TESIS
AKTIVITAS ANTI-Mycobacterium tuberculosis KOMBINASI
(-)-EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT
ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA
ANGGITA MIRZAUTIKA
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
TESIS
AKTIVITAS ANTI-Mycobacterium tuberculosis KOMBINASI
(-)-EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT
ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA
ANGGITA MIRZAUTIKA
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
Prasyarat Gelar Magister
AKTIVITAS ANTI-Mycobacterium tuberculosis KOMBINASI (-)-EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT
ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA
TESIS
Untuk mempeoleh Gelar Magister
dalam Program Magister Program Studi Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi Universitas Airlangga
Oleh :
ANGGITA MIRZAUTIKA
NIM 051314153027
PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI ILMU FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS AIRLANGGA
SURABAYA
Penetapan Panitia Penguji Tesis
Telah Diuji pada
Tanggal 11 Januari 2016
PANITIA PENGUJI TESIS
Ketua : Prof. Dr. Noor Erma Nasution, MS., Apt. Anggota :
1. Dr. Isnaeni, MS., Apt.
2. Prof. Dr. Djoko Agus Purwanto, M.Si., Apt. 3. Prof. Dr. Mangestuti Agil, MS., Apt.
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur peneliti panjatkan ke hadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat-Nya sehingga tesis yang berjudul “AKTIVITAS ANTI-Mycobacterium tuberculosis KOMBINASI (-)-EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA” dapat terselesaikan.
Tersusunnya tesis ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak baik secara moral dan material. Oleh karena itu, pada kesempatan ini tak lupa peneliti menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang sedalam-dalamnya kepada : 1. Allah SWT yang telah memberikan kesehatan, kemudahan dan kelancaran
selama proses pengerjaan tesis ini
2. Ayahanda dan Ibunda tercinta, adik, kakak, serta keluarga yang senantiasa memberikan kasih sayang, perhatian, dukungan, serta doa pada peneliti
3. Dr. Isnaeni, MS., Apt. selaku pembimbing utama dan Prof. Dr. Djoko Agus Purwanto, M.Si., Apt. selaku pembimbing serta atas segala waktu, kesabaran, ketelitian, bimbingan serta masukan selama peneliti menyelesaikan tesis ini 4. Prof. Dr. H. Mohammad Nasih, MT., SE., Ak. selaku Rektor Universitas
Airlangga yang telah memberikan kesempatan untuk menyelesaikan program pendidikan pascasarjana di Universitas Airlangga
5. Dr. Umi Athiyah, Dra., MS., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan untuk menyelesaikan program pendidikan pascasarjana prodi Ilmu Farmasi
6. Prof. Dr. Bambang P.E.W., M.S., Apt. selaku Ketua Prodi Ilmu Farmasi, Program Pascasarjana Fakultas Farmasi Universitas Airlangga yang telah memberikan kesempatan untuk menyelesaikan program pendidikan pascasarjana prodi Ilmu Farmasi
vii
8. Prof. Dr. Noor Erma Nasution, MS., Apt., Dr. Riesta Primaharinastiti, M.Si., Apt., dan Prof. Dr. Mangestuti Agil, MS., Apt. selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan masukan hingga terselesaikan tesis ini
9. Penanggung jawab Laboratorium Tuberkulosis, Institute of Tropical Disease, Universitas Airlangga, Prof., Dr. Ni Made Mertaniasih, dr., MS., Sp.MK. dan Penanggung Jawab Laboratorium Kimia Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Febri Annuryanti, S.Farm., Apt. yang telah memberikan ijin, kesempatan dan fasilitas untuk bekerja di laboratorium serta segala bantuan selama penelitian
10.Karyawan Prodi Ilmu Farmasi, Mas Arie, serta karyawan Departemen Kimia Farmasi dan Laboratorium Tuberkulosis di ITD Universitas Airlangga, Bu Wati, Pak Bakir, Pak Kusairi, Pak Sugeng, Mba Agnes, Desak, serta staf-staf yang lain atas semua bantuan waktu dan tenaga selama penyelesaian tesis ini 11.Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Airlangga atas segala bimbingan
dan bekal ilmu yang diberikan selama masa pendidikan
12.Sahabat dan teman seperjuangan di Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Ranny, Ita, Mba Engrid, Putri, tempat berbagi suka dan duka, terima kasih atas dukungan dan semangatnya.
13.Teman-teman kos di Jl. Gubeng Kertajaya 7E/34 Surabaya, tempat berkeluh kesah selama ini, terima kasih atas dukungan dan semangatnya.
