BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Rancangan dan Jenis Penelitian
3.1.1 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah Posttest Only Control Group Design
3.1.2 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah eksperimental laboratorium.
3.2 Lokasi dan Waktu Penelitian
3.2.1 Lokasi Penelitian
Lokasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
1. Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU 2. Laboratorium Lembaga Pusat Penyakit Tropis UNAIR
3.2.2 Waktu Penelitian
Waktu penelitian ini adalah 6 bulan (Agustus 2012 -Januari 2013)
3.3 Populasi dan Sampel
3.3.1 Populasi
Populasi dalam penelitian ini adalah bakteri Enterococcus faecalis
3.3.2 Sampel
Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah koloni adalah bakteri
Enterococcus faecalis ATCC 29212 yang telah diisolasi dan dibiakkan dengan media
Penentuan besar sampel sesuai dengan SOP (Standard Operational Procedure) yang ada di Laboratorium Pusat Penyakit Tropis, Universitas Airlangga. Jumlah pengulangan yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan rumus Walton T Federer (1991):
Keterangan:
t = jumlah kelompok perlakuan dalam penelitian r = banyak replikasi (perlakuan ulang)
Pada penelitian ini digunakan 5 perlakuan, yakni ekstrak etanol siwak dengan konsentrai 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Oleh karena itu banyak replikasi pada penelitian ini adalah sebagai berikut.
(t-1) (r-1) ≥ 15 (5-1) (r-1) ≥ 15 4 (r-1) ≥ 15 r-1 ≥ 15 : 4 r-1 ≥ 3,75 r ≥ 3,75 + 1 r ≥ 4,75
Dari perhitungan di atas diperoleh hasil bahwa banyaknya replikasi pada penelitian ini adalah minimal sebanyak 4,75 kali atau dibulatkan menjadi 5 kali dengan rincian sebagai berikut:
1. Pada penentuan nilai KHM, jumlah keseluruhan sampel adalah 27 sampel yakni:
a. Kelompok 1: ekstrak etanol siwak 20%: 5 sampel b. Kelompok 2: ekstrak etanol siwak 10%: 5 sampel c. Kelompok 3: ekstrak etanol siwak 5%: 5 sampel d. Kelompok 4: ekstrak etanol siwak 2,5%: 5 sampel e. Kelompok 5: ekstrak etanol siwak 1,25%: 5 sampel
f. Kelompok 6: kontrol Mc Farland: 1 sampel
g. Kelompok 7: kontrol negatif (ekstrak etanol siwak tanpa suspensi E. faecalis): 1 sampel
2. Pada penentuan nilai KBM, jumlah keseluruhan sampel adalah 27 sampel yakni:
a. Kelompok 1: ekstrak etanol siwak 20%: 5 sampel b. Kelompok 2: ekstrak etanol siwak 10%: 5 sampel c. Kelompok 3: ekstrak etanol siwak 5%: 5 sampel d. Kelompok 4: ekstrak etanol siwak 2,5%: 5 sampel e. Kelompok 5: ekstrak etanol siwak 1,25%: 5 sampel f. Kelompok 6: kontrol Mc Farland : 1 sampel
3.4 Variabel dan Definisi Operasional
3.4.1 Variabel Penelitian
Variabel bebas
Ekstrak etanol batang siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%
Variabel tergantung
Pertumbuhan bakteri E.faecalis
pada media MHB dan MHA dengan penentuan nilai KHM dan KBM
Variabel terkendali
a. Jenis dan asal batang siwak (Salvadora persica) (Sewak Al-MuslimTM diproduksi di Riyadh, Saudi Arabia)
b. Berat batang siwak sebelum pengeringan (1 kg) dan setelah pengeringan (415 mg)
c. Lama dan suhu pengeringan siwak (1 minggu pada suhu 40oC)
d. Volume etanol yang dipakai (6 liter) e. Konsentrasi etanol yang dipakai
(70%)
f. Waktu perendaman siwak (15 menit) g. Suhu saat perendaman siwak (25oC) h. Waktu perkolasi (2 minggu)
i. Nomor kertas saring yang dipakai (Whatman No.42)
j. Jumlah kertas saring saat perlokasi (3 lapis)
k. Kecepatan tetes cairan dalam perkolator (20 tetes/menit) l. Suhu penguapan rotavapor (46oC) m. Waktu penguapan rotavapor (10 jam)
n. Media pertumbuhan bakteri yaitu
Mueller Hinton Broth dan Mueller Hinton Agar
o. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media p. E. faecalis ATCC 29212
q. Jumlah bahan coba yang diteteskan ke media (MHA=50 µl, MHB=1 ml) r. Suhu inkubasi (37oC)
s. Teknik pembiakan E.faecalis
t. Waktu pembiakan E.faecalis (24 jam) u. Waktu pengamatan (24 jam)
Variabel tidak terkendali
a. Lingkungan (kondisi tanah dan iklim) tempat tumbuh batang siwak b. Usia batang siwak
c. Perlakuan terhadap siwak selama tumbuh
d. Lama penyimpanan siwak sampai proses ekstraksi
e. Suhu penyimpanan siwak sampai proses ekstraksi
f. Lama pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Surabaya g. Suhu saat pengiriman dari bahan
coba sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Surabaya
3.4.2Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah ekstrak etanol batang siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%.
