LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERCOBAAN IX
UJI AKTIVITAS ENZIM GLUKOAMILASE
OLEH:
NAMA : AGUNG WIBAWA MAHATVA YODHA STAMBUK : F1C1 08 006
KELOMPOK : I
ASISTEN :
LABORATORIUM KIMIA JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS HALUOLEO
BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang
Enzim merupakan protein yang berfungsi sebagai biokatalis dalam sel
hidup. Kelebihan enzim dibandingkan katalis biasa adalah (1) dapat meningkatkan
produk beribu kali lebih tinggi; (2) bekerja pada pH yang relatif netral dan suhu
yang relatif rendah; dan (3) bersifat spesifik dan selektif terhadap subtrat tertentu
(Azmi, 2006).
Enzim glukoamilase (EC. 3.2.1.3) atau sering disebut amiloglukosidase
atau α-1,4-glukano glukohidrolase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu
menghidrolisa ikatan α-1,4 pada rantai amilosa, amilopektin, glikogen, dan
pullulan ( Azwar D. dan R. Erwanti, 2000). Glukoamilase dapat diproduksi dalam
skala industri melalui fermentasi kultur cair maupun fermentasi padat. Fermentasi
dengan media cair lebih menguntungkan, tetapi biaya operasional dan alat yang
digunakan lebih mahal. Fermentasi dengan media padat mempunyai keunggulan
lebih sederhana dalam pelaksanaannya, biaya operasional dan peralatan
fermentasi lebih murah, tetapi untuk menjaga kondisi fermentasi sesuai dengan
apa yang diinginkan seperti kehomogenan media, aerasi sangat sulit untuk
dilakukan .
Produksi glukosa hasil aktivitas glukoamilase diukur dengan
spektrofotometer dengan metode Smogy-Nelson pada panjang gelombang 550 nm,
B. Permasalahan
Permasalahan dalam praktikum ini yaitu bagaimanakah aktivitas enzim
glukoamilase yang diproduksi oleh mikroba ?
C. Tujuan
Tujuan dari praktikum ini yaitu untuk menguji aktivitas enzim glukoamilase
yang diproduksi oleh mikroba.
D. Manfaat
Manfaat dari praktikum ini yaitu untuk menambah pengetahuan uji aktivitas
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel. Bekerja dengan
urutan-urutan yang teratur, enzim mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang
menguraikan molekul nutrient, reaksi yang menyimpan dan mengubah energi
kimiawi dan yang membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana. Di antara
sejumlah enzim yang berpartisi di dalam metabolisme terdapat sekelompok
khusus yang dikenal sebagai enzim pengatur yang dapat mengenali berbagai
isyarat metabolik dan mengubah kecepatan katalitiknya sesuai dengan isyarat
yang diterima. Melalui aktivitasnya, sistem enzim terkoordinasi dengan baik,
menghasilkan suatu hubungan yang harmonis di antara sejumlah aktivitas
metabolik yang berbeda, yang diperlukan untuk menunjuang kehidupan
(Lehninger, 1982).
Reaksi kimia dipengaruhi oleh suhu. Reaksi yang menggunkana katalis
enzim juga dipengaruhi oleh suhu. Pada suhu rendah reaksi kimia berlangsung
lambat, sedangkan pada suhu yang lebih tinggi reaksi berlangsung lebih cepat. Di
samping itu, karena enzim adalah suatu protein, maka kenaikan suhu dapat
menyebabkan terjadinya proses denaturasi. Apabila proses denaturasi terjadi,
maka bagian aktif enzim akan terganggu dan dengan demikian konsentrasi efektif
enzim menjadi berkurang dan kecepatamn reaksinya ikut menurun (Poedjiadi,
1994).
Fermentasi mempunyai pengertian aplikasi metabolisme mikroba untuk
mengubah bahan baku menjadi produk yang bernilai lebih tinggi, seperti
merupakan proses yang relatif murah yang pada hakekatnya telah lama dilakukan
oleh nenek moyang kita secara tradisional dengan produk-produknya yang sudah
biasa dimakan orang sampai sekarang, seperti tempe, oncom, tape, dan lain-lain.
Fermentasi dapat dilakukan dengan metode kultur permukaan dan kultur terendam
submerged. Kultur permukaan yang menggunakan substrat padat atau semi padat
banyak digunakan untuk memproduksi berbagai jenis asam organik dan enzim.
