Fakultas Kedokteran Universitas Jember Jl. Kalimantan 37 Jember

(1)

(2)

LAPO�

AKHIR PENELITIAN

Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan

Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal Stem Cells

(MSCs) melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi

pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia)

Nama

Penyusun Laporan:

Candra Bumi

Heni

Fatmawati

Nindya

Shinta

Fakultas Kedokteran Universitas Jember

Jl. Kalimantan 37 Jember

2012

(3)

•

la: .\lENT LR lA '\ l'.l·:S E H ATA "\'

B \1.> \ ·< l'l "-! j IT, \:-. ll \ '\. t '1"1..\tl \1(). \ Sc ·.'\:'-. Ki:'<iFI L<\1.-\!\-• • j [A," ._' If. ! �. r 1. , 1 ,_ 'I' _I.I I' '. � t-. • ' � 'f;. ' !• t •);. • � i • . '\ '.i.l \ ' 1n·--.r:· • t \�1��---. · . • �.� I' PI \• _I_''I, l � ·•.:.,. ),'.I:,! ... --.�. ,t, ,P,( tll,.�\J,�_::: , .. 11 t l,,!�I'IRioh

to(;�f';.JJTllo'��tl fi�Oi,;, .\-e.a.�'lh.!l<a l.,tV-�o.,.N:'� KIF'�F-.A-.:.., '� ·�o!i.tef.l .� ... _o'J •\�. • _:<-l.,.. �c:.�·-JUllll. ,� ISE l ·.•·.;-._ •.:·· , <!'" J< " : I " � ... _,._ '00 4 ' '..-('<Mo.� I-·.•·.� ol :· ••� o ,.,, l '· • ·.t��-.-.,,_�' . .1' ., •:••\:.ol' --��-· ...;. ... -.,-� .. --. �:. .. ; " ... �..;. ; � .''1 .• r. 16o ·, , -....,_ • ·-:r ;y�: :.._.. �-"\ �·-.��" • '!>.-. • .:-·e,�"'·.ii...,.- !>�_. ,,. __ .w.�- �! •. �.· ·:1'1"-1-- t_t'(·.':::oi:.-�, ... ..;(,., ··�-��-·-� "·-·� .• �- .... ._l�ll.',-,..� t1..,;l. I''•'' ;I(,; �o'/ (?'-'' \� �· :l· ·,. ,jO ,• 1

1.,1�::.:·�--.;:·�_ . ..:; .• ,.·vt- :.. ... -... floi., •-·r;\· ,.- . ·., ... �

� 't! • �"V'."'

. .. �·· . '

(4)

LEMBAR PENGESAHAN PENELITIAN RISBIN IPTEKDOK

1. Judul

: Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal _{Stem Cells}(MSCs) melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia).

2. Ketua Peneliti

2.1 Data Pribadi

a. Nama Lengkap

b. Jenis Kelamin

c. NIP/Golongan

d. Srata/Jab. Fungsional

e. Jabatan Struktural

f.

Fakultas/J

urusan

g. Bidang Ilmu

h.

Alamat Kantor

i. Telepon/Faks!E-mail

J.

Alamat Rumah

3. Jumlah Anggota Peneliti

a. Nama Anggota I

b. Nama Anggota ll

c. Nama Anggota III

: dr. Candra Bumi, MSi

: Pria

: 197406082008011012/IIlb

: Kesehatan Masyarakat

: Imunologi

dan

Epidemiologi

: Jl. Kalimantan 1193

:0331 7891500/candra_bumi@yahoo.com

: Perum. Taman Gading LL-20 Jember

: dr. Heni Fatmawati, Mkes

: dr. Nindya Shinta, MKed

4. Lokasi Penelitian

: Laboratorium liD Universitas Unair

5. Jangka Waktu Penelitian : 6 Bulan

Jember, 8 Februari 2012

Ketua Peneliti,

dr.