3.4.3Variabel Tergantung
Variabel tergantung pada penelitian ini adalah Pertumbuhan bakteri E.faecalis
pada media MHB dan MHA dengan penentuan nilai KHM dan KBM
3.4.4Variabel Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini terdiri atas:
a. Jenis dan asal batang siwak (Salvadora persica) (Sewak Al-MuslimTM
diproduksi di Riyadh, Saudi Arabia)
b. Berat batang siwak sebelum pengeringan (1 kg) dan setelah pengeringan (415 mg)
c. Lama dan suhu pengeringan siwak (1 minggu pada suhu 40oC) d. Volume etanol yang dipakai (6 liter)
e. Konsentrasi etanol yang dipakai (70%) f. Waktu perendaman siwak (15 menit) g. Suhu saat perendaman siwak (25oC) h. Waktu perkolasi (2 minggu)
i. Nomor kertas saring yang dipakai (Whatman No.42) j. Jumlah kertas saring saat perlokasi (3 lapis)
k. Kecepatan tetes cairan dalam perkolator (20 tetes/menit) l. Suhu penguapan rotavapor (46oC)
m.Waktu penguapan rotavapor (10 jam)
n. Media pertumbuhan bakteri yaitu Mueller Hinton Broth (MHB) dan
Mueller Hinton Agar (MHA)
o. Sterilisasi alat, bahan coba, dan media p. E. faecalis ATCC 29212
r. Suhu inkubasi (37oC)
s. Teknik pembiakan E.faecalis
t. Waktu pembiakan E.faecalis (24 jam) u. Waktu pengamatan (24 jam)
3.4.5Variabel Tidak Terkendali
Variabel terkendali pada penelitian ini terdiri atas:
a. Lingkungan (kondisi tanah dan iklim) tempat tumbuh batang siwak b. Usia batang siwak
c. Perlakuan terhadap siwak selama tumbuh
d. Lama penyimpanan siwak sampai proses ekstraksi e. Suhu penyimpanan siwak sampai proses ekstraksi
f. Lama pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Surabaya
g. Suhu saat pengiriman dari bahan coba sampai ke Laboratorium Pusat Penyakit Tropis Surabaya
h. pH lingkngan saat dilakukan uji sensitivitas bakteri
3.4.6Definisi Operasional
NO VARIABEL DEFINISI OPERASIONAL CARA UKUR SKALA
UKUR
Ekstrak yang diperoleh dengan melarutkan 200 mg ekstrak etanol kental batang siwak dalam 1 ml Mueller Hinton Broth (MHB)
Sesuai SOP Lab.
Ekstrak yang diperoleh dengan mengambil 1/2 dari konsentrasi ekstrak etanol siwak 20% dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP Lab.
Ekstrak yang diperoleh dengan mengambil 1/2 dari konsentrasi ekstrak etanol siwak 10% dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP Lab.
Ekstrak yang diperoleh dengan mengambil 1/2 dari konsentrasi ekstrak etanol siwak 5% dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP Lab.
Ekstrak yang diperoleh dengan mengambil 1/2 dari konsentrasi ekstrak etanol siwak 2,5% dan dilarutkan dalam 1 ml MHB
Sesuai SOP Lab. Pusat Penyakit Tropis UNAIR
NO VARIABEL DEFINISI
OPERASIONAL HASIL UKUR
SKALA
Rasio Visual dengan
menggunakan mikroskop
2. KBM (Kadar
Bunuh Minimal)
Konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 99,9%
Rasio Visual dengan
menggunakan mikroskop (Metode
Drop Plate Mile Mesra)
3.5 Metode Pelaksanaan Penelitian
3.5.1 Bahan Penelitian
Bahan penelitian yang digunakan adalah: 1. Batang siwak 1 kg
2. Etanol 70% 6 liter (Kimia Farma, Indonesia) 3. Akuades 1 liter (Kimia Farma, Indonesia)
4. E. faecalis ATCC 29212 (MediMark®Europe, France) 5. Media Mueller Hinton (Difco, USA)
3.5.2 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: 1. Timbangan (Home Line, China)
2. Timbangan analitik (Vibra, Japan) 3. Kertas perkamen 3 kajang
4. Blender (Panasonic, Japan)
5. Kapas 250 gram (Bio Panca, Indonesia) 6. Kertas saring (Whatman no. 42, England)
7. Aluminium foil 1 gulungan (Total Wrap, Indonesia) 8. Perkolator
9. Erlenmeyer (Pyrex, USA)
11. Electronic balance (Ohyo JP2 6000, Japan dan Denver Instrument Company, USA)
12.Autoklaf (Tomy, Japan)
13.Vortex/whirli mixer (Iwaki model TM-100, Japan) 14.Inkubator CO2 (Sanyo, Japan)
15.Pipet mikro (Gilson, France) 16.Piring petri (Pyrex, Japan) 17.Ose dan spiritus
18.Kaca pembesar (Ootsuka ENV-CL, Japan)
3.5.3 Prosedur Penelitian
3.5.3.1Pembuatan Ekstrak Etanol Batang Siwak
Proses pembuatan ekstrak etanol siwak (Lampiran 2) dilakukan berdasarkan Standar Operasional Prosedur Laboratorium Obat Tradisional Fakultas Farmasi USU dan panduan Farmakope Indonesia tahun 1995 dengan langkah-langkah sebagai berikut.
