DIVERSITAS GENETIK VIRUS DENGUE DAN NYAMUK VEKTOR DI DAERAH ENDEMIK DEMAM BERDARAH DENGUE (DBD) DI KOTA PADANG DENGAN METODE POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR).

DIVERSITAS GENETIK VIRUS DENGUE DAN NYAMUK VEKTOR DI DAERAH ENDEMIK DEMAM BERDARAH DENGUE (DBD) DI KOTA PADANG DENGAN METODE

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Oleh:

Dra. Hasmiwati, M.Kes. Dr. Dahelmi, MS

Pendahuluan

• DBD masalah kesehatan serius

• KLB tahun 1970–1990 terjadi 4–6 thn Sekarang  3-4 thn  1-2 thn

• Virus dengue ditularkan nyamuk: Aedes spp.

• Terjadinya diversitas genetik nyamuk populasi nyamuk

tinggi , prevalensi penyakit meningkat.

• Terjadinya diversitas genetik nyamuk vektor

memungkinkan terjadi diversitas genetik serotype virus dengue yang ditularkannya

• Penularan virus dengue terjadi secara horizontal dan vertikal (transovarian).

• .Deteksi virus dengue dengan RT- PCR

• .Virus Dengue adalah Virus RNA

• .Variasi genetik virus dengue terjadi antara serotype

dan juga dalam serotype tergantung waktu dan

daerah penyebaran.

• .Beberapa peneliti yang telah mendeteksi virus

dengue pada nyamuk :Chow

et al

(1998),Harris,

et

al

(1998),Johnson

et al

(2005),Liotta

et al

(2005).

Tujuan Penelitian

• Tahun I

• Mengoleksi dan mengidentifikasi nyamuk vektor DBD (telur,larva dan dewasa)

• Mengetahui serotype virus dengue dari nyamuk vektor dengan metoda RT-PCR

• Menganalisis diversitas genetik serotype virus dengue dibanding dengan isolat Genebank

• Tahun II

• Menganalisis diversitas genetik nyamuk vektor DBD dengan metoda RAPD-PCR

Manfaat Penelitian

1.Informasi nyamuk vektor DBD

2.Serotype virus dengue

Metode Penelitian

1.Lokasi Penelitian

Daerah endemik,sporadik dan potensial DBD di Kota Padang Sumbar.

2. Pelaksanaan Penelitian Tahun I

a. Koleksi dan identifikasi nyamuk vektor b. Isolasi virus dengue dari nyamuk vektor c. Elektroforesis

d. Amplifikasi RNA virus dengue: RT-PCR

Metode Penelitian

• Tahun II

1. Isolasi DNA nyamuk vektor

2. Amplifikasi DNA nyamuk: RAPD-PCR

3. Elektroforesis

4. Diversitas Genetik virus DEN pada Nyamuk



Menginokulasikan virus dengue ke 4 serotipenya pada

nyamuk dewasa secara intrathorasik



Dipelihara 14 hari, diisolasi virus, di

Komposisi Reaksi 1 step RT-PCR

Komponen Volume/Raksi Rnase free water 7,5 μl

Program Reverse Transkriptase dan Amplifikasi :

Reaksi Suhu

(ºC ) (menit) Waktu Jumlah siklus

Reverse Transcriptase (RT) 50 30

Initial PCR 95 15

Denaturation 94 1

Annealing 55 1 40 x

Extension 72 1

Analisis Data

1. Serotype virus dengue: Dengan program Clustal X

Pohon filogenetik: distance method, parsimony dan likehood method, menggunakan software Philip versi 3.5c PAUP*Ver.4.10b

2. Diversitas genetik serotype virus dengue: sama dgn 1 3. Diversitas genetik nyamuk vektor: Menggunakan

program NTSYs-PC, Gambaran dendrogam: UPGMA

Hasil dan Pembahasan

• 1. Distribusi Kasus DBD

• Hasil Survei kasus DBD Jan s/d Mei

• 2009 di : RSU BMC : 89 kasus

• RS Yos Sudarso : 130 kasus

• RSUD :118 kasus

Jenis dan karakter sampel

Jenis nyamuk Lokasi Jumlah individu

♂ ♀ Jumlah

Aedes aegypti Belimbing* 104 179 283

Aedes aegypti SD I B. Mulia* 152 150 302

Aedes aegypti Gadut* 94 94 188

Aedes albopictus Gadut* 58 53 111

Aedes aegypti SD I B. Mulia** 78 65 140

Aedes aegypti Gadut** 102 194 264

Total 585 696 1288

[image:13.780.57.524.142.406.2]

• Hasil Isolasi Virus Dengue pada nyamuk

Gambar 1.Elektroferoragram RNA Virus Dengue Lokasi Gadut 1. RNA virus dari serum 2.