14.Rekan kerja di Apotek Farmasi Airlangga, Ayek, Ishma, Endah, Bu Anik, Mba Vita, Mas Andik, Pak Tanto, dan Mas Budi, terima kasih atas dukungan dan semangatnya.
15.Semua pihak yang secara langsung maupun tidak langsung membantu terselesaikannya tugas akhir ini.
Tidak ada satupun kebenaran dan kesempurnaan kecuali milik Allah SWT. Akhirnya, tesis yang masih banyak kekurangan ini peneliti persembahkan kepada almamater Fakultas Farmasi Universitas Airlangga dengan harapan semoga bermanfaat bagi kita semua.
RINGKASAN
AKTIVITAS ANTI-Mycobacterium tuberculosis KOMBINASI (-)-EPIGALLOCATECHIN-GALLATE (EGCG) DAN OBAT
ANTITUBERKULOSIS LINI PERTAMA
Anggita Mirzautika
Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit infeksi yang disebabkan Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). Jutaan orang di dunia terserang infeksi TB tiap tahun. Estimasi terakhir menunjukkan terdapat 8,6 juta kasus TB baru pada tahun 2012 dan 1,3 juta meninggal dunia (WHO1, 2013).
Durasi pengobatan TB minimal enam bulan. Regimen fase inisiasi selama dua bulan yaitu pemberian Isoniazid (INH), Rifampicin (RIF), Pyrazinamid (PZA), dan Ethambutol (EMB) setiap hari. Walaupun regimen selama enam bulan (fase inisiasi dua bulan dengan fase kontinuasi INH dan RIF selama empat bulan) merupakan pilihan yang banyak digunakan, regimen fase kontinuasi alternatif juga dapat digunakan. Fase kontinuasi alternatif yaitu pemberian INH dan EMB selama enam bulan, sehingga durasi pengobatan keseluruhan menjadi delapan bulan (Tuberculosis Coalition for Technical Assistance, 2006).
Mekanisme penghambatan M. tuberculosis oleh RIF yaitu menghambat DNA-dependent RNA polymerase dari mikobakteria dengan menekan mula terbentuknya rantai dalam sintesis RNA, sehingga M. tuberculosis tidak bisa memperbanyak diri (Sulistia, 2007). Mekanisme penghambatan M. tuberculosis oleh INH yaitu setelah diaktivasi oleh enzim catalase/peroxidase, INH dapat mengganggu sintesis asam mikolat penting dengan menghambat enzim NADH-dependent enoyl-ACP reductase, sehingga tidak terbentuk dinding sel M. tuberculosis (Silva dan Palomino, 2011). Mekanisme penghambatan M. tuberculosis oleh PZA yaitu setelah diubah menjadi bentuk aktifnya, pyrazinoic acid, oleh enzim pyrazinamidase/nicotinamidase (PZase), PZA mengganggu pembentukan membran bakteri dan menghambat transportasi membran (Silva dan Palomino, 2011). Selanjutnya mekanisme penghambatan M. tuberculosis EMB yaitu mengganggu biosintesis arabinogalactan pada dinding sel (Silva dan Palomino, 2011).
ix
Pada penelitian ini digunakan senyawa polifenol yang telah diisolasi dari ekstrak teh hijau (Camellia sinensis) untuk dikombinasikan dengan OAT yaitu (-)-epigallocatechin-gallate (EGCG) yang merupakan senyawa polifenol dominan. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Anand et al. (2006), EGCG memiliki kemampuan inheren untuk menurunkan aktivitas transkripsi gen host tryptophan-aspartate containing coat protein (TACO) dalam makrofag manusia melalui kemampuannya menghambat faktor transkripsi SP1. Penurunan ekspresi gen TACO oleh EGCG dibarengi dengan penghambatan hidup mycobacterium dalam makrofag, sehingga disarankan untuk menggunakan EGCG sebagai anti infeksi tuberkulosis (Anand et al., 2006). Jika dikombinasikan dengan OAT lini pertama, EGCG diharapkan memberikan peningkatan aktivitas antituberkulosis. Penentuan minimum inhibitory concentration (MIC) masing-masing OAT lini pertama dan kombinasinya dengan EGCG dilakukan untuk membuktikan bahwa EGCG dapat meningkatkan potensi masing-masing OAT lini pertama (INH, RIF, PZA dan EMB) terhadap M. tuberculosis.