a. Pembuatan simplisia
Batang siwak dikeluarkan dari kemasannya dan ditimbang sebanyak 1 kg. Batang siwak kemudian dipotong kecil-kecil dan dikeringkan di dalam lemari pengering dengan suhu 40o selama 14 hari. Tanaman dikatakan sudah kering apabila batang siwak telah mudah dipatahkan. Batang siwak yang telah dikeringkan tersebut kemudian ditimbang kembali dan diperoleh 415 gram batang siwak yang telah kering. Selanjutnya batang siwak kering tersebut dimemarkan dengan alat penggiling tradisional dan dihaluskan dengan blender, dan didapat serat-serat halus batang siwak (simplisia).
b. Proses maserasi
c. Proses perkolasi
Setelah 24 jam, perkolator disiapkan dengan cara meletakkan kapas secukupnya pada bagian dasar wadah perkolator, kemudian di atas kapas tersebut diletakkan kertas saring sebanyak 2 lembar. Kemudian massa simplisia yang telah direndam tersebut dipindahkan sedikit demi sedikit ke dalam perkolator dengan hati-hati sambil sesekali ditekan dengan sendok dan di atasnya dilapisi selapis kertas saring. Kemudian etanol 70% dituangkan ke dalam perkolator dan massa disaring dengan lapisan kertas saring sampai cairan tersebut mulai menetes dan di atas simplisia masih terdapat selapis cairan penyari untuk mengetahui apakah perkolator sudah berfungsi dengan baik. Kemudian perkolator ditutup dengan aluminium foil
dan dibiarkan selama 24 jam.
Setelah 24 jam, perkolator dibuka kembali dan cairan dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit atau 20 tetes per menit. Tambahkan berulang-ulang cairan penyari (etanol 70%) secukupnya sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia (pada penelitian ini total etanol 70% yang dituangkan ke dalam simplisia adalah sebanyak 6 liter), hingga diperoleh ekstrak cair (jumlah ekstrak cair yang dihasilkan adalah sebanyak 5 liter).
d. Ekstrak cair diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 46o C selama 5 jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari hingga konsistensi seperti madu. Ekstrak yang telah kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik.
e. Kemudian dibuat pengenceran dengan menggunakan MHB. Hasilnya didapat ekstrak senyawa aktif siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Ekstrak etanol batang siwak dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup lalu disimpan di tempat yang sejuk.
Gambar 8. Bagian siwak
yang diambil
Gambar 9. Penimbangan siwak Gambar 7. Batang siwak dalam
kemasan
Gambar 10. Pemotongan siwak Gambar 11. Pengeringan
siwak dalam lemari pengering
Gambar 14. Penghalusan siwak dengan blender
Gambar 16. Perendaman simplisia Gambar 15. Simplisia
siwak
Gambar 17. Proses perkolasi siwak Gambar 12. Siwak yang telah
dikeringkan
Gambar 13. Siwak dimemarkan dengan alat penggiling tradisional
Gambar 18. Penguapan ekstrak cair
dengan vacuum
3.5.3.2Pembuatan Suspensi Bahan Uji
Ekstrak batang siwak dalam etanol ditimbang menggunakan electronic balance dan massaya disesuaikan dengan konsentrasi yang diinginkan dengan cara dilarutkan dengan media Mueller Hinton Broth (MHB). Mula-mula dilarutkan 200 miligram ekstrak etanol kental batang siwak ke dalam 1 ml MHB untuk mendapatkan konsentrasi 20% ekstrak etanol batang siwak. Kemudian diambil setengah dari konsentrasi 20% dan dilarutkan dalam 1 ml MHB agar diperoleh konsentrasi 10%, dan seterusnya sampai didapat konsentrasi 1,25%. Masing-masing konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung dan diberi label.
3.5.3.3Pembuatan Media Bakteri
Sebelum spesimen dibiakkan, terlebih dahulu dibuat media Mueller Hinton Agar (MHA). Sebanyak 12 gram MHA dilarutkan dalam 240 ml akuades kemudian dituangkan ke dalam petri (20 ml/petri) lalu media disterilkan dalam autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 2 atm dan suhu 121oC. Kemudian media dimasukkan ke dalm inkubator selama 24 jam untuk melihat apakah ada kontaminasi bakteri atau tidak. Jika steril, media sudah dapat digunakan untuk membiakkan specimen (Lampiran 3).
