Bab III Metodologi Penelitian
III.1 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas ukur, gelas kimia, labu erlenmeyer, tabung reaksi bertutup, spatula, batang pengaduk, tabung mikro, pipet mikro 10 µL, 100 µL, 1000 µL, hair dryer, chamber TLC, plat TLC, autoclave (Electric Pressures Stem Sterilizer Model No. 25X), laminar flow (Oliphant Ltd., Australia), oven (Arthur H. Thomas Co. Scientific Apparatus, USA; Heraeus; dan Fischer Isotemp Incubator Model 503), inkubator (Griffin Cooled Incubator), shaking incubator (Environ Shaker Lab Line Instruments, Inc.), heat block (Thermolyne Model DB 104320-33, USA), neraca analitik (Mettler Toledo AG 204, USA), pH meter (Orion 710 A), magnetic stirrer (Fisher Scientific), vortex (Thermolyne type 36700 Mixer), mikrosentrifuga (Biofuge Fresco Heraeus Instruments dan Mikro 22 R Hettich Zentrifugen D-78532 Germany), sentrifuga (Beckman J2-HS), freezer -20oC (Sharp non-CFC), freezer -70oC (Heraeus Instruments Model HFC 386STD-V14), spektrofotometer UV-VIS (BioRad, SmartspecTM 3000), spektrofotometer (Spectronic-20), peralatan elektroforesis BioRad, belly dancer (Stovall Life Sciences Inc., USA).
III.2 Bahan
Bahan-bahan yang digunakan di dalam penelitian ini adalah ekstrak ragi, pepton, bacto agar, pati terlarut, pati mentah jagung (merk Maizena), air laut, aqua milipore, buffer Na-fosfat pH 7, KI/I2, DNS, K-Na tartrat, NaOH, glukosa, reagen Bradford (BioRad), BSA, NaCl, etanol, metanol, N-butanol, H2SO4, HCl, KCl, glisin, asam asetat, Na-asetat, NaOH, Na2HPO4, NaH2PO4, bis-akrilamid 40%, Tris-Cl pH 8,8, Tris-Cl pH 6,8, AMPS 10%, TEMED, basa tris, glisin, bromophenol blue, gliserol, asam asetat glasial, merkaptoetanol, SDS, reagen oxidizer (BioRad), reagen silver (BioRad), developer dan broad range protein molecular weight marker (Promega).
Pada penelitian ini digunakan bakteri laut Vibrio sp. SFNB 3 yang diperoleh dari Dr. Ocky Karnaradjasa Universitas Diponegoro, Semarang.
III.3 Metodologi Penelitian III.3.1 Pembuatan Marine Broth
Marine Broth (MB) agar dibuat dengan mencampurkan 0,25% (w/v) pepton, 0,05% (w/v) ekstrak ragi, 1,5% (w/v) bakto agar, 0,1% (w/v) pati dan air laut. Campuran disterilisasi pada 121oC selama 15 menit. Media yang telah steril dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptik di ruang laminar. Setelah padat, media siap digunakan atau disimpan pada suhu 4oC. MB agar yang digunakan untuk uji kualitatif aktivitas α-amilase dibuat dengan menambahkan 1% (w/v) pati. MB cair dibuat dengan komposisi 0,25% (w/v) pepton, 0,05% (w/v) ekstrak ragi, 0,1% (w/v) pati dan air laut.
III.3.2 Peremajaan Kultur Vibrio sp. SFNB 3
Kultur Vibrio sp. SFNB 3 yang disimpan di dalam stok gliserol pada suhu -70oC diremajakan dengan menotolkan ose pada stok gliserol dan menggoreskannya pada MB agar secara aseptik. MB agar kemudian diinkubasi pada suhu 30oC selama 2 hari. Kultur yang sudah tumbuh disimpan pada suhu 4oC. Peremajaan berkala dilakukan dengan menggoreskan ose pada kultur dan dipindahkan ke MB agar baru secara aseptik.
III.3.3 Kurva Pertumbuhan dan Produksi α-Amilase
Inokulum dibuat dari kultur yang telah diremajakan, diambil satu ose, dipindahkan ke dalam MB cair secara aseptik dan diinkubasi pada 30oC, 150 rpm di dalam shaking incubator selama 16 jam. Sebanyak 1% (v/v) inokulum dipindahkan secara aseptik ke dalam labu erlenmeyer yang berisi MB cair, diinkubasi pada 30oC, 150 rpm di dalam shaking incubator. Sebanyak 3 mL
sampel diambil secara aseptik pada jam ke-0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, dan 24 untuk diukur OD selnya pada λ 600 nm. Sampel kemudian disentrifuga 12.500 rpm (Biofuge Fresco Heraeus Instruments) selama 5 menit pada suhu 4oC dan supernatan diambil untuk uji aktivitas α-amilase. Produksi α-amilase dilakukan dengan cara seperti di atas tanpa pengambilan sampel dan dihentikan pada jam saat aktivitas α-amilasenya paling tinggi. Hasil produksi disentrifuga 8670 x g selama 10 menit pada 4oC. Supernatan (ekstrak kasar) digunakan untuk isolasi α-amilase.