-3. RNA virus A. aegypti jantan

4. RNA virus A. aegypti jantan dan betina 5. RNA virus A. aegypti betina

6. RNA virus A. aegypti jantan

7. RNA virus A. aegypti jantan dan betina 8. RNA virus A. aegypti betina

-• Gambar 2 :Elektroferogram RNA Virus Dengue Lokasi SDI BM (Simp.Haru) 1. RNA virus A. aegypti jantan dan betina Gadut 2. RNA virus A. aegypti betina Sp. Haru

3. RNA virus A. aegypti jantan Sp. Haru 4. RNA virus A. aegypti betina Sp. Haru

5. RNA virus A. aegypti jantan dan betina Sp. haru 6. RNA virus A. albopictus jantan dan betina Gadut 7. RNA virus A. aegypti betina Belimbing

[image:14.780.131.356.117.391.2]

• Amplifikasi RNA Virus Dengue

• Elektroferogram Virus Dengue dengan RT-PCR Lokasi Gadut. M. Marker

1. RNA virus dari serum

2. RNA virus A. aegypti betina 3. RNA virus A. aegypti jantan

4. RNA virus A. aegypti jantan & betina 5. RNA virus A. aegypti betina

6. RNA virus A. aegypti jantan

Elektoferogram Virus dengue Dengan RT-PCR lokasi SDI BM (Simp.Haru).

M. Marker

1. Kontrol negatif

2. RNA virus A. aegypti jantan dan betina Gadut 3. RNA virus A. aegypti betina Sp. Haru

4. RNA virus A. aegypti jantan Sp. Haru 5. RNA virus A. aegypti betina Sp. Haru

Kesimpulan

1. Seluruh kecamatan kota Padang endemik DBD.

2.

Ae.aegypti

dan

Ae.albopictus,

vektor DBD di kota

Padang

Saran

1. Deteksi Virus dengue pada nyamuk vektor perlu dilakukan secara terus menerus sepanjang tahun untuk mengantisipasi terjadi KLB DBD.

Rencana penelitian tahun II

1. Mengetahui Diversitas genetik nyamuk vektor.

Rencana Tahun II

• Dari hasil koleksi dan Identifikasi nyamuk vektor DBD di kota Padang ternyata telah didapatkan bahwa nyamuk yang berperan sebagai vektor DBD di kota Padang adalah nyamuk Ae. aegypti dan Ae. albopictus. Serta telah dilakukan deteksi virus dengue pada nyamuk ini dan didapatkan

bahwa virus dengue yang terdeteksi adalah virus dengue serotype 2 yang didapatkan pada nyamuk Ae. Aegypti dan Ae.albopictus.

• Untuk mengetahui diversitas genetik virus,mengetahui kemampuan

perkembangan virus dengue pada nyamuk vektor dan diversitas nyamuk vektor perlu dilakukan penelitian lanjutan tahun kedua. Karena dengan diketahui diversitas genetik nyamuk vektor dan diversitas virus pada nyamuk ini di harapkan sangat penting untuk membantu dalam

Isolasi RNA Virus

Isolasi Virus Dengue dgn Kit Isolasi RNA Viral Qiagen (QiAmp Viral RNA mini kit} • _{30 ekor nyamuk dimaserasi dlam 60 μl PBS.}

• Digerus dengan pelet pestel

• Ditambah 560 µl buffer AVL yang telah dipanaskan 80ºC. • Tambahkan 5,6 ul RNA carrier + buffer AVL.

• Vortex 15 detik.Inkubasi 10 menit pada suhu kamar. • Sentifus singkat,Tambahkan 560 ul etanol absolut. • Vortex 15 detik dan sentrifus singkat.

• Diambil 630 μl larutan ,masukakan ketabung pengumpul.

• Sentrifuse,8.000 rpm 1 menit, ulangi sampai semua lisat habis.

• Buang tabung yang berisi lisat dan ganti dengan tabung baru tambahkan • 500 µl buffer AW1, sentrifuse 8.000 rpm selama 1 menit.

• Buang tabung yg berisi filtrat ganti tabung baru ,tambahkan 500 μl buffer AW2 ,sentrifuse 14.000 rpm selama 3 menit.

• Buang tabung yang berisi filtrat ganti dengan tabung baru.tambahkan 60 μl buffer AVE, inkubasi 1 menit pada suhu kamar.

• Sentifuse 8.000rpm 1 menit

Primer RT-PCR

• Primer yang digunakan adalah :

• DF: 5 TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G 3 • DR1: 5 CGT CTC AGT GAT CCG GGG G 3

Elektroforesis

-Hasil isolasi RNA dielektroforesis pada agarose 1.5 % dalam

1% BBE ( Borate Boric EDTA pH 7,5).