3.5.3.4Pembiakan Spesimen
E.faecalis yang digunakan adalah spesimen stem sel E. faecalis ATCC 29212 yang dibiakkan secara murni pada media MHA dalam suasana anaerob hingga didapatkan pertumbuhan yang sehat, yang berarti bahwa bakteri tumbuh subur. Ambil beberapa koloni bakteri dengan ose steril lalu diencerkan dengan larutan NaCl 0,9% hingga konsentrasi 106 CFU/ml (CFU: Colony Forming Unit) atau setara dengan 0,5
Mc Farland Standard (Lampiran 3).
3.5.3.5Penentuan KHM Bahan Coba
batang siwak dari pengenceran yang telah dilakukan tersebut, diambil 1 ml lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu tambahkan 1 ml suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet ke dalam masing-masing tabung bahan coba tersebut kemudian dicampur dengan vortex, lalu diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam pada inkubator CO2. Kemudian amati perubahan kekeruhan yang terjadi dengan
bantuan spektrofotometer, lalu dibandingkan tabung-tabung tersebut dengan kontrol untuk menentukan nilai KHM.
3.5.3.6Penentuan KBM Bahan Coba
Penentuan KBM bahan coba dilakukan dengan melakukan penghitungan jumlah koloni menggunakan metode Drop Plates Miles Mesra yaitu ekstrak etanol batang siwak 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25%. Setelah diinkubasi pada prosedur penentuan KHM, bahan coba dengan konsentrasi seperti di atas dicampur dengan
vortex dan diambil 50 µl dengan mikropipet untuk tiap konsentrasi lalu diteteskan ke dalam MHA (Lampiran 4), dilakukan 5 kali replikasi, diamkan selama 15-20 menit. Setelah mengering diinkubasi dalam inkubator CO2 dengan suhu 37oC selama 24 jam.
Jumlah koloni bakteri dihitung dengan prinsip satu sel bakteri hidup bila dibiakkan pada media padat akan tumbuh menjadi satu koloni bakteri (Lampiran 5). Apabila bentuk koloni melebar dianggap berasal dari satu koloni, bila bentuknya dua koloni bersinggungan dianggap sebagai dua koloni. Setelah dihitung jumlah koloni bakteri pada masing-masing tetesan, dikalikan dengan faktor pengenceran dan faktor pengali. Oleh karena pada penelitian konsentrasi yang dilakukan yang dilakukan perhitungan jumlah koloni bakteri merupakan konsentrasi awal (sebelum dilakukan dilusi) maka faktor pengenceran x 1. Selain itu karena pada penetesan suspensi bahan coba dan bakteri pada media padat sebanyak 50 µl, maka hasil perhitungan harus dikali dengan faktor pengali 20 untuk mendapatkan hasil standar (CFU/ml). Contoh cara penghitungan koloni bakteri pada bahan coba dengan metode Drop Plate Miles Mesra adalah:
b. Jika tetesan berjumlah 5 koloni, maka jumlah kuman pada sampel cair tersebut adalah 5 x 1 (faktor pengenceran) x 20 (faktor pengali) = 100 CFU/ml.
3.6 Pengolahan dan Analisis Data
Data dari setiap pemeriksaan dianalisis dengan memakai uji statistik yaitu: 1. Uji analisis varians satu arah (ANOVA) untuk mengetahui efek antimikroba ekstrak etanol siwak terhadap pertumbuhan E. faecalis.
BAB 4
HASIL PENELITIAN
4.1 Ekstrak Kental Siwak
Sebelum diekstrak, siwak yang digunakan diidentifikasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI). Hasil identifikasi menunjukkan bahwa siwak yang digunakan pada penelitian ini adalah dari jenis Salvadora persica dengan suku
Salvadoraceae (Lampiran 6). Adapun ekstrak kental siwak diperoleh dari ekstrak cair batang siwak yang diuapkan dengan vacuum rotavapor pada suhu 46o C selama 5 jam untuk 2,5 liter ekstrak cair per hari. Penguapan dengan vacuum rotavapor
dilakukan selama 2 hari karena jumlah keseluruhan ekstrak cair yang diperoleh adalah 5 liter, sampai diperoleh ekstrak kental dengan konsistensi seperti madu. Ekstrak kental tersebut ditimbang dengan timbangan analitik dan diperoleh hasil ekstrak kental siwak berwarna coklat kehitaman sebanyak 58,669 gram (Gambar 19). Kemudian ekstrak kental siwak dimasukkan ke dalam botol kaca tertutup dan disimpan di tempat yang sejuk.
