BAB III
BAHAN DAN CARA KERJA
A. LOKASI DAN WAKTU PENELITIAN
Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Genetika, Departemen Biologi, FMIPA-UI, Depok. Lama penelitian dari awal pengambilan data hingga pembuatan skripsi sekitar dua belas bulan
(September 2006--September 2007). Skema kerja penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1.
B. BAHAN
1. Mikroorganisme
Mikroorganisme yang digunakan adalah 12 isolat khamir koleksi
University of Indonesia Culture Collection (UICC), Departemen Biologi FMIPA
UI. Empat isolat berasal dari perairan mangrove Cagar Alam Pulau Rambut, yaitu: W1114, W1126, W127, dan W144, sedangkan delapan isolat lainnya berasal dari perairan laut di sekitar Cagar Alam Pulau Rambut, yaitu: W314 (white), W322, W324, W325, W3324, W3329, W3338 (yellow) dan W3351.
2. Medium
Medium yang digunakan untuk pembuatan working culture adalah Yeast Malt Agar (YMA). Medium yang digunakan untuk pemeliharaan stock
culture adalah Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung NaCl 1,5%.
Medium padat yang digunakan untuk pengamatan fenotipik adalah Malt Extract Agar (MEA) 5% dan Yeast Malt Agar (YMA), sedangkan medium cair yang digunakan adalah Yeast Malt Broth (YMB) dan Malt Extract Broth (MEB) 5%. Pengamatan miselium dengan metode slide culture menggunakan medium Corn Meal Agar (CMA).
3. Bahan kimia
Bahan kimia produk dari Difco adalah yeast extract, malt extract, pepton, PDA, CMA dan Bacto agar. Bahan kimia produk dari Merck adalah
D-glukosa, etanol, dan isopropanol. Bahan kimia produk dari Promega
adalah agarosa, DNA ladder, etidium bromida, loading dye (6 X Load Dye Blue/Orange), Go Taq Green Master Mix [Promega], pure taq ready-to-go PCR beads [GE Healthcare], mineral oil , nuclease free water, (Tris-asetat dan EDTA) TAE buffer 10 X, dan kit isolasi DNA (Wizard Genomic DNA Purification Kit). Bahan kimia produk dari Sigma adalah proteinase, primer ITS 5 (10 pmol/µl), primer ITS 4 (10 pmol/µl). Bahan kimia lainnya yang digunakan adalah akuades, akuabides [IKA], alkohol teknis, zymolyase 20 T [Seigaku America], spiritus teknis, tetrasiklin 500 mg/l [Phapros], dan minyak imersi [Euromax Holland].
C. PERALATAN
Mikro pipet P10 dan P1000 [GILSON], mikro pipet P100 dan P200 [Eppendorf Research], alat sentrifugasi [Eppendorf 5415 C], cycle sequencer [TaKaRa™ Gradient PCR], gel documentation system [BIO-RAD], PCR
thermal cycler [PERKIN ELMER 9600], inkubator [Heraeus], kamera digital
Sony DSC-W30, lemari es [Bauknecht], autoklaf [Hirayama HL-36 AE],
microwave [Hitachi], mikroskop [Euromex HOLLAND], mesin sequencer
[Applied Biosystem 3130XL], mesin sequencer [Applied Biosystem 3100], spektrofotometer [OPTIMA SP-3000 Plus], alat elektroforesis [Advance], timbangan digital [AND EW-300 G], sonikator [Sakura US-10 E], vortex [Scientific Industries], jarum tanam bulat (ose) dan pembakar spiritus. Peralatan habis pakai yang digunakan adalah tabung PCR [Axygen], tabung Eppendorf 1,5 ml [Eppendorf], pipet tips 200--1.000 µl [BIO-RAD], lembar parafilm, wrapping plastic [Klin Pak],dan sarung tangan [Sensi gloves]. Alat lainnya adalah alat-alat gelas yang umumnya digunakan di laboratorium mikrobiologi.