- Hasil Amplifikasi dielektoforesis pada agarose 2% dalam 0,5 TBE (Tris Borate EDTA}.

-Divisualisasi ,uv transluminator,foto polaroid

Sequensing

Pohon Filogenetik

Dengan program software berdasarkan metoda statistik:

Distanced methode

jarak evolusinya dihitung untuk semua pasangan taxa dan pohon filogenetik dibuat berdasarkan hubungan diantara nilai nilai jarak tersebut.

Parsimoni methode

didasarkan pada jumlah terkecil subsitusi nukleotida yang menjelaskan keseluruhan proses evolusi untuk membuat pohon filogenetik

Likehood methode

Metode Thn II

Isolasi DNA

nyamuk(Hoelzel,1994)

100ul buffer CTAB 10x

Dipanaskan pada waterbath 10 menit 60 C Tambahkan 1 ekor nyamuk ,gerus

Tambah 5 ul proteinase K dan 1ul 2mercaptoethanol Di vortek dan diinkubasi pada waterbath ,2 jam,60 C

Tambahkan 200 ul TE(50mM Tris/10mM,ph 8) dan200 ul phenol dan 200 ul kloroform: isoamil;alkohol(24:1) Sentrifus 13.000 rpm ,10 menit

Supernatan pindah ke tbg baru tambah 200 ul kloroform: isoamil alkohol (24:1) Sentrifuse 13.000 rpm, 10 menit

Supernatan diambil tambah 200ul isopropanol

Presipitasi dalam freezeer shu -20oC selama 1 malam

Disentrifus 13.000 rpm 10 menit,pellet diambil tambah 200 ul TE(50 mM Tris/10 mMEDTA,ph 8) tambah 20 ul ammonium asetat dan 500 ul alkohol absolut.

Dipresipitasi pada suhu -70oC 1 jam Sentifus 13.000 rpm,10 menit

Larutan dibuang pellet ditambah 500 ulethanol 70% dingin Disentrifus 13.000 rpm ,5 menit

Reaksi RAPD-PCR

(William et.al.,1990)

-2,5 ul buffer PCR

-2,5 ul Mgcl2 25 mM

-0,2 ul d NTP (dATP,dCTP,dGTP dan dTTP)

-0,2 ul Taq polymerase

-3-5 ul DNA

-2,0 ul primer

- untuk total 25 ul tambah mineral oil

- kontrol negatif tanpa DNA

Siklus PCR yang digunakan:

• -Denaturasi awal 94oC 4 menit 1x -Denaturasi 94oC, 1 menit

-Annealing 35oC ,1 menit

-polimerisasi 72oC ,10 menit

-sampel disimpan 4oC ,1 malam

Primer yang dipakai:

OPE 17 :5' CTACTGCCGT 3' OPF 4 :5' GGTGATCAGG 3' OPF 2 :5' GAGGATCCCT 3'

Elektroforesis

• - Hasil amplifikasi dipisahkan dengan gel elektroforesis

1,2 % pada larutan TBE 1x

(Sambrook et al., 1989)

-Divisualisasi , uv transluminator,foto polaroid

-Pita DNA hasil amplifikasi diskor 1 dan 0

dianalisis dengan NTSYs-PC

- Polimorfisme : pita DNA yang tdk selalu hadir pada

semua sampel

Inokulasi virus pada nyamuk

Teknik Inokulasi, jarum dan alat suntik yang dipergunakan

adalah menurut cara Rosen dan Gubler (1974). Serum yang akan diinokulasikan diencerkan dalam garam dapar fosfat pH 7,4 yang mengandung 0,5% gelatin dan 5% serum anak sapi yang dipanaskan selama 30 menit pada suhu 56 oC.

Nyamuk Aedes jantan dan betina didapat dari lapangan

dengan pengoleksian telur (Ovitrap) setelah itu dipelihara di laboratorium sampai dewasa dengan pemberian makanan buatan. Serum yang mengandung Virus dengue disuntikan pada nyamuk yang telah dibius dengan menggunakan

tabung kapiler yang ujungnya runcing (diruncingkan diatas nyala api). Nyamuk yang telah diinokulasi dipelihara

• Hasmiwati : Ketua peneliti

- Survey,koleksi sampel,identifikasi nyamuk vektor,

isolasi RNA/DNA,amplifikasi,mmengolah

data,membuat laporan.

• Djong Hon Tjong : anggota peneliti

- isolasi RNA/DNA, amplifikasi,analisis data

• Dahelmi : anggota peneliti

- Koleksi sampel,identifikasi nyamuk vektor,membuat

laporan

• Nurhayati : anggota peneliti