4.2 Uji Efektivitas Antibakteri
Pada pengujian efek antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap E. faecalis, nilai KHM dan KBM ditentukan dengan cara menghitung jumlah koloni bakteri pada media pertumbuhan bakteri yang dilakukan secara visual dengan bantuan mikroskop.
Gambar 19. Ekstrak kental siwak hasil
penguapan dengan vacuum
Nilai KHM diperoleh dari konsentrasi minimal ekstrak etanol siwak yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri yang tampak secara visual. Sedangkan nilai KBM diperoleh dari konsentrasi minimal bahan coba yang dapat membunuh 99,9% bakteri
Setelah dilakukan pengujian ekstrak etanol siwak terhadap pertumbuhan bakteri E. faecalis pada media pertumbuhan bakteri diperoleh hasil yakni pada media yang diberi ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20%, koloni bakteri E. faecalis
berjumlah lebih sedikit daripada jumlah koloni yang ada pada kontrol Mc. Farland. Sedangkan pada pengujian efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% dijumpai adanya pertumbuhan bakteri dengan bentuk koloni bakteri yang tidak tampak jelas karena koloni bakteri tersebut saling tumpang tindih satu sama lain sehingga memberikan hasil TBUD (Tidak Bisa Untuk Dihitung).
Gambar 20. Pertumbuhan E. faecalis pada media yang diberi ekstrak etanol siwak (a) Ekstrak etanol
siwak 20%, (b) Ekstrak etanol siwak 1,25% dengan salah satu bagian diperbesar (a)
Pada gambar di atas dapat dilihat bahwa pada media pertumbuhan bakteri (MHA) yang diberikan ekstrak etanol siwak 20%, terlihat koloni E. faecalis yang berbentuk bulat kecil berwarna putih kekuningan (Gambar 20a (tanda panah) dan Gambar 21a). Sedangkan pada media yang diberikan ekstrak etanol siwak 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% (Gambar 20b) bentuk koloni tidak tampak jelas lagi karena koloni saling tumpang tindih satu sama lain (Gambar 21b, 21c, 21d, 21e). Adapun hasil penghitungan bakteri yang dilakukan pada masing-masing perlakuan dapat dilihat pada tabel berikut.
Gambar 21. Pertumbuhan E. faecalis pada media yang diberi ekstrak etanol siwak (a) Ekstrak etanol
siwak 20%, (b) Ekstrak etanol siwak 10%, (c) Ekstrak etanol siwak 5%, (d) Ekstrak etanol siwak 2,5%, (e) Ekstrak etanol siwak 1,25%
(a) (b) (c)
Tabel 1. Hasil uji antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap E. faecalis pada konsentrasi 20%, 10%, 5%, 2,5%, 1,25%.
Bahan
Uji Konsentrasi
Replikasi (CFU/ml)* Kontrol Mc.
Keterangan: 0 = steril, tidak ada pertumbuhan bakteri; TBUD = Tidak Bisa Untuk Dihitung, * = dikali
faktor pengencer (x20), CFU/ml = Colony Forming Unit per milliliter
Tabel 1 menunjukkan hasil uji efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20%,10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% terhadap pertumbuhan E. faecalis. Pada konsentrasi 20% ditemukan adanya bakteri pada media dengan nilai yang bervariasi pada setiap replikasi yakni pada replikasi ke-1 dijumpai E. faecalis sebanyak 3,18.103 CFU/ml, pada replikasi ke-2 dijumpai E. faecalis sebanyak 0,66.103 CFU/ml, pada replikasi ke-3 dijumpai E. faecalis sebanyak 1,38.103 CFU/ml, pada replikasi ke-4 dijumpai E. faecalis sebanyak 2,44.103 CFU/ml, pada replikasi ke-5 dijumpai E. faecalis sebanyak 3,52.103 CFU/ml. Nilai mean (rata-rata) dari pertumbuhan E. faecalis yang diberikan ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20% adalah 2,236.103 CFU/ml. Jumlah rata-rata bakteri yang dapat dihambat pertumbuhannya pada ekstrak etanol siwak 20% dibandingkan dengan bakteri yang ada pada kontrol
Mc. Farland adalah sebanyak 2,89264.105 CFU/ml (99,23%) (2,92.105 -2,236.103=2,89264.105=99,23% dari kontrol Mc. Farland ).
diberikan ekstrak etanol siwak) ditemukan E. faecalis sebanyak 2,92.105 CFU/ml dan pada kontrol negatif (ekstrak etanol siwak tanpa suspensi E. faecalis) tidak ditemukan bakteri (steril) (Lampiran 7).
