ISOLASI PROTEIN
A. TUJUAN- Memisahkan kadar protein dalam organ - Mengetahui cara mengisolasi protein B. TINJAUAN PUSTAKA
Istilah protein berasal dari protos atau proteus yang berati pertama atau utama. Protein merupakan komponen penting dan utama pada sel hewan atau manusia. Karena sel merupakan komponen pembentuk tubuh, maka protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat pembentuk dan pertumbuhan tubuh.
Fungsi dari protein :
1. zat pembentuk dan pertumbuhan tubuh 2. biokatalisator
3. sumber energi (jika tubuh kekurangan karbohidrat dan lemak)
4. sebagai pengangkut oksigen dari paru-paru ke seluruh tubuh(Hemoglobin).
Ciri-ciri molekul protein :
1. protein mempunyai molekul besar dengan berat molekul bervaruasi. 2. umumnya terdiri dari 20 macam asam amino.
3. terdapatnya ikatan kimia lain.
4. strukturnya tidak stabil terhadap beberapa faktor :
- pH - tempetarur - deterjen
- radiasi - medium pelarut organik 5. umumnya reaktif dan sangat spesifik.
Protein mempunyai sifat yang berbeda-beda. Ada protein yang mudah larut dalam air, tetapi ada juga yang sukar larut dalam air. Rambut da n kuku adalah suatu protein yang tidak larut dalam air dan tidak mudah bereaksi, sedangkan protein yang terdapat dalam bagian putih telur mudah larut dalam air dan mudah bereaksi.
1. Protein serat
Merupakan susunan rantai polipeptida di dalam suatu lembaran yang panjang. Protein serat menjalankan fungsi pertahanan luar karena merupakan komponen utama dari lapisan kulit luar, rambut, bulu, dan tanduk. Protein serat juga memiliki fungsi sebagai penyangga kekuatan dan pemberi bentuk seperti pada tulang-tulang rawan, urat, dan lapisan kulit sebelah dalam.
2. Protein Globular
Merupakan rantai polipeptida yang berlipat dengan rapat sehingga menjadi bentuk bulat atau globular yang kompak. Protein globular dapat berupa enzim, protein dalam darah, antibodi, hormon, sebagai komponen membran dan ribosom.
Berdasarkan peranan biologisnya protein dapat digolongkan menjadi : a. Enzim
Merupakan polipeptida yang mempunyai aktivitas katalisis. Hampir pada semua reaksi kimia bio molekul organik didalam sel dikatalisis oleh enzim. Terdapat lebih dari 2.000 jenis enzim yang dapat menkatalisis reaksi kimia yang berbeda dan telah ditemukan di dalam berbagai bentuk kehidupan.
b. Protein transport
Terdapat di dalam plasma darah untuk mengikat dan membawa molekul atau ion spesifik dari satu organ ke organ lain. Plasma darah mengandung lipoprotein yang membawa lipid dari hati ke organ lain. Protein transport juga terdapat di dalam membran sel dan menyesuaikan strukturnya untuk mengikat dan membawa glukosa, asam amino dan nutrien lain melalui membran menuju ke dalam sel.
c. Protein nutrien dan penyimpan
Pada biji berbagai tumbuhan terdapat protein nutrien yang dibutuhkan untuk pertumbuhan embrio tanaman, contohnya protein biji gandum, jagung, dan beras. Ovalbumin merupakan protein utama pada putih telur, kasein merupakan protein utama pada air susu sedangkan ferritin merupakan protein jaringan hewan yang berfungsi menyimpan Fe.
Beberapa protein memberi kemampuan kepada sel dan mikroorganisme untuk berkonstaksi, mengubah bentuk dan bergerak. Aktin dan Miosin merupakan protein filamen yang berfungsi di dalam sistem kontaktil otot kerangka dan sel yang bukan otot. Mikrotubulin meruoakan komponen penting pada flagela dan silia yang dapat menggerakkan sel.
e. Protein struktural
protein yang berperan sebagai filamen, serabut dan lembaran penyangga untuk memberi steruktur biologi kekuatan atau proteksi. Komponen utama dari urat dan tulang rawan adalah protein serabut kolagen, yang mempunyai daya tegang yang tinggi. Pada persendian terdapat terdapat elastin, yaitu suatu protein yang mampu meregang kedua dimensi. Rambut, kuku dan bulu burung atau ayam terdiri dari protein yang tidak larut dan liat yang disebut keratin. Komponen utama dari serat sutra dan jaring laba-laba adalah protein fibroin.
