Nisbah Menggunakan RSM Tabel 4. RSM Dengan Kecocokan Model CCD perbandingan nisbah dan waktu ekstraksi
Pada uji waktu ekstraksi terbaik didapatkan 6 menit sebagai waktu ekstraksi terbaik dan pada uji perbandingan nisbah terbaik
didapatkan perbandingan nisbah terbaik sebesar 1:50. Hasil terbaik tersebut dijadikan acuan untuk menentukan batas atas dan batas bawah pada metode analisis RSM. Sehingga didapatkan RSM dengan kecocokan model CCD (Central
Composite Design) .
Tabel 5. Metode Ekstraksi
berdasarkan Waktu Ekstraksi dan Perbandingan Nisbah.
5.1 Hasil Rendemen Ekstrak
. Pada tabel 6 terlihat rendemen maksimum terdapat pada sampel no 5 pada waktu pemanasan 6 menit dan nisbah akuadest – daun sirsak 300 mL. Dan nilai rendemen minimal terdapat pada sampel no 3 pada waktu pemanasan 8 menit dan nisbah akuadest – daun sirsak 300 mL
Tabel 6. Nilai Rendemen Ekstak kering Berdasarkan RSM
5.1.1 Persamaan RSM Rendemen Ekstrak
Rendemen ekstrak kering daun sirsak dilakukan pengujian analisa statistik dengan menggunakan RSM dengan menggunakan kecocokan CCD sehingga diperoleh persamaan :
Y = -51,9692 + 24,2030 X1 +
1,2984 X2
Persamaan RSM menunjukan bahwa perubahan waktu mempunyai pengaruh terhadap hasil ekstrak.Hal ini dapat dilihat dari koefisien waktu ekstraksi (X1) memiliki nilai yang
lebih besar daripada nisbah akuadest – daun sirsak (X2).
Gambar 4.Countour Plot
Response Optimasi rendemen
ekstrak kering
Perhitungan statistik menunjukan bahwa R2 = 56,94 % hasil penelitian menunjukan bahwa 56,94 % merupakan pengaruh dari faktor-faktor perlakuan dan 74,88 % berasal dari faktor-faktor diluar perlakuan yang diamati.
Waktu ekstraksi optimum dan perbandingan nisbah pada rancangan statistik RSM diperoleh dengan waktu 6,3 menit dan nisbah akuadest – daun sirsak 1:61,2 dapat diperoleh rendemen 64,1%.
Gambar 5.Surface Plot 3D untuk
hasil rendemen ekstrak kering Dari gambar 5, tampak bahwa hasil persen (%) rendemen meningkat pada nisbah akuadest – daun sirsak 1:40 sampai berkisar antara 1:70 dan 1:80 dan pada waktu ekstraksi dalam kisaran 5-7 menit.Dan penurunan hasil ekstraksi terlihat setelah pada menit ke 8.
5.2 Hasil Aktivitas Antioksidan
Aktivitas antioksidan
maksimum terdapat pada sampel no 5 pada waktu pemanasan 6 menit dan nisbah akuadest – daun sirsak 3,85 gram : 300 mL yang menghasilkan nilai IC50 sebesar 52,81 µg/mL dan
aktivitas antioksidan minimum terdapat pada sampel no 6 pada waktu ekstraksi 4 menit dan nisbah akuadest – serbuk simplisia 10 gram : 300 mL yang menghasilkan nilai IC50 118,55
µg/mL.
Tabel 7.Hasil Aktivitas Antioksidan Ekstrak kering Daun Sirsak
5.2.1 Persamaan RSM Aktivitas Antioksidan Ekstrak
Aktivitas antioksidan ekstrak kering daun sirsak dilakukan dengan pengujian analisa statistik dengan
menggunakan RSM dengan
menggunakan kecocokan CCD sehingga diperoleh persamaan : Y = 171,983 + 13,828 X1 – 4,110 X2
Persamaan RSM terlihat bahwa perubahaan waktu mempunyai pengaruh terhadap hasil ekstrak sama halnya seperti pada persamaan RSM pada rendemen. Hal ini dapat dilihat dari koefisien waktu ekstraksi (X1)
yang memiliki nilai lebih besar daripada nisbah akuadest – daun sirsak (X2).