Berdasarkan data hasil penelitian di atas, diperoleh hasil bahwa konsentrasi minimal ekstrak etanol siwak yang dapat menghambat pertumbuhan E. faecalis pada penelitian ini adalah sebesar 20%. Sedangkan nilai KBM pada penelitian ini tidak dapat ditentukan karena tidak ada bahan coba yang dapat membunuh 99,9% bakteri
E. faecalis.
Adapun secara statistik, hasil penelitian ini tidak dapat diuji dengan uji statistik parametrik dengan menggunakan uji ANOVA dan LSD karena data yang tersedia tidak semua direpresentasikan dalam angka, yakni dengan adanya data dalam kategori Tidak Bisa Untuk Dihitung (TBUD), serta data yang tersedia tersebut tidak terdistribusi normal. Syarat data yang terdistribusi normal adalah pada uji normalitas akan menghasilkan bentuk histogram yang simetris.
Pada histogram di atas terlihat bahwa puncak batang yang paling tinggi tidak berada simetris (di tengah) sehingga dapat disimpulkan bahwa data hasil penelitian ini tidak terdistribusi dengan normal. Oleh karena data yang dihasilkan tidak terdistribusi normal maka tidak dapat dilakukan uji statistik parametrik seperti
ANOVA dan LSD, namun dengan menggunakan uji non-parametrik, yakni uji
Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney.
BAB 5
PEMBAHASAN
Uji efek antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap E. faecalis diawali dengan pembuatan ekstrak etanol siwak. Pada tahap pembuatan ekstrak etanol siwak, siwak yang diperlukan sebanyak 1 kg dan diperoleh simplisia sebanyak 415 gram yang kemudian disesuaikan dengan kapasitas perkolator untuk 300 gram simplisia dan dilarutkan dengan etanol 70%. Etanol 70% dipilih sebagai cairan penyari karena pelarut ini bersifat universal yang dapat menarik sebagian besar zat-zat aktif yang terkandung dalam siwak.
Aktivitas antibakteri dari suatu zat dapat dilakukan dengan 2 cara, yaitu difusi agar (metode Kirby Bauer) dan dilusi agar. Difusi agar dengan metode Kirby Bauer adalah uji sensitivitas dengan menggunakan kertas cakram (disk) diffusion yang memiliki konsentrasi tertentu dan menggunakan media selektif Mueller Hinton Agar. Metode ini dipengaruhi banyak faktor fisik dan kimia selain interaksi sederhana antara antimikroba dan bakteri (misalnya sifat medium dan kemampuan difusi, ukuran molekular, dan stabilitas obat). Meskipun demikian, standarisasi keadaan memungkinkan penentuan kerentanan mikroorganisme. Interpretasi hasil uji difusi harus berdasarkan perbandingan antara metode dilusi dan difusi.30
tingkat resistensi dan dapat menjadi petunjuk penggunaan antimikroba. Kerugian metode ini tidak efisien karena pengerjaannya yang rumit, memerlukan banyak alat-alat dan bahan serta memerlukan ketelitian dalam proses pengerjaannya termasuk persiapan konsentrasi antimikroba yang bervariasi.31
Penelitian ini menggunakan metode dilusi yang dikombinasi dengan metode
Drop Plate Miles Mesra yakni bakteri yang diuji ditanam dalam media MHA dan diinkubasi selama 24 jam. Nilai KHM dapat diketahui dari konsentrasi minimal ekstrak etanol siwak yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri yang tampak secara visual dengan bantuan mikroskop. Setelah ditanam dalam MHA dan diinkubasi selama 24 jam, terlihat bahwa pada konsentrasi 20%, pertumbuhan bakteri
E. faecalis lebih sedikit daripada pertumbuhan bakteri E. faecalis pada kontrol Mc. Farland. Sedangkan pada konsentrasi 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% juga terlihat adanya pertumbuhan bakteri, namun jumlah bakteri yang tumbuh tersebut tidak bisa dihitung (TBUD) karena koloni yang tumbuh terlalu banyak (>300 koloni). Jika jumlah koloni bakteri yang tumbuh > 300 koloni, maka penghitungan koloni bakteri tidak dilanjutkan karena akan memberikan hasil yang bias. Oleh sebab itu, hasil pada konsentrasi 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% termasuk ke dalam kategori TBUD. Akan tetapi, ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi 20% ini tidak dapat dikategorikan sebagai nilai Kadar Hambat Minimum (KHM) karena ada selang konsentrasi yakni antara 10% ke 20% yang tidak diuji efek antibakterinya. Peneliti menduga, apabila dilakukan uji efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi di antara 10% dan 20%, kemungkinan akan diperoleh nilai KHM dengan konsentrasi yang lebih kecil dari 20%.
konsentrasi 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% saja. Oleh karena itu, apabila konsentrasi ekstrak etanol siwak dinaikkan di atas 20%, kemungkinan besar nilai KBM akan diperoleh. Terlebih lagi pada penelitian ini, pada konsentrasi 20%, ekstrak etanol siwak telah dapat membunuh 99,23% Enterococcus faecalis.
