BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah analisis eksperimental dimana peneliti menganalisa toksisitas akut dari ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Ten) Steen.) secara in vivo dengan rancangan randomized block design, dimana hewan uji dipilih secara acak dan memiliki kesempatan yang sama untuk diberikan perlakuan.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Variabel bebas dalam penelitian ini adalah variasi dosis ekstrak etanol daun binahong.
2. Variabel terikat
Variabel tergantung dalam penelitian adalah ini nilai rentang dosis aman, berat badan hewan uji, gejala efek toksik, nilai hematologi (eritrosit dan leukosit) dan nilai biokimia darah (GOT, GPT, urea), gambaran histopatologi hewan uji yang telah diberikan ekstrak etanol daun binahong secara oral.
3. Variabel terkendali
Variabel terkendali dalam penelitian ini adalah pelarut ekstrak daun binahong, suhu inkubasi, reagen, jenis hewan uji, cara pemberian sediaan uji.
C. Definisi Variabel Operasional
1. Ekstrak etanol daun binahong (Anredera cordifolia (Ten) Steen.) merupakan ekstrak yang diperoleh dari penyarian daun binahong menggunakan etanol 70% dengan metode maserasi.
2. Pengukuran potensi dosis aman adalah pengukuran dengan menggunakan dosis tertentu yang masih aman dan tidak menunjukkan efek toksis.
3. Pengamatan gejala efek toksik adalah pengamatan gejala yang timbul pada sighting study selama 24 jam setelah pemejanan dosis dan setiap hari selama 14 hari pada main study setelah pemejanan dosis dengan observasi perubahan tingkah laku tikus.
4. Pengukuran perubahan hematologi adalah pengukuran dengan menggunakan perhitungan jumlah sel darah merah dan sel darah putih. 5. Pengukuran efek toksisitas hati dan ginjal adalah pengukuran dengan menggunakan perhitungan kadar biokimia Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase (SGOT), Serum Glutamic Piruvic Transaminase (SGPT), urea serta pengamatan histopatologi preparat hati dan ginjal tikus
6. Dosis ekstrak yang digunakan sebagai perlakuan uji toksisitas yaitu 5 mg/kg, 50 mg/kg, 300 mg/kg dan 2000 mg/kg.
7. Galur tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu jenis galur wistar.
8. Umur tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu antara 4-5 bulan.
9. Bobot tikus yang digunakan dalam penelitian ini yaitu ± 120-200 g. 10. Tikus yang digunakan dalam penelitian yaitu tikus betina galur wistar.
D. Waktu dan tempat penelitian
Waktu penelitian ini dimulai dari bulan Juli hingga bulan Desember 2013. Tempat penelitian dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika FKIP UMP, Laboratorium Biologi Farmasi UMP, Laboratorium Farmakologi Toksikologi UMP, Laboratorium Teknologi Farmasi UMP, Laboratorium klinik UMP, Laboratorium Patologi UGM.
E. Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah ekstrak etanol daun binahong, etanol 70%, akuades, makanan tikus dengan merk hi-pro-vit, EDTA, formalin, reagen turk (PT. Segera Husada Mandiri) , reagen hayem (PT. Gresik Srana Tirta), reagen urea darah, reagen AST/SGOT (Buffer Tris pH 7,8, L-Aspartat, 2-Oksoglutarat, laktat dehidroginase, malat dehidrogenase dan NADH), reagen ALT/SGPT (buffer Tris, L-alanin, oksoglutarat, LDH, NADH), reagen urea ( Buffer Tris pH 7,8, 2-Oksoglutarat, ADP, Urease, GLDH dan NADH).
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang hewan uji, sarung tangan, tempat air minum dan makan hewan, alat-alat gelas (pyrex), vacum evaporator, waterbath, hemasitometer (Assistent Germany), tabung sentrifuge, sentrifuge (eppendorf), mikropipet, BA-88Semi-auto Chemistry Analyzer, timbangan analitik (Shimadzu), spuit injeksi 1 mL dan 5 mL dengan jarum suntik oral dengan kepekaan 0,1 mL, stop watch, mikroskop elektrik (Olympus).