f. Protein pertahanan
Imunoglobulin atau antibodi pada hewan vertebrata merupakan proteun khusus yang dinuat oleh limfosit yang dapat mengenali dan menetralisisr infeksi virus, bakteri atau protein asing. Fibrinogen dan trombin merupakan protein penggumpal darah yang menjaga kehilangan darah jika sistem pembuluh darah terluka. Bisa ular, toksin bakteri dan protein tumbuhan beracun juga dapat berfungsi pada pertahanan tubuh.
g. Protein pengatur
Berbagai protein membantu mengatur aktivitas seluler atau fisiologi. Misalnya hormon insulin yang mengatur metabolisme glukosa sehingga apabila terjadi kelainan akan menyebebkan diabetes. Hormon pertumbuhan dari pituitari dan hormon parateroit mengatur transport kalsium dan fosfat.
h. Protein lain
Merupakan protein yang luar biasa dengan sifat dan fungsi yang berbeda yang terbuat dari 20 asam amino esensial yang sama, misalnya protein antibeku, monelin dan resilin.
Monelin merupakan suatu protein dari sejenis tanaman di afrika yang
beberapa serangga yang bersifat sangat elastis. Protein antibeku, pada darah ikan di Antartika yang melindungi darah ikan dari pembekuan.
Komposisi rata-rata unsur kimia dalam protein adalah C 50%, H 7%, O 23%, N 16%, S 0-3% dan P 0-3%.
C. MATERI DAN METODE Alat dan Bahan
☺Alat - alat penggores - sentrifuge - tabung sentrifuge - tabung reaksi - refrigerator - tabung cuvette - spektrofotometer ☺Bahan
- organ (jantung, hati, lien, otot, dll) - PBS (Phosphat Buffer Salina) - (NH4)2SO4
- Larutan biuret ☺Isolasi Protein Organ
5-10 gr (jantung, hati, lien, otot, dll) Digerus halus
Tambahkan PBS ± 10 ml dicampur rata Sentrifuge 5000 g, 30’- 60’
(NH4)2SO4 dicampur 1 : 1
Diresuspensikan di dalam kulkas 10’ Sentrifuge 3500 g, 15’
Diambil pelletnya, kemudian + PBS UJI BIURET
- memakai serum - hanya biuret saja
0,5 (± 10 tetes) larutan protein +19 ml larutan NaCl + 1 ml serum/plasma Mix 5 ml larutan biuret Panaskan 38°C, 35 menit Ambil 2 ml masukkan ke cuvette
Spektrofotometer 555Ǻ D. HASIL PRAKTIKUM
Setelah sentrifuge yang kedua didapat dua lapisan. Lapisan atas adalah supernatan dan lapisan bawah merupakan pellet. Sentrifuge yang ke dua ini, pelletnya yang diambil karena pellet tersebut adalah protein yang mengendap. E. PEMBAHASAN
Praktikum isolasi protein kali ini menggunakan protein dari organ jantung ayam. Pertama-tama organ jantung tersebut dihilangkan lemaknya dan dipotong kecil-kecil, kemudian digerus sampai halus. Penggerusan ini bertujuan agar kita
memperoleh protein dari organ jantung tersebut maka protoplasma akan keluar dan akan diperoleh protein, sebab didalam protoplasma tersebut terkandung protein.
Setelah digerus sampai halus, organ tersebut dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge dan diberi PBS (Phosphat Buffer Salina) ± 10 ml yang bertindak sebagai larutan penyangga protein agar tidak rusak. Selain itu PBS juga menjaga pH agar selalu tetap. Kemudian larutan yang bercampur disentrifuge 30’. Tujuannya untuk memisahkan protein berdasarkan berat jenisnya. Dengan daya gravitasi tinggi, sedimentasi molekul berbanding lurus dengan berat molekul dan bentuknya. Dengan senyawa terutama protein. Suatu molekul dengan berat molekul berbagai senyawa terutama protein. Suatu molekul dengan berat molekul besar akan berada dibawah menjadi pellet, sedangkan molekul dengan berat molekul yang kecil akan berada diatas menjadi supernatan.