Adapun secara statistik, hasil penelitian ini tidak dapat diuji dengan uji statistik parametrik dengan menggunakan uji ANOVA dan LSD karena data yang tersedia tidak semua direpresentasikan dalam angka, yakni dengan adanya data dalam kategori Tidak Bisa Untuk Dihitung (TBUD), serta data yang tersedia tersebut tidak terdistribusi normal. Syarat data yang terdistribusi normal adalah pada uji normalitas akan menghasilkan bentuk histogram yang simetris. Oleh karena data yang dihasilkan tidak terdistribusi normal, maka tidak dapat dilakukan uji statistik parametrik seperti ANOVA dan LSD, namun dengan menggunakan uji non-parametrik, yakni uji
Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney. Dari hasil uji statistik dengan menggunakan uji Kruskal-Wallis dan uji Mann-Whitney diperoleh hasil bahwa ekstrak etanol siwak (Salvadora persica) memiliki efek antibakteri yang signifikan terhadap Enterococcus faecalis dengan p-value (=0.0001) <0.05.
Pengujian antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap E. faecalis dengan konsentrasi 20% kemungkinan akan memberikan hasil yang tidak sama apabila bahan ini digunakan secara klinis pada saluran akar sebab pada penelitian ini bakteri berkontak langsung dengan bahan uji sehingga efektif dalam menghambat pertumbuhan E. faecalis pada konsentrasi 20%, sedangkan penggunaan bahan ini di saluran akar tidak selalu dapat berkontak dengan bakteri karena adanya invasi bakteri ke dalam tubulus dentin. Selain itu, secara klinis, E. faecalis dapat berkoagregasi dengan bakteri lain seperti Fusobacterium nucleatum yang dapat menyebabkan terjadinya infeksi endodonti.31
dapat menghambat pembelahan dan pertumbuhan mikroorganisme. Flavonoid dapat membentuk kompleks dengan protein ekstraseluler dan dinding sel bakteri, bersifat lipofilik yang dapat merusak membran mikroba. Tanin bersifat astringen (zat yang bersifat menciutkan), masuk melalui membran mikroba, membentuk kompleks dengan ion metal. Kandungan tanin yang terdapat di dalam siwak memiliki sifat antibakteri dengan cara mengganggu pertumbuhan dan metabolisme bakteri. Tanin ditemukan hampir di setiap bagian dari tanaman; kulit kayu, dauh, buah, dan akar. Tanin memiliki sifat mudah larut dalam air, etanol, dan juga aseton. Tanin tidak larut dalam benzen, kloroform, dan eter dan rusak pada suhu 210o C. Adapun saponin. mempunyai sifat seperti sabun yang dapat melarutkan kotoran, dan dapat digunakan sebagai antiinflamasi dan antimikroba. Saponin dapat membentuk senyawa kompleks dengan membran sel bakteri melalui ikatan hidrogen yang kemudian dapat menghancurkan permeabilitas dinding sel bakteri yang dapat mengakibatkan kematian sel. 25
E. faecalis termasuk ke dalam grup D dari antigen karbohidrat dinding sel (lancefield antigen) yang merupakan asam glycerol teichoic intraseluler yang berhubungan dengan membran sitoplasma sel E. faecalis. Dinding selnya terdiri atas sejumlah besar peptidoglikan. Peptidoglikan membantu dalam pengaturan bentuk mikroba dan memiliki polisakarida yang berikatan dengan N-acetylglucoamine
(GlcNAc) dan N-acetylmuramic (MurNAc). Peptidoglikan terletak di luar membran sitoplasma dan memiliki sifat yang spesifik, tahap transglikosilasi diindikasikan sebagai target potensial bagi medikamen antibakteri,7 sehingga diduga hal ini yang menyebabkan ekstrak etanol siwak memerlukan konsentrasi yang besar untuk menghambat serta membunuh E. faecalis.