F. Cara Penelitian
1. Perijinan ethical clearance
Pengujian menggunakan hewan diperlukan ijin ethical clearance. Hal ini bertujuan untuk memastikan bahwa uji tidak menggunakan metode yang melanggar peraturan pemeliharaan hewan uji. Ijin ini diajukan kepada komisi etik Fakultas Kedokteran Universitas Jendral Soedirman.
2. Pengambilan dan pengolahan sampel
Sampel daun binahong yang digunakan berasal dari kebun tanaman obat rumah warga di Jl. Perintis Kemerdekaan, Purwokerto Kabupaten Banyumas Provinsi Jawa Tengah.
3. Determinasi bahan
Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Botani dan Genetika, Program Studi Pendidikan Biologi FKIP UMP. Tujuan dilakukan
determinasi adalah untuk mendapatkan kebenaran sampel yang akan digunakan dalam penelitian.
4. Pengeringan
Daun binahong yang telah diperoleh, dicuci bersih, ditiriskan dengan cara diangin-anginkan dan dilanjutkan dengan pengeringan yang dilakukan di dalam mesin pengering selama 3 hari hingga kering. Daun binahong dihaluskan dengan mesin penghalus.
5. Penyiapan ekstrak
Penyiapan ekstrak dilakukan dengan menggunakan metode maserasi (perendaman). Serbuk daun binahong direndam dalam pelarut etanol 70% dengan pebandingan 1:10. Pengadukan dilakukan 30 menit selama 3 hari. Kemudian di remaserasi dengan perbandingan 1:5. Hasil maserasi diuapkan sampai kental dan tidak berbau etanol lagi pada penangas air. Hasil ekstrak etanol kental ditimbang.
6. Penyiapan hewan
Hewan yang digunakan tikus galur wistar (Loomis, 1978) betina berumur 4-5 bulan dengan berat badan antara 120-200 gram. Hewan uji disimpan dalam kandang masing-masing dengan suhu ruangan. Selanjutnya hewan uji diaklimasi (diadaptasikan) selama 7 hari (Depkes RI, 1986).
7. Rancangan dosis
Berdasarkan pada acut oral toxity OECD guideline for testing (2001) dosis yang digunakan mengacu pada penelitian Sighting Study atau penelitian pengamatan yaitu 5 mg/kg, 50 mg/kg, 300 mg/kg dan 2000 mg/kg (OECD, 2001)
8. Uji pengamatan (Sighting study)
Uji toksisitas akut secara oral ini mengikuti Organization for Economic Co-operation and Development (OECD) guidlines for Testing of Chemical number 420 (OECD, 2001). Pada uji pengamatan pemberian ekstrak daun binahong ke hewan uji dimulai dengan dosis 300 mg/kg BB secara peroral, kemudian diamati efek toksik selama 30
menit diikuti setiap jam sampai 8 jam selama 24 jam pertama. Jika hewan uji tidak menunjukan gejala efek toksik dan kematian, pada hari selanjutnya dilakukan pemberian dosis selanjutnya yaitu 2000 mg/kg BB ke tikus lain secara peroral dan diamati seperti prosedur pada dosis 300 mg/kg BB.
9. Uji utama (main study)
Hewan uji dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol dan kelompok uji. Masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor hewan uji. Kelompok perlakuan diberikan 2 mL/100 g BB yang mengandung dosis ekstak etanol daun binahong sebanyak 2000 mg/kg BB (misal: dosis tertinggi yang diperoleh berdasarkan sighting study adalah dosis 2000 mg/kgBB). Kelompok kontrol diberi air dengan jumlah yang sama seperti kelompok perlakuan yaitu 2 mL/100 gram BB. Selama masa pengujian semua hewan uji diberi makan dan minum masing-masing sebanyak 2000 mg dan 2000 mL air untuk 1 minggu (Halim et al, 2011)
a. Berat badan
Hewan uji ditimbang berat badannya sebelum penelitian dan setiap hari selama 14 hari (OECD, 2001).
b. Pengamatan gejala toksik akut
Pengamatan gejala toksik akut dilakukan selama 5 menit (Widiowati, 2005) 3 kali sehari selama 14 hari. Gejala toksisitas yang diamati berupa perilaku, saluran cerna dan kulit.