Fermentasi media padat ini sering disebut proses ‘koji’, misalnya proses koji
untuk memproduksi enzim yang dibutuhkan dalam pembuatan shoyu (kecap
kedelai), miso, sake, asam-asam organik dan sebagainya. (Muhiddin et al, 2001).
Pati (starch) adalah karbohidrat penyimpan energi pada tanaman. Pati
merupakan komponen padi-padian, kentang, jagung. Dalam bentuk inilah glukosa
disimpan oleh tanaman untuk keperluan mendatang. Pati tersusun dari unit-unit
glukosa yang dihubungkan oleh ikatan 1,4- -glikosida, walaupun rantai ini
dapat pula mempunyai percabangan karena adanya ikatan 1,6- -glikosida.
Hidrolisis parsial pada pati menghasilkan maltosa, dan hidrolisis selengkapnya
akan memberikan D-glukosa. Pati dapat dipisahkan dengan macam-macam
pelarut dan teknik pengendapan menjadi dua bagian, yaitu amilosa dan
amilopektin. Pada amilosa, yang menyusun 20% pati, unit-unit glukosa (50-300)
membentuk rantai lurus yang berikatan menurut 1,4. Amilopektin (amylopectin)
bercabang banyak. Sekalipun setiap molekul dapat mempunyai 300-500 unit
glukosa, rantai dengan ikatan 1,4 hanya terdapat rata-rata sepanjang 25-30 unit
glukosa. Rantai-rantai demikian mempunyai percabangan melalui ikatan 1,6.
Karena strukturnya yang banyak bercabang, butir pati mengembang dan
Pada fungi, studi yang rinci mengenai pemurnian α-amilase terbatas hanya
pada sedikit spesies fungi. Meskipun demikian, Amirul et al memproduksi
α-glukosidase, α-amilase, dan dua bentuk glukoamilase dari Aspergillus niger yang
tumbuh pada medium cair yang mengandung pati tapioka sebagai sumber karbon.
Di sisi lain, saat α-amilase telah banyak diproduksi dari strain genus Bacillus,
beberapa usaha telah dilakukan untuk pemurnian dan karakterisasinya, baik dari
strain mesofilik maupun termofilik (El-Safey et al, 2004).
Proses perubahan karbohidrat menjadi glukosa secara enzimatik, melibatkan
kelompok enzim amilase. Oleh karena itu, enzim amilase banyak diisolasi, diteliti,
dan dipelajari sifat dan karakteristiknya. Gasperik et al telah mengisolasi dan
mengkarakterisasi enzim amilase yang diproduksi secara ekstraselular dari kultur
cair Endomycopsis fibuligera yang mengandung pati sagu. Selanjutnya dilakukan
pemisahan dengan metode HPLC menunjukkan bahwa amilase terdiri dari
beberapa enzim, diantaranya α-amilase (EC 3.2.1.1) dan amiloglukosidase (EC
3.2.1.3). Disamping itu mereka menemukan bahwa α-amilase dan
amiloglukosidase memiliki perbedaan stabilitas termal. Amiloglukosidase
tampaknya lebih stabil dibandingkan dengan α-amilase. Pengujian aktivitas enzim
amiloglukosidase dihitung dari jumlah glukosa yang diperoleh dari hidrolisis pati
dan diukur dengan metode Nelson-Somogy. Dari hasil percobaan Gasperik et al
menemukan bahwa aktivitas optimum α-amilase dicapai pada pH 5,8 sedang
Dimasukkan 2 ml kedalam tabung reaksi
Ditambahkan 8 ml reagen biuret
Didiamkan selama 30 menit
Diukur absorbansinya pada λ = 530 nm
Laboratorium Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
B. Alat dan Bahan a. Alat
Alat-alat yang digunakan pada praktikum ini yaitu tabung reaksi, pipet tetes,
pipet volume, filler, labu takar 50 ml, spektonik 20D, botol ampul, water bath dan
elektromantel.
b. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan yaitu crude enzim, enzim 40 %, enzim 80 %,
reagen biuret, substrat pati, buffer pH 4, 7 dan 9, DNS, es batu dan akuades.