Mycobacterium tuberculosis yang digunakan untuk penelitian ini adalah M. tuberculosis strain H37Rv karena diharapkan hasil yang diperoleh dapat menggambarkan aktivitas antituberkulosis kombinasi EGCG dengan OAT terhadap M. tuberculosis yang sensitif. Penentuan MIC yang dilakukan pada penelitian ini menggunakan metode broth dilution dengan medium cair Middlebrook 7H9, setelah diinkubasi lalu dilihat angka kekeruhannya dengan alat nephelometer pada hari ke-0, 7, 14, 21 dan 28. Minimum inhibitory concentration (MIC) masing-masing OAT sebelum dan setelah kombinasi yang telah ditentukan, kemudian dibandingkan, sehingga dapat diamati bahwa penambahan EGCG dapat menurunkan MIC masing-masing OAT lini pertama.
Hasil yang didapatkan dari penentuan MIC masing-masing OAT sebelum dikombinasikan dan MIC EGCG yaitu 5 ppm, 0,5 ppm, 50 ppm, 5 ppm, dan 150 ppm,secara berurutan untuk RIF, INH, PZA, EMB dan EGCG. Nilai MIC EGCG yaitu 150 ppm, selanjutnya merupakan konsentrasi yang dikombinasikan dengan masing-masing OAT lini pertama.
Penentuan MIC OAT yang telah dikombinasikan dengan EGCG 150 ppm memberikan hasil yaitu 0,5 ppm, 0,25 ppm, 20 ppm, dan 2 ppm, secara berurutan untuk RIF, INH, PZA, dan EMB.
Berdasarkan hasil tersebut, dapat dilihat bahwa MIC OAT setelah dikombinasikan dengan EGCG menurun dibandingkan sebelum dikombinasikan, dengan persentase penurunan MIC sebesar 90%, 50%, 60% dan 60%, secara berurutan untuk RIF, INH, PZA, dan EMB. Hal ini disebabkan karena mekanisme EGCG dalam menghambat pertumbuhan M. tuberculosis berbeda dengan mekanisme OAT menghambat, sehingga memberikan efek sinergis.
ABSTRACT
Anti-Mycobacterium tuberculosis Activity of (-)-Epigallocatechin-gallate (EGCG) and First-line Antituberculosis Drugs Combination
Tuberculosis (TB) is a global health issue, and moreover there are increasing cases of multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB) in the world. So the researchers have been trying to find new tuberculosis therapy that is more effective. In this study, the therapy that has been chosen is (-)-epigallocatechin-gallate (EGCG), from tea leaves (Camellia sinensis), used in combination with each of the first line antituberculosis drugs. The aim of this study is to find whether EGCG can increase the activity of the first line antituberculosis drugs against M. tuberculosis. If EGCG can increase their activity, it can be new alternative tuberculosis treatment that is more effective. The minimum inhibitory concentration (MIC) of each antituberculosis drug was determined by broth dilution method using Middlebrook 7H9 medium, the MIC result was 5 ppm, 0.5 ppm, 50 ppm and 5 ppm for rifampicin, isoniazid, pyrazinamide and ethambutol, respectively. Then the MIC of EGCG combination with each antituberculosis drug was also determined by the same method. The MIC after combination was 0.5 ppm, 0.25 ppm, 20 ppm and 2 ppm for rifampicin, isoniazid, pyrazinamide and ethambutol, respectively. The result shows that the MIC of each first line antituberculosis drug was decreased due to the combination of EGCG. It shows that EGCG gives synergism effect when combined with those drugs, so it can be concluded that EGCG can be used as a complement of antituberculosis drugs for more effective tuberculosis therapy.