III.3.4 Isolasi α-Amilase
Ekstrak kasar dicampurkan ke dalam suspensi pati mentah jagung 5% (w/v) yang telah dicuci dengan 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 dan diinkubasi sambil diaduk pelan pada suhu 10oC selama 1 jam. Setelah itu, campuran disentrifuga 11.300 x g selama 10 menit pada suhu 4oC. Supernatan disimpan untuk analisa, pelet dicuci dengan 0,5 M NaCl selama 5 menit pada suhu 4oC dan disentrifuga pada kondisi yang sama. Supernatan disimpan untuk analisa, pelet dicuci dengan aqua milipore hingga A280 ≈ 0, dilarutkan kembali dalam 25 mM buffer Na-fosfat pH 7, diinkubasi pada suhu 50oC, 75 rpm selama 30 menit dan disentrifuga pada kondisi yang sama. Pelet dibuang dan supernatan digunakan untuk analisis lebih lanjut.
III.3.5 Uji Kualitatif Aktivitas α-Amilase
Kultur yang sudah diremajakan digores menggunakan ose, dipindahkan ke dalam MB agar yang mengandung 1% (w/v) pati secara aseptik dan disimpan pada 30oC selama 2 hari. Setelah itu, ke dalam media dituangkan KI/I2 untuk pewarnaan. Munculnya daerah halo menandakan adanya aktivitas α-amilase.
III.3.6 Uji Kuantitatif Aktivitas α-Amilase
Uji kuantitatif aktivitas α-amilase dilakukan dengan metode DNS. Ke dalam sampel, standar, dan kontrol (100 µL) ditambahkan 1 mL reagen DNS. Campuran dihomogenisasi dengan vortex dan diinkubasi pada 100oC selama 10 menit. Setelah itu sampel didinginkan pada suhu ruang selama 20 menit dan ditentukan absorbansinya pada λ 500 nm. Sampel disiapkan dengan mereaksikan 50 µL enzim dengan 50 µL substrat pati 0,75% (w/v) dalam 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 pada 50oC selama 10 menit. Glukosa digunakan sebagai standar, enzim yang telah diinaktivasi (100oC selama 10 menit) digunakan sebagai kontrol, dan 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 digunakan sebagai blanko. Aktivitas ditentukan berdasarkan jumlah gula pereduksi yang dilepaskan dari reaksi. Satu unit aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1 µmol gula pereduksi per menit dibawah kondisi pengujian.
III.3.7 Penentuan Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan metode Bradford. Ke dalam 800 μL enzim ditambahkan 200 μL konsentrat reagen dye (BioRad). Campuran diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit dan diukur absorbansinya pada λ 595 nm. BSA digunakan sebagai standar.
III.3.8 Penentuan Suhu Optimum α-Amilase Hasil Isolasi
Suhu optimum ditentukan dengan mereaksikan 50 µL enzim dan 50 µL substrat pati 0,75% (w/v) dalam 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 selama 10 menit pada suhu 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 dan 100oC. Reaksi dihentikan dengan penambahan 1 mL reagen DNS. Setelah itu campuran reaksi dihomogenisasi dengan vortex, diinkubasi pada 100oC selama 10 menit, didinginkan pada suhu ruang selama 20 menit dan diukur absorbansinya pada λ 500 nm. Enzim yang telah diinaktivasi pada 100oC selama 10 menit digunakan sebagai kontrol. Untuk blanko digunakan 25 mM buffer Na-fosfat pH 7.
III.3.9 Uji Stabilitas α-Amilase Hasil Isolasi pada Suhu Optimum
Stabilitas α-amilase pada suhu optimum diuji dengan menginkubasi enzim pada 50oC selama 15, 30, 60, 120 dan 240 menit kemudian mengukur aktivitasnya dengan metode DNS.