C. Rancangan Percobaan
1. Penentuan Kadar Protein
- Pembuatan Kurva Standar Protein
Dimasukkan 2 ml kedalam masing-masing tabung reaksi
Ditambahkan 2 ml DNS
Didiamkan selama 30 menit
Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit
Didinginkan pada permukaan es batu
Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm
Dibuat kurva standar glukosa
Ditambahkan 8 ml reagen biuret
Didiamkan selama 30 menit
Diukur absorbansinya pada λ = 530 nm
Ditentukan kadar protein enzim - Pembuatan Kurva Standar Glukosa
Hasil Pengamatan
- Penentuan Kadar Protein
1 ml buffer pH 4
Dimasukkan dalam tabung reaksi
Diinkubasi selama 30 menit
Ditambahkan 2 ml DNS
Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit
Didinginkan pada permukaan air es
Diencerkan dengan akuades hingga 10 ml
Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm
Ditentukan aktivitas enzim 1 ml substrat
Dimasukkan dalam tabung reaksi
Ditambahkan 1 ml buffer pH 4
Diinkubasi selama 30 menit
Ditambahkan 2 ml DNS
Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit
Didinginkan pada permukaan air es
Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml
Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm
Ditentukan aktivitas enzim Hasil Pengamatan
2. Penentuan Aktivitas Enzim Amiloglukosidase - Karakterisasi pH 4, 7 dan 9 pada suhu kamar
a. Kontrol substrat
b. Blanko
0,5 ml enzim 40 %
0,5 ml crude
enzim 0,5 ml enzim 80 %
Masing-masing ditambahkan 1 ml substrat dalam tabung reaksi
Ditambahkan buffer pH 4 Diinkubasi selama 30 menit Ditambahkan 2 ml DNS
Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit Didinginkan pada permukaan air es
Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm Ditentukan aktivitas enzim
Hasil Pengamatan
1 ml substrat
Dimasukkan dalam tabung reaksi
Ditambahkan 1 ml buffer pH 7
Diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar
Ditambahkan 2 ml DNS
Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit
Didinginkan pada permukaan air es
Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml
Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm
Ditentukan aktivitas enzim Hasil Pengamatan
c. Aktivitas enzim glukoamilase
Keterangan : Dilakukan perlakuan yang sama untuk pH7 dan 9
- Karakterisasi suhu aktivitas enzim pada pH 7 1. Suhu Kamar
0,5 ml enzim 40 %
0,5 ml crude
enzim 0,5 ml enzim 80 %
Masing-masing ditambahkan 1 ml substrat dalam tabung reaksi
Ditambahkan buffer pH 7
Diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar
Ditambahkan 2 ml DNS
Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit
Didinginkan pada permukaan air es Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm Ditentukan aktivitas enzim
Hasil Pengamatan 1 ml buffer pH 7
Dimasukkan dalam tabung reaksi
Diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar
Ditambahkan 2 ml DNS
Dipanaskan dalam penangas selama 15 menit
Didinginkan pada permukaan air es
Deencerkan dengan akuades hingga 10 ml
Diukur absorbansinya pada λ = 540 nm
Ditentukan aktivitas enzim b. Blanko
c. Aktivitas enzim glukoamilase
Keterangan : Dilakukan perlakuan yang sama untuk variasi suhu 50 oC dan 100 oC
4. Karakteristik Suhu Aktif Enzim (pH 7)
Suhu (oC) Absorbansi
Crude Enzim Fraksi I (40 %) Fraksi II (80%) Kamar
5. Karakteristik pH Aktif Enzim (Suhu Kamar)
pH
Absorbansi
B. Pembahasan
Protein adalah makromolekul paling berlimpah di dalam sel hidup dan
merupakan 50 persen atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua
sel dan semua bagian sel. Protein merupakan senyawa polipeptida dengan berat
molekul besar dan tersusun atas unsur-unsur C, H, O, N, serta ada pula yang
mengandung unsur S dan P. Molekul protein terdiri atas unit-unit kecil asam
amino yang saling bersambung satu sama lain yang dihubungkan oleh ikatan
peptida. Protein merupakan senyawa yang sangat penting dalam semua sel hidup,
karena protein merupakan bagian esensial dari protoplasma. Selain itu, protein
juga berfungsi mengekspresikan informasi genetik.
Salah satu jenis protein yang sangat penting adalah enzim. Enzim
merupakan kelompok protein yang berperan sangat penting dalam proses aktivitas
biologi. Enzim berfungsi sebagai katalisator dalam sel dan sifatnya sangat khas.
Dalam jumlah yang sangat kecil enzim dapat mengatur reaksi tertentu sehingga
dalam keadaan normal tidak terjadi penyimpangan-penyimpangan hasil reaksinya.