C. CARA KERJA
1. Pembuatan medium dan larutan
a. Malt Extract Agar (MEA) 5%
Medium Malt Extract Agar (MEA) 5% dibuat berdasarkan Yarrow (1998: 87). Sebanyak 20 g agar dan 50 g malt extract dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades hingga 1.000 ml. Larutan
dipanaskan dengan penangas air hingga mendidih dan semua bahan larut sempurna. Medium disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 115° C dan tekanan 2 atm selama 15 menit. Medium yang sudah disterilkan ditambahi dengan antibiotik tetrasiklin pada saat suhu medium ± 45° C kemudian dituang ke cawan Petri masing-masing sebanyak 15--20 ml.
b. Malt Extract Broth (MEB) 5%
Medium Malt Extract Broth (MEB) 5% dibuat berdasarkan Yarrow (1998: 87). Sebanyak 50 g malt extract dimasukkan ke dalam labu
Erlenmeyer kemudian ditambahi akuades hingga volume 1.000 ml. Larutan dipanaskan dengan penangas air hingga mendidih dan semua bahan larut sempurna. Medium yang sudah homogen kemudian dimasukkan ke
sejumlah tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Medium disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 115° C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.
c. Corn Meal Agar (CMA)
Pembuatan medium CMA sesuai petunjuk pada kemasan. Sebanyak 12,5 g bubuk CMA dan 3,8 g agar ditambahi akuades hingga volume
mencapai 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga mendidih dan larut sempurna. Medium dimasukkan ke sejumlah tabung reaksi masing-masing sebanyak 3 ml. Medium kemudian disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.
d. Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung NaCl 1,5%
Pembuatan medium PDA sesuai petunjuk pada kemasan. Sebanyak 39 g bubuk Potato Dextrose Agar (PDA) dan 15 g NaCl ditambahi akuades hingga mencapai volume 1.000 ml kemudian dipanaskan hingga mendidih dan larut sempurna. Medium dimasukkan ke sejumlah tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Medium disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121°C dan tekanan 2 atm selama 20 menit. Medium yang sudah disterilkan kemudian diletakkan pada bidang miring ± 45° untuk pembuatan medium miring.
e. Yeast Malt Agar (YMA)
Medium Yeast Malt Agar (YMA) dibuat berdasarkan Yarrow (1998: 79). Sebanyak 3 g yeast extract, 3 g malt extract, 5 g pepton, 10 g glukosa, dan 20 g agar dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades hingga volume 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga mendidih dan larut sempurna. Medium disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15 meni t. Medium yang telah disterilkan ditambahi dengan antibiotik tetrasiklin pada saat suhu medium ± 45° C kemudian dituang ke cawan Petri masing-masin g sebanyak 15--20 ml.
f. Yeast Malt Broth (YMB)
Pembuatan medium Yeast Malt Broth (YMB) berdasarkan Yarrow (1998: 79). Sebanyak 3 g yeast extract, 3 g malt extract, 5 g pepton, 10 g glukosa dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dan ditambahi akuades hingga volume 1.000 ml. Campuran tersebut kemudian dipanaskan hingga mendidih dan larut sempurna. Medium kemudian dimasukkan ke sejumlah tabung reaksi masing-masing sebanyak 5 ml. Medium kemudian disterilkan menggunakan autoklaf dengan suhu 121° C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.
2. Pemurnian isolat khamir, pembuatan stock culture dan working
culture
Pemurnian khamir dilakukan dengan metode gores berdasarkan
Yarrow (1998: 78). Medium yang digunakan adalah YMA dalam cawan petri. Biakan khamir diambil menggunakan jarum tanam bulat (ose) kemudian digoreskan di atas medium hingga membentuk empat kuadran garis. Sebelum menggores satu kuadran, jarum ose dibakar terlebih dahulu dan didinginkan sebelum menyentuh biakan. Biakan kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Satu koloni tunggal yang tumbuh terpisah kemudian digoreskan ke dalam dua tabung PDA yang mengandung 1,5% NaCl dan disimpan pada suhu 4° C sebagai stock culture. Working culture dibuat dengan cara subkultur pada médium PDA dari tabung stock culture.
3. Isolasi DNA
Isolasi DNA khamir dilakukan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Lampiran 2).
4. Pembuatan gel agarosa 2%
Pembuatan gel agarosa 2% untuk deteksi fragmen DNA sebesar 200 pb--1 kb berdasarkan Sambrook & Russell (2001: 5.14). Sebanyak 2 g bubuk agarosa ditambahi dengan akuades hingga volume 100 ml kemudian dipanaskan hingga homogen. Larutan tersebut dituang ke dalam cetakan
(tray) yang sudah dipasangi sisir (comb) kemudian dibiarkan hingga mengeras. Gel agarosa disimpan dalam larutan buffer TAE 1 X sebelum digunakan untuk proses elektroforesis.