Candra

Bumi, MSi

NIP.197406082008011012

(5)

• I<EMENTERIAN PEN DIDIKAN NASIONAL

UNIVERSIT A S JEMBE R

FAI(ULTAS KEDOKTERAN

Jl. Kalimantan 37 Kampus Tegalboto Telp. (0331) 337877 Jember 68121 E-Mail: fk@unej.ac.id

Surat Pernyataan

Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama Lengkap

Nomor lnduk Pegawai Asal lnstansi

Judul Penelitian

: Candra Bumi

:197406082008011012

: Fakultas Kesehatan Masyarakat Universitas Jember : Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan

Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal Stem Cefls

(MSCs) pada lnfark Miokard melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia)

'

Dengan ini menyatakan kesanggupan untuk menyelesaikan penelitian Riset Pembinaan llmu Pengetahuan dan Teknologi Kedokteran yang telah dilakukan pada tahun 2011, sesuai dengan Surat Perjanjian Kerjasama yang ditandatangani pada tahun 2011 (penPiitian tahun ke-1)

Apabila dikemudian hari, Saya tidak dapat menyelesaikan penelitian seperti ketentuan tersebut di atas, maka segala akibat yang timbul dari penelitian tersebut menjadi tanggung jawab Saya sepenuhnya dan seluruh biaya penelitian yang telah diterima akan saya kembalikan kepada Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan.

Demikian Surat Pernyataan ini Saya buat tanpa ada paksaan dan untuk dapat dipergunakan sebagaimana semestinya.

I _I

ti, M.Kes

0

14199903.7()0

Jember, 16 Januari 2012 Yang membuat pernyataan,

'\

\

E

.

· rr

�\J

_(-

_'A

_.-

_'.

'

�

r L

'

'*r

tj(J

�

}

�

.

�>

.

\.

·;;;· '·

':.

�_(

----06DOEAAF9

�2

2

7 3&

?--f�.\ .

...

\ l'tiJ.!J Ktrn•�H '

((G(OfiD

dr. Candra Bumi, MSi NIP. 197406082008011012

(6)

KA TA PENGANTAR

Dengan memanjatkan segala puji syukur kepada Allah

SWT,

atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya tim peneliti dapat menyelesaikan penelitian dan laporan hasil penelitian tahap II yang be�udul : Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal _{Stem Cells} (MSCs) melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia).

Kami atas nama tim peneliti bemarap mudah - mudahan hasil penelitian berguna dan bermanfaat baik untuk pengembangan ilmu dan teknologi pada umumnya dan khususnya ilmu dan teknologi dalam bidang kedokteran.

Kami sadar bahwa penelitian kami masih terdapat kekurangan. Oleh karena itu peneliti mengharapkan melalui laporan penelitian ini, para pembaca dapat memberikan saran yang membangun demi perbaikan penulisan hasil penelitian tersebut.

IV

Jember,

F ebruari 2012

Ketua Penelitf, dr. Candra Bumi, MSi

(7)

DAFTAR

_lSI

hal am an

SA

M

P_UL DA_LAM ... . . . .. . . ... ... · ..

i

SK PENELITI ... : ... II LEMBAR PENGESAHAN ... . . . . ... . . . ... . . ... . . . ... . . . .

.

. . . ... iii

KAT A PENGANT AR

_.

... . ...

.

. ..

.

... . . ...

.

... ...

.

. iv

DAFTAR ₁₅₁. . . ... . .

.

... . . . ... . .

.

. . . ... , ... . . .. . . ... v

RINGKASAN ... . ...

.

... . . . ...

.

. . ... . ... vii

ABSTRAK ... . . . ... . .. .. . . .

.

... . . . ... . . . ..

.

...

viii

DAFTAR ANGGOTA TIM PENELITI . . . ... . . . ...

ix

DAFTAR T ABEL ..

.

... . . . .

.

. . ... . . . ... . . .

x

DAFTAR GAMBAR . ... . . .

.

... . . . . ... . . . ... . . .