III.3.10 Penentuan pH Optimum α-Amilase Hasil Isolasi
Penentuan pH optimum dilakukan dengan mereaksikan 50 µL enzim (dalam 2,5 mM buffer Na-fosfat pH 7) dan 50 µL substrat pati 0,75% (w/v) dalam 25 mM buffer HCl-KCl pH 2, glisin-HCl pH 3, Na-asetat pH 4, Na-asetat pH 5, Na-fosfat pH 6, Na-fosfat pH 7, Tris-HCl pH 8, Tris-HCl pH 9 dan glisin-NaOH pH 10 pada 50oC selama 10 menit. Setelah itu ke dalam campuran reaksi ditambahkan 1 mL reagen DNS. Campuran dihomogenisasi dengan vortex, diinkubasi pada 100oC selama 10 menit, didinginkan pada suhu ruang dan diukur absorbansinya pada λ 500 nm. Sebagai kontrol digunakan enzim yang telah diinaktivasi pada 100oC selama 10 menit dan sebagai blanko digunakan 25mM buffer Na-fosfat.
III.3.11 Uji Hidrolisis Pati Mentah Jagung
Uji hidrolisis pati mentah jagung dilakukan dengan menambahkan 5% (w/v) pati mentah jagung yang telah dicuci dengan 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 ke dalam larutan enzim dan menginkubasinya pada 37oC, 150 rpm. Setelah 24, 48 dan 72 jam inkubasi, campuran disentrifuga 12.000 rpm (Mikro 22 R Hettich Zentrifugen D-78532 Germany) selama 5 menit pada suhu 4oC. Gula pereduksi supernatan jam ke-24, 48 dan 72 diukur jumlahnya dengan metode DNS. Enzim yang telah diinaktivasi 100oC selama 10 menit digunakan sebagai kontrol dan 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 digunakan sebagai blanko.
III.3.12 SEM (Scanning Electron Microscopy)
Pelet pati mentah jagung hasil hidrolisis (sub bab III.3.11) dicuci dengan etanol 70% (v/v), dikeringkan pada 37oC selama satu malam dan disimpan dalam desikator. Setelah itu, sampel ditempelkan pada specimen holder dengan perekat double sticky tape dan dibersihkan dengan hand blower untuk menghilangkan debu-debu pengotor. Kemudian, sampel diberi lapisan (coating) emas-paladium (Au: 80% dan Pd: 20%) dengan menggunakan mesin Ion Sputter JFC-1100. Coating ini bertujuan agar sampel memiliki daya hantar listrik yang sesuai dengan spesifikasi alat. Selanjutnya, sampel dimasukkan ke dalam specimen chamber pada mesin SEM JSM-35C untuk pemotretan. SEM dilakukan di Pusat Pengembangan Geologi Kelautan, Bandung.
III.3.13 Penentuan Mode Aksi α-Amilase Hasil Isolasi
Mode aksi α-amilase dalam mendegradasi pati ditentukan dengan TLC. Untuk mengetahui mode aksi pendegradasian pati terlarut, sebanyak 5% (w/v) pati terlarut ditambahkan ke dalam larutan enzim dan diinkubasi pada 50oC selama 30 menit, 1, 2, 4, 24 dan 48 jam. Reaksi hidrolisis pati terlarut dihentikan dengan menginaktivasi enzim pada 100oC selama 10 menit. Untuk mengetahui mode aksi pendegradasian pati mentah jagung digunakan supernatan hasil uji hidrolisis pati mentah jagung pada jam ke-24, 48 dan 72.
Sebanyak 3 µL sampel ditotolkan pada plat TLC dan dikeringkan dengan hair dryer. Sebagai standar digunakan 2 µL larutan glukosa hingga maltoheptaosa (G1–G7). Plat dimasukkan ke dalam chamber TLC yang telah dijenuhkan satu malam dengan 25 mL n-butanol, 25 mL etanol dan 15 mL aqua milipore. Setelah pelarut mencapai batas atas, plat dikeluarkan, disemprot dengan pemanyar (H2SO4:metanol, 1:1) dan diinkubasi dalam oven pada 110oC selama 5 menit.
III.3.14 Penentuan Km, Vmax dan kcat α-Amilase Hasil Isolasi
Studi kinetika α-amilase dilakukan dengan mereaksikan 50 µL enzim dan 50 µL pati 0,5% (w/v), 0,75% (w/v), 1% (w/v), 1,25% (w/v), 1,5% (w/v) dan 1,75% (w/v) dalam 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 pada 50oC selama 5 menit. Setelah itu, reaksi dihentikan dengan menambahkan 1 mL DNS, dihomogenisasi dengan vortex, diinkubasi pada 100oC selama 10 menit, didinginkan pada suhu ruang selama 20 menit dan diukur absorbansinya pada λ 500 nm. Nilai Km, Vmax dan kcat didapatkan dari plot laju pembentukan produk terhadap konsentrasi substrat pada kondisi reaksi diatas.