xi
PERNYATAAN ORISINALITAS KARYA ILMIAH ... v
UCAPAN TERIMA KASIH ... vi
2.1.3 Drug-resistance Tuberculosis (DR-TB) ... 14
2.1.4 Terapi Penyakit TB ... 15
2.2 Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) ... 17
2.3 Obat Antituberkulosis (OAT) Lini Pertama ... 21
2.3.1 Rifampicin (RIF) ... 21
2.3.2 Isoniazid (INH) ... 23
2.3.4 Ethambutol (EMB) ... 26
2.4 (-)-Epigallocatechin-Gallate (EGCG) ... 28
2.4.1 Sifat Fisikokimia EGCG ... 29
2.4.2 Mekanisme EGCG sebagai Antimikroba ... 29
2.5 Metode Penentuan Minimum Inhibitory Concentration (MIC) ... 31
2.5.1 Metode Dilusi Agar (Agar Dilution) ... 31
2.5.2 Metode Dilusi Cair (Broth Dilution) ... 31
2.5.3 Metode Difusi Cakram (Disk Diffusion) ... 32
BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN ... 33
3.1 Kerangka Konseptual Penelitian ... 33
3.2 Hipotesis ... 37
4.7 Prosedur Pengambilan atau Pengumpulan Data ... 40
4.7.1 Pembuatan Inokulum Bakteri M. tuberculosis ... 40
xiii
4.8 Cara Pengolahan dan Analisis Data ... 45
BAB 5 HASIL PENELITIAN ... 47
5.1 Penentuan MIC OAT Lini Pertama dan EGCG ... 47
5.2 Penentuan MIC Kombinasi OAT Lini Pertama dan EGCG ... 50
5.3 Perbandingan MIC OAT Lini Pertama Sebelum dan Setelah Kombinasi dengan EGCG ... 53
BAB 6 PEMBAHASAN ... 58
BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN ... 65
7.1 Kesimpulan ... 65
7.2 Saran ... 65
DAFTAR PUSTAKA ... 66
LAMPIRAN 1 ... 69
LAMPIRAN 2 ... 72
LAMPIRAN 3 ... 76
LAMPIRAN 4 ... 80
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1 Komposisi Senyawa Polifenol pada Daun Teh ... 28 Tabel 5.1 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC RIF (n=2) ... 48 Tabel 5.2 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC INH (n=2) ... 48 Tabel 5.3 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC PZA (n=2) .... 49 Tabel 5.4 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC EMB (n=2) ... 49 Tabel 5.5 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC EGCG (n=2) . 50 Tabel 5.6 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC Kombinasi RIF dan EGCG 150 ppm (n=2) ... 51 Tabel 5.7 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC Kombinasi INH dan EGCG 150 ppm (n=2) ... 52 Tabel 5.8 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC Kombinasi PZA dan EGCG 150 ppm (n=2) ... 52 Tabel 5.9 Rerata Angka Pertumbuhan dan Persentase Hambatan
Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC Kombinasi EMB dan EGCG 150 ppm (n=2) ... 53 Tabel 5.10 Hasil MIC OAT Lini Pertama Sebelum dan Setelah Kombinasi
dengan EGCG 150 ppm ... 56 Tabel 6.1 Perbedaan MIC OAT pada Penelitian ini dibandingkan dengan
xv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 2.1 M. tuberculosis dengan Pewarnaan Ziehl-Neelsen ... 18
Gambar 2.2 M. tuberculosis pada Medium Lowenstein-Jensen ... 20
Gambar 2.3 Struktur RIF ... 21
Gambar 2.4 Struktur INH ... 23
Gambar 2.5 Struktur PZA ... 24
Gambar 2.6 Struktur EMB HCl ... 26
Gambar 2.7 Struktur EGCG ... 29
Gambar 3.1 Bagan Kerangka Konseptual Penelitian ... 36
Gambar 4.1 Bagan Kerangka Operasional Penelitian ... 46
Gambar 5.1 Grafik Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC RIF sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm ... 54
Gambar 5.2 Grafik Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC INH sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm ... 54
Gambar 5.3 Grafik Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC PZA sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm ... 55
Gambar 5.4 Grafik Persentase Hambatan Pertumbuhan M. tuberculosis pada Penentuan MIC EMB sebelum dan setelah kombinasi dengan EGCG 150 ppm ... 55
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
LAMPIRAN 1 Tabel Pengukuran Kekeruhan (Turbidity) ... 69
LAMPIRAN 2 Tabel Angka Pertumbuhan ... 72
LAMPIRAN 3 Spesifikasi Standar OAT ... 76
LAMPIRAN 4 Spesifikasi EGCG ... 80
xvii
DAFTAR SINGKATAN
BSC : Bio Safety Cabinet BTA : Bakteri tahan asam DMF : Dimethyl Formamide DMSO : Dimethyl Sulfoxide
DR-TB : Drug-resistance Tuberculosis EC : epicatechin
ECG : epicatechin-gallate EGC : epigallocatechin
EGCG : (-)-epigallocatechin-gallate EMB : Ethambutol
FKUI : Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia GC : gallocatechin
HIV : Human Immunodeficiency Virus INH : Isoniazid
M. tuberculosis : Mycobacterium tuberculosis MDR-TB : Multidrug-resistance Tuberculosis MIC : Minimum Inhibitory Concentration OADC : Oleic acid-albumin-dextrose-catalase OAT : Obat Antituberkulosis
p.a. : Pro analisis
PAS : para-aminosalicylic acid PCR : Polymerase Chain Reaction PZA : Pyrazinamide
RIF : Rifampicin
TACO : Tryptophan-Aspartate containing Coat Protein TB : Tuberkulosis
WHO : World Health Organization WS : Working Standard
