B1J009058 11.

5

II. METODE PENELITIAN

A.

Rancangan Penelitian

Metode penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah eksperimen dengan menggunakan teknik RAPD. Sampel berupa daun tanaman kecipir yang telah diinduksi sinar gamma dengan panjang gelombang 20 Gy, 25 Gy dan tanaman kontrol yang tidak diinduksi sinar gamma. Masing-masing perlakuan menggunakan 5 sampel tanaman.

B.

Cara Kerja Penelitian

Tanaman kecipir yang digunakan merupakan koleksi Laoratorium Genetika Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Sampel tanaman kecipir terdiri atas tanaman kontrol dan tanaman yang ditumbuhkan dari biji yang telah diberi perlakuan iradiasi sinar gamma. Induksi mutasi biji kecipir dilakukan di BATAN, Jakarta.

1. Pengambilan sampel daun kecipir

Daun kecipir muda dan segar diambil dari tanaman kontrol, dan tanaman yang telah diinduksi sinar gamma 20 Gy dan 25 Gy, dimasukkan ke dalam amplop yang diberisilica gel.

2. Isolasi DNA genom kecipir

Isolasi DNA genom dilakukan menggunakan metode Doyle and Doyle (1990) yang telah dimodifikasi oleh Laboratorium Genetika dan Pemuliaan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Gajah Mada.

a) Sampel daun kecipir yang digunakan sebanyak 0,05 gr.

b) Buffer CTAB dipanaskan dalamwaterbathpada suhu 65o_{C selama 30 menit.}

c) Sampel daun yang ditambahkan larutan buffer CTAB digerus menggunakan mortar dan pestle hingga lembut, dan dicampur hingga rata, kemudian dimasukkan ke dalammicrotube.

d) Campuran hasil gerusan dan buffer tersebut diinkubasi pada suhu 65o_C

selama 60 menit dan setiap 10 menit sekali dibolak-balik.

e) Setelah itu, campuran didiamkan selama dua menit kemudian ditambahkan pada setiap sampel 500 µl campuran kloroform : isoamilpropanol (24:1), kemudian divortex selama 5 menit.

f) Campuran disentrifugasi selama 15 menit pada 12.000 rpm.

6

h) Sodium asetat 3 M ditambahkan sebanyak 1/10 volume supernatan, kemudian dihomogenkan.

i) Ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 2/3 volume total (supernatan dan sodium asetat), campuran didiamkan selama 24 jam.

j) Campuran kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada 12.000 rpm. k) Cairan pada microtube dibuang, endapan pelet dicuci dengan

menambahkan 500 µl etanol 70% sambil dibolak-balik.

l) Setelah itu disentrifugasi selama 5 menit pada 12.000 rpm. Supernatan dibuang dan pelet DNA diendapkan. Setelah itu pelet dikeringanginkan. m) Setelah kering, endapan dilarutkan dengan 50 µl aquabides.

3. Kuantifikasi DNA

Kuantifikasi adalah prosedur untuk mengetahui konsentrasi dan kualitas DNA yang telah diekstraksi. Alat yang digunakan untuk kuantifikasi adalah spektrofotometer Genequant 1300. Sebelum dilakukan pengukuran, kuvet dibersihkan terlebih dahulu menggunakan alkohol dan aquabides serta dilakukan kalibrasi. Untuk menghitung konsentrasi DNA, 2 µl sampel DNA ditambahkan 1.998 µl aquabides.

4. Amplifikasi fragmen DNA genom kecipir menggunakan teknik RAPD

Volume total untuk PCR adalah 10 µl, terdiri atas 5 µl Go Taq green master mixPCR 2x, 2,25 µlnuclease free water, 0,25 µl 50 µM primer dan 2,5 µl 5ng DNA. DNA diamplifikasi menggunakan PCR thermal cycler BOECO. Pre-heatinguntai ganda DNA template pada suhu 95o_{C selama 1 menit, denaturasi}

pada suhu 95o_{C selama 45 detik, tahap penempelan (annealing) primer pada}

suhu 37o_{C selama 1 menit, pemanjangan primer (extension) pada suhu 72}o_C

selama 1 menit 30 detik.Final extensionpada suhu 72o_{C selama 7 menit.Diakhiri}

dengan holding pada suhu 4o_{C selama 1 menit. Siklus diulang sebanyak 35 kali.}

Pada tahap skrining digunakan 38 primer, kemudian dipilih 10 primer yang menghasilkan marka yang jelas dan polimorfik. Sekuen kesepuluh primer tersebut dapat dilihat pada Tabel 2.1. Adapun data sekuen primer lainnya yang digunakan dalam tahap skrining tertera pada Lampiran 6.

Tabel 2.1. Sekuen primer hasil skrining

No. Primer Sekuen

1. OPA 9 5 - GGGTAACGCC -3

2. OPA 10 5 - GTGATCGCAG -3

3. OPA 13 5 - CAGCACCCAC -3

7

Produk PCR yang diperoleh dilihat menggunakan teknik elektroforesis yang di running menggunakan gel agarosa 1% dengan TBE 1x dan telah ditambahkanFlorosafe DNA staining. Elektroforesis dilakukan selama 60 menit dengan tegangan 80 V. Visualisasi dilakukan pada paparan sinar UV menggunakan UV transluminator. Setelah itu, hasil didokumentasikan dengan kamera digital.

6. Analisis polimorfisme DNA kecipir

Profil pola fragmen DNA masing-masing primer diskoring berdasarkan ada tidaknya fragmen menggunakan kode biner. Skor 1 jika ada fragmen dan skor 0 jika tidak ada fragmen tanpa memandang intensitasnya.

Spesifikasi alat dan bahan yang digunakan pada penelitian ini dapat dilihat di Lampiran 6.

Diagram alir penelitian dapat dilihat pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1. Diagram alir penelitian

Pengambilan sampel daun kecipir (kontrol, perlakuan 20 Gy dan perlakuan 25 Gy) masing-masing 5 sampel

Isolasi DNA genom kecipir menggunakan CTAB

Kuantifikasi DNA menggunakan spektrofotometer

PCR-RAPD

Elektroforesis

Didokumentasikan Analisis polimorfisme

8

C. Metode Analisis