Enzim akan kehilangan aktivitasnya akibat panas, asam atau basa kuat, pelarut
organik atau apa saja yang menyebabkan denaturasi protein. Melalui aktivitasnya,
sistem enzim terkoordinasi dengan baik menghasilkan suatu hubungan yang
harmonis di antara sejumlah aktivitas metabolik yang berbeda, yang diperlukan
untuk menunjang kehidupan. Enzim juga biasa disebut sebagai biokatalisator.
Enzim adalah katalisator sejati. Molekul ini meningkatkan secara nyata
kecepatan reaksi kimia spesifik yang tanpa enzim akan berlangsung sangat
tertentu. Penelitian terhadap spesifitas enzim menunjukkan bahwa molekul
substrat harus memiliki dua ciri struktural yang jelas, yaitu ikatan kimia spesifik
yang dapat diserang oleh enzim dan biasanya beberapa gugus lainnya yaitu gugus
pengikat yang berikatan dengan enzim dan mengarahkan molekul substrat dengan
tepat pada sisi aktif sehingga ikatan yang rapuh tapi tepat terletak pada posisi yang
berhubungan dengan gugus katalitik enzim. Mekanisme kerja enzim biasa
digambarkan dengan mekanisme kerja gembok dan anak kunci (lock and key).
Karena sifat spesifitasnya, banyak enzim diberi nama berdasarkan substratnya,
seperti enzim glukoamilase yang mengkatalisis hidrolisis pati menjadi molekul
yang lebih kecil, yakni glukosa.
Enzim glukoamilase (EC 3.2.1.3) merupakan kelompok enzim dari keluarga
amilase. Nama lain dari enzim ini adalah enzim amiloglukosidase. Enzim ini
berfungsi mengkatalisis reaksi hidrolisis pati (amilosa dan amilopektin) menjadi
molekul karbohidrat yang lebih kecil, yakni berupa monosakarida glukosa. Cara
kerja enzim ini adalah dengan memotong pati pada ikatan α1,4 dan
α1,6-glikosidik secara teratur dari ujung rantai pati, sehingga produk yang dihasilkan
berupa molekul α-D-glukosa.
Aktivitas enzim merupakan mikromol produk yang dihasilkan setiap 1
menit enzim bekerja. Untuk itu, ekstrak kasar enzim glukoamilase digunakan
untuk menghidrolisis larutan pati. Aktivitas enzim glukoamilase tersebut diukur
dari konsentrasi produk yang dihasilkan setelah proses hidrolisis selama 10 menit.
Konsentrasi produk dihitung dengan spektrofotometri menggunakan spektronik
dilakukan penambahan reagen DNS untuk membentuk kompleks berwarna
dengan produk (glukosa). Larutan blanko digunakan untuk menghilangkan
pembacaan absorbansi pati, air, enzim, dan DNS, sehingga pada saat larutan hasil
hidrolisis pati dibaca absorbansinya, hanya absorbansi glukosa yang terbaca oleh
alat spektronik 20D. Pembacaan absorbansi dilakukan triplo. Konsentrasi produk
kemudian dihitung dengan menggunakan persamaan regresi linear dari kurva
standar glukosa. Dari persamaan regresi tersebut, diketahui konsentrasi rata-rata
glukosa hasil hidrolisis pati oleh enzim glukoamilase sehingga aktivitas enzim
BAB V PENUTUP A. Simpulan
Simpulan dari percobaan ini yaitu bahwa enzim glukoamilase yang
dihasilkan oleh mikroba memiliki aktivitas.
B. Saran
Saran dari praktikan yaitu pelaksanaan praktikum hendaknya dapat lebih
DAFTAR PUSTAKA
Ahmad, Ahyar. 2003. Purification and Characterization of Amyloglucosidase Enzyme from Endomycopsis fibuligera, ISTECS Journal. Vol. 4. p. 47-55.
El-Safey, E.M. dan M.S. Ammar. 2004. Purification and Characterization of α-Amylase Isolated from Aspergillus falvus var. columnaris, Ass. Univ. Bull.
Environ. Res. Vol. 7 No. 1. p. 93-99.
Hart, Harold. 1983. Kimia Organik: Suatu Kuliah Singkat. Jakarta: Erlangga.
Lehninger, A.L. 1982. Dasar-Dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