Hasil sentrifuge yang pertama ini diambil supernatannya karena di dalam supernatan inilah terdapat protein. Supernatan yang diambil kemudian dicampur dengan Amonium Sulfat/ (NH4)2SO4 yang berfungsi untuk mengkonsentrasikan
protein yang ada pada protein. Perbandingan campuran antara supernatan dengan Amonium Sulfat adalah 1 : 1. kemudian campuran tersebut diresuspensikan ke dalam kulkas ± 10-15’. Hal ini dilakukan agar dengan suhu yang rendah akan memudahkan protein berikatan dengan Amonium Sulfat, sehingga berbentuk larutan yang agak pekat sedangkan apabila pada suhu rendah akan mengakibatkan turunnya daya larut protein.
Setelah diresuspensikan larutan tersebut disentrifuge kembali. Pada sentrifuge kedua ini yang diambil adalah pelletnya. Pellet tersebut dihasilkan dari protein yang berikatan dengan (NH4)2SO4. Setelah supernatan di buang pellet tersebut ditambah
dengan PBS lagi.
Pellet tersebut digunakan untuk uji biuret. Larutan biuret adalah suatu larutan yang terdiri dari 1, 5 tembaga (II) Sulfat Pentahidrat, 6 gram Natrium Tetrahidrat dalam 500 ml air, ditambah 300 ml 10% larutan carbonate-free sodium hydroxixe, kemudian volume ditambah sampai 1000 ml. dalam media alkalis iom tembaga (II) berikatan dengan 4 atom Nitrogen yang terbagi dari kelompok –CONH2, reaksi
yang terjadi diberikan diberikan oleh –CHNH2CH2OH dan –CHNH2, - C(NH)NH2,
serta oleh biuret sendiri.
Pada uji biuret untuk sampel protein, disediakan 2 tabung, yang satu untuk protein dan yang satu lagi untuk blanko. Tabung bersampel nama protein berisi 5 ml biuret, o,25 protein dan 4, 75 NaCl. Tabung bersampel nama blanko berisi 5 ml biuret dan 5 ml NaCl( jenuh), fungsi blanko sebagai pembanding.
Kemudian kedua tabung dipanaskan di atas penangas air dengan suhu 30°C. suhu 38°C adalah suhu optimal sehingga reaksi dapat berjalan dengan optimal. Setelah 30’ ambil kedua tabung tersebut dan masukkan masing-masing larutan ke dalam cuvette, dengan ukuran sama, dan masukkan kedalam spektrofotometer. Teknik spektrofotometer telah lama dilakukan sebagai suatu teknik yang handal untuk deteksi, identifikasi dan pengukur kadar senyawa kimia dalam suatu larutan. Pada percobaan ini spektrofotometer digunakan untuk menghitung protein yang telah diwarnai oleh biuret dengan menggunakan cahaya, panjang gelombang 555Å. Biuret memberikan warna pada protein maka dapat diukur atau dibaca oleh spektrifotometer. Prinsip spektrofotometer yaitu menangkap cahaya monokromatis. Cahaya monokromatis merupakan cahaya satu warna dengan satu panjang gelombang, sehingga cahaya yang diserap oleh larutan berwarna dapat diukur.
Pada praktikum kali ini tidak dilakukan uji biuret. Rumus perhitungan kadar protein :
Y = ax + b Y = angka yang diperoleh dari spektrofotometer a = tetapan (0,0671)
b = tetapan (0,0126) x = kadar protein F. KESIMPULAN
Protein yang digunakan pada praktikum kali ini diperoleh dari protoplasma organ jantung ayam, yang keluar saat organ tersebut dihancurkan. Setelah sentrifuge yang kedua, di ambil pelletnya dan pellet tersebut adalah protein yang mengendap.
Poedjiadi, Anna dan Supriyanti, Titin. 2005. DASAR-DASAR BIOKIMIA. Jakarta : Universitas Indonesia
Sutresna, Nana. 2002. KIMIA. Bandung : Grafindo Media Pratama
Thenawidjaja, Maggy. 1994. LEHNINGER DASAR-DASAR BIOKOMIA. Jakarta : Erlangga
http://www.jvetunud.com/archives/100/
http://csm.jmu.edu/biology/courses/bio480_580/mblab/protein_isolation.htm http://www.springerlink.com/content/t532030777hu376h/