.

... . . . ... . . ... . . ...

xi

DAFTAR LAMPIRAN . . . . ... . . ... ...

.

. . . . ... . . ... . . . .

.

... . . . ..

. xii

I. PENDAHULUAN ... . . 1

1.1

Latar Belakang . . . .

.

... . . . ... . . ..

.

. .

.

. . . .

.

. . .

.

... . .

1 1 .2

Rumusan Masalah . . . . .

.

... . . . .

.

... . . ... . ... . . . ... . . . ...

.

3

II. TUJUAN PENELITIAN . .... . . ... . . ... · ....

.

. . . ... . . . ... .. .

4

2.1

Tujuan Umum

_{... ... . 4}

2.2

Tujuan Khusus . . .

.

. . . .... . . ... . . . ... . .

.

... . . . ... . 4

2.3 Manfaat Riset. ... ... . 4

2.4 Hipotesis Riset ... , ... . 4

III.BAHAN DAN METODE PENEUTIAN . . . ..

.

.. . . ... . ....

.

... · ... .

5 3.1 Bahan

. . . ... . . . ... . . . ... . . .

5 3.2 Varia

b

e

l Penelitian

... 5

3.3

Metode Penelitian ... . 7

3.4 _{Diagram Allr Penelltlan}. . . ... ... . . . ... . ...

.

... . . .

9

IV.HASIL DAN PEMBAHASAN ...

.

.. . . .. . . ... .. .. . . . ... . .

.

. . . ... .

10

4.1

Hasil Penelitian . . . . ... . ... . . . .... . . ..

.

...

.

. . .

10

4.1.1

Morfologi Kultur MSCs . . . ... . . . .

.

. . . .

.

.... . . ... . . ... . . . ... _. .... .

10

4.1.2

Pembuatan Model Hipoksia . . . ... . . . ... . . ... . . ... . ...

12

4.1.3

/dentifikasi Sel MSCs . . . ... . . ... . . . ... . . .

.

...

13

4.1.4 Viabilitas

MSCs pada kondisi hipoksia setelah pemberian

genistein dengan mengguna�an MTI assay ... 13

4.1.5 Efek pemberian genistein terhadap aktivitas p38 MAPK,

Caspase-3, dan Caspase-9 pada kultur MSCs hipoksia . . ... . . . ... . . .

15 v

•

(8)

4.1.6 Efek pemberlan genistein terhadap apoptosis sel

pad a kultur MSCs hipoksia ... 16

4.2. Pembahasan . ... . . ... . . . ... . . ... . ... ... . ... . . . .. 18

V

KESIMPULAN DAN SARAN . . . ... . . . ... . . .... . . ... . . ... . 21

UCAPAN TERIMA KASIH . . . ... . . : ... 22

DAFTAR PUSTAKA

. . . .. . . ... . . .. . . ... . . . .. . . ... . . 23.

LAMPIRAN

. . . .. . . .. . . .. . . .. . . .. . . ... . . . ... . . . 25

(9)

•

RINGKASAN

Candra Bumi, Heni Fatmawati, Nindya Shinta, Potensi Genistein dalam Meningkatkan Kemampuan Diferensiasi dan Proliferasi Mesenchymal Stem Cells (MSCs) melalui Penghambatan Jalur Apoptosis (Studi pada Kultur MSCs Kondisi Hipoksia).

Penyebab utama gagal jantung adalah infark miokard akut. Pada infark otot jantung mengalami iskhemia (hipoksia), peningkatan sekresi sitokin, dan terjadi inflamasi. Terapi sel menggunakan mesenchymal stem cells (MSCs) dari bone marrow untuk mengatasi infark mlokard akut telah menunjukkan hasii yang sangat menjanjikan akan tetapi minimnya viabilitas dari terapi ini menjadi terbatas. Hal ini disebabkan kondiksi hipoksia pada saat terapi mampu meningkatkan ROS sehingga MSCs menjadi apoptosis. Genistein merupakan isoflavon yang bersifat antioksidan dan pada dosis rendah mampu sebagai antiapoptosis. Sehingga penelitian ini bertujuan untuk mempelajari peranan genistein terhadap viabilitas dan derajat apoptosis kultur MSCs dengan kondisi hipoksia dan efektivitas genistein terhadap aktivitas p38MAPK, caspase-3 dan caspase-9 pada kultur MSCs dengan kondisi hipoksia.