Tabel 1. Pengamatan gejala efek toksik (Ecobichon, 1997)
Sistem Organ Tanda ketoksikan
Perilaku
Saluran cerna Kulit
Kegelisahan, keberangasan, agresif, ketakutan, kebingungan
muntah, diare, tinja berdarah
kerontokan rambut, kulit kemerahan, bengkak
c. Analisis hematologi
Analisis hematologi dilakukan dengan menggunakan alat Hemasitometer. Hewan uji dipuasakan sebelumnya selama ± 16 jam. Ekor tikus dibersihkan dengan alkohol 95%. Darah diambil dengan cara menyayat pembuluh vena pada bagian ekor tikus. Darah dimasukan kedalam tabung reaksi yang berisi antikoagulan EDTA (Ethylene Diamine Tetra Acetate). Parameter yang di ukur adalah sel darah putih dan sel darah merah.
1) Mengukur jumlah sel darah merah: darah sebanyak 5 µL dicampur dengan 1000 µL reagen hayem, diteteskan pada kaca kamar hitung (improve neubaure) ditutup dengan kaca penutup, didiamkan selama 2 menit lalu diamati dibawah mikroskop. Jumlah eritrosit dihitung dalam 5 bidang kotak kecil, Pengenceran 200x
Jumlah eritrosit per mm3 = N x 50 x 200 = N x 10000/μl darah
2) Mengukur jumlah sel darah putih : darah sebanyak sebanyak 10 µL dicampur dengan 200 µL reagen turk. Darah diteteskan pada kamar hitung, kamar hitung (improve neubaure) ditutup dengan kaca penutup, didiamkan selama 2 menit. Leukosit diamati di bawah mikroskop dan dihitung dalam 4 bidang besar.
Menghitung jumlah leukosit dapat diperoleh dari perhitungan: Jumlah leukosit per mm3 = N x 50 /μl darah
Gambar 2. Kamar hitung Keterangan
W : kotak untuk hitung jumlah lekosit R : kotak untuk hitung jumlah eritrosit
(Depkes RI, 1989; Triana dan Nurhidayat, 2006) d. Analisis biokimia darah berupa GOT, GPT dan urea darah
Pengujian GOT dan GPT mengikuti prosedur dari Rajawali Nusindo, dimana pengukuran GOT dan GPT dilakukan pada suhu suhu 37oC. Pengukuran kadar GPT dan GOT dilakukan menggunakan metode spektofotometri (BA-88 Semi-auto Chemistry Analyzer) pada panjang gelombang 340 nm menggunakan reagen dari Rajawali Nusindo yang terdiri dari reagen 1 dan reagen 2. Spektrofotometer sebelumnya diatur terlebih dahulu suhu dan panjang gelombang yang akan digunakan. 1) GPT
Pada pengukuran GPT menggunakan monoreagen adalah campuran 4 bagian Reagen 1 dan 1 bagian reagen 2 (20 ml: 5 ml). Reagen 1 GPT terdiri dari buffer Tris, pH 7.8, L-alanin, Laktat dehidrogenase, reagen terdiri dari 2-oksiglutarat dan NADH. Darah diambil dari vena lateralis ekor tikus, ditampung di tabung reaksi yang telah diisi EDTA, kemudian disentrifuge dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit (Rachmani dan Sidik, 2006). Plasma darah 100 µL ditambah 1000 µL monoreagen kemudian dicampur. dicampur dengan 1000 µl
monoreagen, kocok hingga homogen. Campuran tersebut dimasukan ke dalam kuvet spektrofotometer secara otomatis dengan menekan tombol hisap, kemudian larutan darah yang telah dicampur dengan monoreagen akan terhisap ke dalam kuvet yang ada di dalam alat spektrofotometer semi otomatis. Secara otomatis larutan akan diinkubasi terlebih dahulu selama 1 menit, dilanjutkan dengan pembacaan absorbansi secara 2) GOT.