5. Pengukuran kualitas dan kuantitas DNA dengan spektrofotometer
Spektrofotometer dikalibrasi menggunakan 100 µl akuabides sebagai larutan blanko. Sampel DNA sebanyak 10 µl diencerkan dalam 90 µl akuabides kemudian dimasukkan ke dalam kuvet. Pengukuran dilakukan terhadap absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 nm dan absorbansi protein pada panjang gelombang 280 nm. Kualitas atau tingkat kemurnian DNA yang baik adalah 1,8--2,0 (1,8 ≤ A260/A280≤ 2,0). Konsentrasi DNA
kemudian dihitung menggunakan rumus berdasarkan Seidman & Moore (2000: 419), yaitu:
6. Amplifikasi daerah ITS dengan metode PCR
Proses PCR menggunakan Go Taq Green Master Mix [Promega] dan pure taq ready-to-go PCR beads [GE Healthcare]. Setiap reaksi PCR menggunakan Go Taq Green Master Mix [Promega] dengan volume total reaksi 25 µl mengandung green go taq reaction buffer (pH 8,5), DNA polimerase, 3 mM MgCl2, 400 µM dATP, dGTP, dTTP, dCTP, serta dye
kuning dan biru. Reaksi PCR berdasarkan Flanagan dkk. (2005: 13--16). Konsentrasi DNA (µg/µl) = OD260 x 50 µg/µl x faktor pengenceran
Volume total reaksi 25 µl terdiri atas 0,5 µl primer ITS 5 (5’-GGAAGTAAA AGTCGTAAC AAGG-3’), 0,5 µl primer ITS 4 (5’-TCCTCCGCCTTATT GATATGC-3’), 6 µl sampel DNA cetakan, 5,5 µl nuclease free water dan 12,5 µl Go Taq Green Master Mix [Promega]. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung PCR 0,2 ml kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 1 menit.
Setiap reaksi PCR menggunakan pure taq ready-to-go PCR beads [GE Healthcare] dengan volume total 25 µl mengandung 2,5 unit pure taq DNA polimerase, 10 mM Tris-HCL, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dATP,
dGTP, dTTP, dCTP, dan buffer. Reaksi PCR berdasarkan GE Healthcare [2005: 2]. Volume total 25 µl terdiri atas: 18 µl nuclease free water dan PCR
bead. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam tabung PCR 0,2 ml
kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 10 menit hingga PCR bead terlarut sempurna.
Amplifikasi menggunakan PCR thermal cycler [PERKIN ELMER 9600]. Kondisi PCR diawali dengan denaturasi awal pada suhu 94° C selama 2
menit, kemudian dilanjutkan sebanyak 40 siklus yang masing-masing terdiri atas tiga tahap yaitu: denaturasi pada suhu 94° C s elama 15 detik, pelekatan (annealing) pada suhu 56° C selama 30 detik dan polimerisasi pada suhu 68° C selama 1 menit. Setelah 40 siklus tersebut, dilanjutkan dengan polimerisasi akhir pada suhu 68° C selama 10 menit 40 detik. Produk PCR kemudian dapat disimpan pada suhu 4° C.
7. Elektroforesis hasil amplifikasi daerah ITS
Hasil amplifikasi daerah ITS divisualisasikan dengan teknik
elektroforesis menggunakan gel agarosa 2%. Persiapan loading dilakukan sebagai berikut. Sebanyak 1 µl loading dye dicampurkan dengan 5 µl sampel DNA, kemudian campuran tersebut dihomogenkan dengan cara dihisap dan dikeluarkan berulang kali menggunakan mikropipet. Campuran tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sumur (well) yang terdapat dalam gel. Penentuan panjang fragmen daerah ITS dilakukan menggunakan DNA
marker ukuran 1 Kb (DNA ladder) sebanyak 1 µl yang dicampurkan dengan 1
µl loading dye yang dimasukkan pada sumur pertama.