E. faecalis dapat melakukan fase viable but non-cultivable (VBNC), yakni suatu mekanisme untuk bertahan hidup yang dilakukan oleh bakteri pada saat terjadi stres pada lingkungan yang kemudian kembali pada kondisi resusitasi. E. faecalis
juga memiliki lipoteichoic acid (LTA) yang dapat berikatan dengan sel eukariot, termasuk platelet, eritrosit, PMN leukosit, dan sel-sel epitel. Adanya LTA pada E. faecalis dapat menyebabkan terjadinya apoptosis pada beberapa sel, seperti osteoblas, osteoklas, sel-sel fibroblast ligamen periodontal, makrofag, dan neutrofil.10
Pada penelitian Al Bayati (2007) menunjukkan bahwa ekstrak metanol siwak dengan konsentrasi 20%, 10%, 5%, 2,5%, dan 1,25% memiliki efek antibakteri terhadp bakteri Staphilococcus aureus, Streptococcus mutans, Streptococcus faecalis,
Streptococcus pyogenis, Lactobacilus acidophilus, Pseudomonas aeruginosa, dan
Candida albicans.17 Sedangkan pada penelitian yang dilakukan oleh Abdelrahman HF et al. menunjukkan bahwa ekstrak etanol siwak memiliki efek antibakteri terhadap Candida albicans, Actinomyces naeslundii, Lactobacillus acidophilus,
Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, dan Prevotella intermedia.26 Pada penelitian yang dilakukan oleh Trimurni A. dan Steven P. pada tahun 2007 juga diperoleh hasil bahwa ekstrak senyawa aktif batang siwak mampu menghambat bakteri seperti Streptococcus mutans (p<0,005). 27
Asal siwak yang berbeda kemungkinan akan memberikan hasil uji yang berbeda pula. Hal ini disebabkan oleh keadaan geografis tanaman dari masing-masing daerah sehingga kadar senyawa aktif yang terkandung, yakni salvadorin, sulfur, flavonoid, tanin, dan saponin dalam kedua tanaman tidak sama antara satu dengan yang lain. Siwak yang digunakan peneliti berasal dari Riyadh, Saudi Arabia sedangkan siwak pada penelitian Al Bayati berasal dari Mosul, Iraq.17
Faktor lain yang menyebabkan adanya perbedaan antara hasil penelitian Al Bayati dengan yang dilakukan oleh penulis adalah oleh karena adanya perbedaan teknik pembuatan ekstrak siwak yang digunakan. Uji antibakteri yang dilakukan oleh Al Bayati menggunakan metode difusi dengan menggunakan disc diffusion dan dilusi. Pada penelitian Al Bayati, cairan penyari yang digunakan untuk membuat ekstrak siwak adalah akuades dan metanol, sedangkan cairan penyari yang digunakan pada penelitian ini adalah etanol yang mana hal tersebut dapat mempengaruhi komponen zat yang terlarut di dalam ekstrak siwak. Selain itu, pada penelitian Al Bayati batang siwak dihancurkan sampai berupa bubuk, sedangkan batang siwak pada penelitian ini dihancurkan sampai berupa serat-serat halus yang mana hal tersebut juga diduga mempengaruhi jumlah kandungan zat-zat antibakteri dalam siwak yang mampu ditarik oleh cairan penyari17. Selain itu cairan penyari yang digunakan oleh Al Bayati adalah metanol dan akuades, sedangkan pada penelitian ini menggunakan cairan penyari etanol, perbedaan ini juga dapat mempengaruhi kemampuan cairan penyari dalam menarik zat aktif dalam siwak. Kelebihan metanol jika dibandingkan dengan etanol yaitu metanol memiliki bentuk molekul yang lebih kecil sehingga dapat masuk ke pori-pori dan menarik senyawa aktif dari siwak, tetapi metanol lebih toksik dibandingkan dengan etanol.
Adapun resistensi E. faecalis pada setiap replikasi menunjukkan hasil yang berbeda dapat disebabkan oleh adanya modifikasi dari; daerah target yang dapat dicapai oleh ekstrak etanol siwak, jalur masuk ekstrak etanol siwak menembus membran sel E. faecalis, daya serap membran sel E.faecalis (pengurangan konsentrasi intraseluler sel E. faecalis terhadap ekstrak etanol siwak, baik dengan mengurangi permeabilitasnya ataupun melalui pompa aktif membran sel E. faecalis), inaktivasi enzim atau jumlah bakteri E. faecalis yang terlalu banyak.17
BAB 6
KESIMPULAN DAN SARAN
6.1Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa konsentrasi minimal ekstrak etanol siwak yang mampu memghambat pertumbuhan E. faecalis
adalah sebesar 20%. Nilai KHM pada penelitian ini kemungkinan berada di antara konsentrasi 10-20%. Dari hasil uji statistik dengan menggunakan uji Kruskal-Wallis
dan uji Mann-Whitney diperoleh hasil bahwa ekstrak etanol batang siwak(Salvadora persica) memiliki efek antibakteri yang signifikan terhadap Enterococcus faecalis
dengan p-value (=0.0001) <0.05. Sedangkan nilai KBM pada penelitian ini tidak dapat ditentukan karena tidak ada bahan coba yang dapat membunuh 99,9% bakteri
E. faecalis.
6.2Saran
Mengingat penelitian ini masih jauh dari sempurna maka disarankan untuk selanjutnya diperlukan:
1. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek antibakteri ekstrak etanol siwak dengan konsentrasi di antara 10-20% untuk mengetahui nilai KHM dan dengan konsentrasi yang lebih besar dari 20% untuk mencari nilai KBM.
2. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efek antibakteri ekstrak etanol siwak dalam bentuk bubuk.
3. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui kandungan zat aktif mana dari ekstrak etanol siwak yang memiliki efek antibakteri paling besar pada E. faecalis.
4. Penelitian lebih lanjut mengenai efek antibakteri ekstrak etanol siwak terhadap bakteri endodontik lain yang patogen.
6. Penelitian lebih lanjut untuk mengetahui karakteristik lainnya dari ekstrak etanol siwak baik dalam hal toksisitas, sifat pelumas, kemampuan membuang smear layer, serta batas massa penyimpanannya sebagai bahan irigasi saluran akar.