Penetuan kadar GOT sama seperti pada penentuan kadar GPT, namun reagen yang digunakan berbeda, yaitu reagen khusus untuk GOT. Reagen 1 terdiri lagi TRIS, L-Aspartat, MDH (malat dehidrogenase) dan LDH (laktat dehidrogenase).
Reagen 2 terdiri dari 2-oksoglutarat dan NADH. 3) Urea
Pengukuran kadar urea dilakukan menggunakan mono reagen (4 bagian reagen 1 dan 1 bagian reagen 2). Reagen 1 terdiri dari Tris pH 7.8, 2-oxoglutarate, ADP, Urease, GLDH (Glutamate dehydrogenase) dan Reagen 2 mengandung NADH. Plasma darah diambil sebanyak 10 µl dicampur dengan 1000 µl monoreagen, kocok hingga homogen. Campuran tersebut dimasukan ke dalam kuvet spektrofotometer secara otomatis dengan menekan tombol hisap, kemudian larutan darah yang telah dicampur dengan monoreagen akan terhisap ke dalam kuvet yang ada di dalam alat spektrofotometer semi otomatis. Secara otomatis larutan akan diinkubasi terlebih dahulu selama 1 menit, dilanjutkan dengan pembacaan absorbansi secara otomatis.
e. Bobot organ
Tikus dibunuh dengan cara dimasukan ke dalam bejana yang telah dijenuhi eter. Tikus dibedah mulai dari bagian perut ataupun uterus menggunakan gunting bengkok, ambil masing-masing organ tikus,
organ dibersihkan dengan akuades berulang-ulang hingga bersih dari darah, selanjutnya dicuci dengan NaCl 0,9% berulang, organ kemudian ditiriskan di atas kertas saring sampai air berkurang, organ ditimbang menggunakan cawan petri kering, berat masing-masing tikus organ dicatat pada kertas blanko. Organ kemudian dimasukan ke dalam pot yang telah diisi formalin 4-10% dan buffer formalin untuk diuji histopatologi (Anonim, 2008).
f. pemeriksaan histopatologi
preparat histopatologi dicat dengan Hematoksilin dan Eosin, kemudian preparat histopatologi diperiksa dibawah mikroskop. Pemeriksaan dengan mikroskop dilakukan dengan pembesaran 100x kemudian dilanjutkan dengan pembesaran 400x. Perubahan histopatologi yang diamati meliputi adanya degenerasi melemak (vakuolisasi) dan nekrosis. Pada uji histopatologi dilakukan pada kelompok kontrol yang meliputi tikus nomor 6, 7 dan 9. Kelompok perlakuan meliputi tikus nomor 1, 4 dan 5.
g. Analisis Data
1) Data pemeriksaan gejala-gejala klinis yang nampak secara kualitatif dipakai untuk mengetahui mekanisme yang memerantarai kematian pada hewan uji.
2) Data perubahan berat badan, hematolgi, biokimia darah dan bobot organ hewan uji dianalisis menggunakan Statistical Package Sciences (SPSS) 16 dengan analisis statistic menggunakan analisis Independent T Test untuk membandingkan apakah ada perbedaan berat badan, hematologi, biokimia darah antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol dalam 1 waktu yaitu (kelompok kontrol dengan perlakuan pada H-1, H+1, H+7 dan H+14) dan Dependent T Test untuk membandingkan prites dan postes pada kelompok perlakuan (H-1 vs H+1, H-1 vs H+7, H-1 vs H+14).