Proses elektroforesis dilakukan menggunakan alat elektroforesis [Advance] dengan buffer TAE 1X dan tegangan listrik 100 V. Proses elektroforesis berlangsung selama 30 menit. Selanjutnya gel direndam dalam larutan EtBr selama 20 menit kemudian dibilas menggunakan air. Gel diamati menggunakan Gel Documentation System [BIO-RAD] yang
tersambung dengan komputer untuk melihat perpendaran pita-pita (band) DNA hasil produk PCR, kemudian didokumentasikan menggunakan program Gel Doc XR.
8. Cycle sequencing, purifikasi produk Cycle sequencing dan sequencing
Cycle sequencing dan sequencing dilakukan di Lembaga Biologi
Molekular Eijkman, Jakarta dan Laboratorium Bioteknologi BPPT Serpong. Reaksi cycle sequencing dilakukan di Lembaga Biologi Molekular Eijkman, Jakarta. Total volume sebanyak 15 µl terdiri atasi: 6 µl big dye
terminator ready reaction mix, 1 µl primer ITS5 (5 pmol/µl), 1 µl produk PCR,
dan 7 µl distilled water. Cycle sequencing dilakukan dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi awal pada suhu 96°C selama 2 menit. Reaksi kemudian dilanjutkan sebanyak 25 siklus dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi pada suhu 96°C selama 10 detik, annealing pada suhu 50° C selama 5 detik, dan polimerisasi pada suhu 60° C selama 4 menit.
Reaksi cycle sequencing dilakukan di laboratorium bioteknologi BPPT, Serpong. Total volume sebanyak 10 µl terdiri atas: 1 µl big dye terminator, 1 µl primer ITS5 (5 pmol/µl), 1 µl produk PCR, buffer 2 µl dan 5 µl distilled
water. Cycle Sequencing dilakukan dengan kondisi sebagai berikut:
denaturasi awal pada suhu 96° C selama 1 menit, kem udian dilanjutkan sebanyak 25 siklus dengan kondisi sebagai berikut: denaturasi pada suhu 96° C selama 10 detik, annealing pada suhu 50° C selama 5 detik, dan polimerisasi pada suhu 60° C selama 1 menit 30 deti k.
Produk cycle sequencing, yang berasal dari Lembaga Biologi Molekular Eijkman maupun di Laboratorium Bioteknologi BPPT Serpong, kemudian dipurifikasi dengan metode presipitasi etanol untuk menghilangkan
sisa reagen yang dapat mengganggu pembacaan urutan nukleotida pada proses selanjutnya. Proses purifikasi adalah sebagai berikut: produk PCR ditambahi 10 µl ddH2O hingga volume mencapai 20 µl, kemudian ditambahi 2 µl 1,25 M EDTA, 2 µl 3 M NaOAc dan 50 µl EtOH absolut. Tabung ditutup dengan lembar aluminium dan dihomogenkan dengan cara tabung dibolak-balik lalu didiamkan pada suhu kamar selama 15 menit. Campuran
kemudian disentrifugasi 3.000 rpm selama 10 menit pada suhu 20° C. Supernatan dibuang, kemudian pelet dikeringkan dengan cara divakum selama 20 menit. Selanjutnya campuran ditambahi ddH2O sebanyak 12 µl
dan dipanaskan pada suhu 42° C selama 10 menit. Pr oduk siap digunakan untuk proses sequencing. Proses sequencing di Lembaga Biologi Molekular Eijkman, Jakarta menggunakan mesin sequencer [Applied Biosystem
3130XL] sedangkan sequencing di laboratorium bioteknologi BPPT, Serpong menggunakan mesin sequencer [Applied Biosystem 3100].
9. Deskripsi morfologi khamir
a. Pembuatan Slide culture
Pembuatan slide culture untuk pengamatan adanya miselium sejati maupun miselium palsu dilakukan berdasarkan Yarrow (1998: 83). Miselium sejati adalah struktur menyerupai tabung atau jalinan benang panjang dan terbentuk dari spora sedangkan miselium palsu terbentuk dari sel anak yang tidak terlepas dari sel induk pada saat pertunasan sel vegetatif (Yarrow 1998: 83). Gelas obyek steril diletakkan di dalam cawan petri. Medium CMA
kemudian dituangkan ke atas gelas obyek tersebut sehingga menghasilkan lapisan tipis medium. Biakan khamir digoreskan menggunakan jarum ose di sepanjang gelas obyek setelah medium mengering, kemudian ditutup dengan kaca obyek steril. Dua buah kertas saring steril yang sudah dicelupkan ke dalam akuades steril kemudian diletakkan di kedua sisi gelas obyek tersebut. Biakan diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang dan kertas saring sesekali diganti untuk menjaga kelembapan. Preparat yang berusia 7 hari kemudian dikeluarkan dari cawan petri dan digunakan untuk pengamatan mikroskopik. Pengamatan mikroskopik dilakukan menggunakan mikroskop dengan
perbesaran 10 X 100 dengan bantuan minyak imersi untuk mengamati ada atau tidaknya pembentukan miselium sepanjang garis inokulasi, di bawah maupun di sekitar kaca obyek.