III.3.15 Native PAGE-Zymogram
Gel yang digunakan untuk native PAGE dibuat dengan komposisi 10% separating gel dan 5% stacking gel. Separating gel dibuat dengan mencampurkan 1,25 mL 40% bis-akrilamid, 2,448 mL aqua milipore, 1,25 mL 1,5 M buffer Tris-Cl pH 8,8, 50 µL 10% AMPS dan 2 μL TEMED. Larutan dituangkan ke dalam cetakan dan dibiarkan memadat. Stacking gel dibuat dengan mencampurkan 0,25 mL 40% bis-akrilamid, 1,486 mL aqua milipore, 0,25 mL 1 M buffer Tris-Cl pH 6,8, 20 µL AMPS 10% dan 2 μL TEMED. Stacking gel dituangkan di atas separating gel. Sumur sampel dibuat dengan memasukkan sisir pada bagian atas stacking gel sebelum memadat. Gel yang telah memadat dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis dan ditambahkan running buffer (250 mM glisin, 25 mM basa Tris).
Sampel protein dicampurkan dengan buffer sampel (50 mM buffer Tris-Cl pH 6,8, bromophenol blue 0,1% (w/v), dan gliserol 10% (w/v)) dan kemudian dimasukkan ke dalam sumur sampel. Elektroforesis dijalankan pada 120 V, 400 A, selama kurang lebih 75 menit. Setelah selesai, gel dipindahkan dari dalam tangki, direndam di dalam larutan pati (1% (w/v) pati dalam 25 mM buffer Na-fosfat pH 7) selama 30 menit pada suhu 50oC dan kemudian direndam di dalam larutan KI/I2 untuk pewarnaan. Setelah itu, gel direndam selama 30 menit di dalam larutan fixing (etanol 30% (v/v), asam asetat 10% (v/v), aqua milipore 60% (v/v)).
III.3.16 SDS PAGE-Silver Staining
Gel SDS dibuat dengan komposisi 10% separating gel dan 5% stacking gel. Separating dan stacking gel pada SDS PAGE dibuat dengan cara yang sama dengan gel native. Komposisi separating gel adalah 1,24 mL 40% bis-akrilamid, 2,41 mL aqua milipore, 1,25 mL 1,5 M buffer Tris-Cl pH 8,8, 50 µL SDS 10% (w/v), 50 µL 10% AMPS dan 2 μL TEMED. Untuk stacking gel, komposisinya adalah 0,25 mL 40% bis-akrilamid, 1,46 mL aqua milipore, 0,25 mL 1 M buffer Tris-Cl pH 6,8, 50 µL SDS 10% (w/v), 50 µL 10% AMPS dan 2 μL TEMED. Komposisi buffer sampel untuk SDS PAGE adalah 50 mM buffer Tris-Cl pH 6,8, bromophenol blue 0,1% (w/v), gliserol 10% (w/v), SDS 2% (w/v) dan 100 mM merkaptoetanol.
Sebelum dimasukkan ke dalam sumur, sampel diinkubasi pada 100oC selama 5 menit. Elektroforesis dijalankan pada kondisi yang sama dengan native PAGE. Setelah selesai, gel dipindahkan dari dalam tangki dan berturut-turut direndam larutan fixing (etanol 30% (v/v), asam asetat 10% (v/v), aqua milipore 60% (v/v)) selama 30 menit dan larutan oxidizer (reagen oxidizer BioRad Kit 10% (v/v), aqua milipore 90% (v/v)) selama 5 menit. Gel dicuci 6-7 kali dengan aqua milipore dan direndam selama 20 menit di dalam larutan silver (reagen silver BioRad Kit 10% (v/v), aqua milipore 90% (v/v)). Kemudian, gel dicuci cepat dengan aqua milipore selama 30 detik dan direndam di dalam larutan developer hingga terbentuk pita dengan intensitas yang diinginkan. Reaksi dihentikan dengan perendaman gel di dalam larutan asam asetat 5% (v/v).
III.3.17 Penentuan Massa Molekul α-Amilase Hasil Isolasi
Massa molekul α-amilase hasil isolasi ditentukan dengan SDS PAGE-silver staining. Sampel dilarutkan di dalam buffer sampel tanpa penambahan merkaptoetanol dan tanpa perlakuan inkubasi 100oC selama 5 menit. Setelah elektroforesis, gel dicuci dengan aqua milipore selama 15 menit, direndam di dalam 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 selama 30 menit, larutan pati 1% (w/v) dalam 25 mM buffer Na-fosfat pH 7 pada 50oC selama 30 menit dan larutan KI/I2 untuk pewarnaan. Gel diberi tanda di samping pita yang terbentuk dan kemudian diperlakukan dengan silver staining seperti diatas.