Gambar 7.Contour Plot Response
Optimasi Nilai IC50
Perhitungan statistik
menunjukan bahwa R2 = 88,58%
dengan demikian hasil penelitian menunjukan 88,58% merupakan pengaruh dari faktor-faktor perlakuan dan 93,34% berasal dari faktor-faktor diluar perlakuan yang diamati.
Dari Gambar 7 dapat
disimpulkan waktu pemanasan mempengaruhi nilai IC50 dimana
dengan waktu ekstraksi yang semakin lama menghasilkan nilai IC50 > 150,
yang menandakan bahwa antioksidan bersifat kurang aktif. Waktu optimum dan perbandingan nisbah pada rancangan statistik RSM diperoleh yaitu selama 4,3 menit dan nisbah akuadest – daun sirsak 1:78,2 dapat
diperoleh nilai IC50 sebesar 52,8
µg/mL.
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan
a. aktivitas antioksidan tertinggi yaitu 52,81% pada lama waktu ekstraksi 6 menit dan nisbah akuadest – serbuk simplisia daun sirsak sebesar 1:50
b. Hasil analisa persentase
rendemen ekstrak
menggunakan analisis RSM diduga memiliki waktu ekstraksi 6,3 menit dan nisbah akuadest – simplisia serbuk
daun sirsak 1:78,2
menghasilkan rendemen yang optimum sebesar 64,07%.
Saran
1. Perlu dilakukan optimasi aktivitas antioksidan dengan komponen faktor lebih dari dua faktor.
2. Dilakukan uji pendahuluan dengan melibatkan lebih banyak faktor perlakuan terhadap ekstraksi tekanan tinggi.
DAFTAR PUSTAKA
Aqnes, B., Maria, U., Frista, A.O. 2014.Aktivitas Antioksidan Fraksi Klorofrom Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona
muricata L.) dan Identifkasi
Kandungan Senyawa Kimianya.
Jurnal Prosiding SNST ke-5.
Semarang: Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim. Departemen Kesehatan RI. 1979.
Materia Medika Indonesia. Jilid
Pengawasan Obat dan Ma-kanan. Departement Kesehatan Republik Indonesia.
Montgomery DC. 2001. Design and Analysis of Experimental Ed ke-5. New York: JWiley.
Molyneux, P. 2004. The Use of The Stable Free Radical Diphe-nylpicrylhydrazyl (DPPH) for Estimating Antioxidant Activ-ity, Songklanakarin J. Sci.
Technol., 26, 2, 211-219
Pokorny, J., Yanishlieva, N., and Gordon, M. 2001. Antioxidant
in Food : Practical Application.
CRC Press Cambridge. New York
Purwatresna, E., (2012), Aktivitas
Antidiabetes Ekstrak Air dan Etanol Daun Sirsak Secara In Vitro Melalui Inhibisi Enzim α-glukosidase.[skripsi]. Bogor
:Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Soebagio, B., Rusdiana, T. dan
Khairudin. 2007. Pembuatan
Gel Dengan Aqupec HV-505 dari Ekstrak Umbi Bawang Me-rah (Allium cepa, L.) sebagai Antioksidan. Bandung: Fakultas
Farmasi, Universitas Padjadja ran.
Taylor, L. 2005. Technical data
re-port for graviola (Annonamuri cata). Austin: Sage Press.
Zhang, S., Zhu, J., Wang, C., 2004.
Novel high pressure extraction technology. Int. J. Pharm. 278,
471–474.
Zuhud, Evrizal.A.M. 2011. Bukti
Kedahyatan: Sirsak Menumpas Kanker. Jakarta: AgroMedia