b. Pengamatan makroskopik koloni pada medium padat
Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium padat dilakukan menggunakan medium YMA dan MEA 5%. Sel khamir
diinokulasikan dengan metode empat kuadran gores ke dalam medium kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam kemudian diinkubasi hingga satu bulan. Pengamatan makroskopik dilakukan pada koloni sel yang berusia 48 jam dan satu bulan berdasarkan Yarrow (1998: 81--82).
Karakteristik morfologi makroskopik koloni khamir yang diamati pada medium padat antara lain: tekstur, warna, penampakan permukaan, profil, dan tepi koloni.
c. Pengamatan makroskopik koloni pada medium cair
Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium cair dilakukan menggunakan medium YMB dan MEB 5%. Sebanyak satu ose biakan khamir diinokulasikan ke dalam medium cair kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam kemudian diinkubasi hingga satu bulan. Pengamatan makroskopik khamir dilakukan pada sel yang memiliki usia 48 jam dan satu bulan berdasarkan Kirsop dkk. (1984: 97). Karakter
makroskopik yang diamati pada medium cair adalah keberadaan cincin, pelikel pada permukaan medium serta endapan pada dasar medium.
d. Pengamatan mikroskopik pada medium cair
Pembuatan kultur untuk pengamatan makroskopik pada medium cair dilakukan menggunakan medium YMB dan MEB 5%. Sebanyak satu ose biakan khamir diinokulasikan ke dalam medium cair kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 48 jam. Pengamatan mikroskopik khamir dilakukan berdasarkan Yarrow (1998: 81). Sebanyak satu ose biakan khamir diambil dan diletakkan di atas gelas obyek kemudian ditutup dengan kaca obyek. Preparat diamati menggunakan mikroskop dengan perbesaran 10 X 100 dengan bantuan minyak imersi. Karakteristik yang diamati antara lain bentuk sel, keberadaan miselium palsu maupun miselium sejati dan tipe pertunasan. Pengukuran panjang dan lebar sel juga dilakukan terhadap 20 sel khamir menggunakan lensa mikrometer okuler.
10. Penyusunan dan analisis data
Penelitian bersifat non eksperimental. Data hasil pengukuran kuantitas DNA mengggunakan spektrofotometer disajikan dalam bentuk tabel (Tabel 1). Data yang diperoleh setelah sequencing berupa elektroferogram (Lampiran 3--14) dan text file data sequence. Data sequence yang diperoleh kemudian dapat dilakukan editing secara manual dengan program bioedit berdasarkan hasil elektroferogram. Data sequence dalam format FASTA kemudian dikirimkan ke situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mencari homologi terhadap database sequence daerah ITS khamir yang telah
diketahui, menggunakan program BLASTN. Identifikasi dilakukan berdasarkan persentase homologi (% identities) yang tertinggi antara
sequence isolat yang dikirim dengan sequence spesies khamir yang terdekat
pada database GenBank.
Nilai % identities yang tinggi harus didukung oleh E value yang
rendah, serta nilai bit score dan total query coverage yang tinggi untuk dapat menarik kesimpulan mengenai identitas query (BLAST Tutorial 2004: 1). Hasil pencarian homologi sequence menggunakan program BLAST disajikan dalam bentuk gambar (Gambar 5--16). Data pengamatan morfologi
makroskopik dan mikroskopik disajikan dalam bentuk tabel (Tabel 4--8) untuk membantu menarik kesimpulan mengenai identitas isolat. Data pengamatan morfologi juga digunakan sebagai tambahan informasi mengenai karakter fenotip dari isolat-isolat tersebut. Data hasil identifikasi disajikan dalam bentuk gambar dan tabel (Gambar 17--20 dan Tabel 2--3).