Hasil pene

l

itian menuhjukkan terdapat peningkatan viabilitas MSCs kondisi hipoksia dan penurunan derajat apoptosis MSCs seiring dengan peningkatan dosis genistein (p<O,OS). Hasil pemeriksaan terhadap kadar p38MAPK cenderung menurun begitupula untuk kadar caspase-3 dan kadar caepaee-9 hasllnya juga cenderung menurun dengan p>0,05. Hal _lnl menunjukkan bahwa genistein dapat meningkatkan vlabllltas MSCs kondlsl

hipoksia dan menurunkan derajat apoptosls MSCs kondlsl hlpoksla. Penurunan

derajad apoptosis mungkin merupakan akumulasi hambatan jalur apoptosis yang

lain seperti caspase-8, caspase-7 yang pada penelitian kali ini belum dilakukandan juga mungkin melalui hambatan ROS. Penurunan kadar p38MAPK, caspase-3, dan caspase-9 yang tidak signifikan mungkin diakibatkan oleh dosis genistein yang kurang besar. Genistein merupakan salah satu isoflavon yang terdapat pada kedelai. Genistein mempunyai ban yak efek diantaranya . adalah efek hormonal karena bersifat sebagai fitoestrogen, anti inflamasi, anti oksidan, dan mempengaruhi proliferasi dari sel. Studi pada sel MCF-7

(

H

uman breast cancer cells) menunjukkan efek bifasik dari genistein yaitu pada konsentrasi rendah memicu pertumbuhan sedangkan pada konsentrasi tinggi menghambat pertumbuhan. Mekanisme yang te�adi untuk menjelaskan peristiwa bifasik tersebut belum sepenuhnya jelas. Penelitian pada sel otot genioglossus didapatkan hasil genistein pada konsentrasi rendah (< 10 nM) tidak menunjukkan efek, pada konsentrasi sedang (10 nM- 1 JJM) mampu melindungi sal terhadap

apoptosis karena hlpoksia, sedangkan pada konsentrasi tlnggl (> ₁JJM) memlcu

terjadlnya apoptosis. Proteksi genistein pada hlpoksla dlduga melalul

peningkatan Akt dan ERK, juga efek antioksidannya mampu menghambat ROS, disamping itu genistein juga mempengaruhi rasio Bax/BCI2 menjadi turun

Hasil dari penelitian ini diharapkan dapat mengungkap leblh jelas mekanisme genistein dalam memperbaiki penurunan jumlah dan fungsi MSCs pada kondisi hipoksia pada saat dilakukan terapi sel punca menggunakan MSCs. Disamping itu genistein sebagai antioksidan dapat gunakan sebagai pilihan terapi untuk membantu keberhasilan terapi sel punca.

VII

(10)

ABSTRAK

Terapi dengan MSCs telah menunjukkan hasil yang menjanjikan akan tetapi tidak

sesuainya lingkungan mikro (hipoksia) mengakibatkan MSCs apoptosis.

Genistein sebagai antioksidan dan pada dosis rendah dapat sebagai

antiapoptosis diharapkan mampu meningkatkan efektivitas terapi sel punca.

Tujuan dari penelitian ini untuk mengkaji efektivitas genistein terhadap viabilitas

mesenchymal stem cells (MSCs) khususnya dalam kemampuannya regenerasi

melalui penghambatan apoptosis (p38MAPK, caspase-9, caspase-3) pada

kondisi hipoksia. Metode yang digunakan pada penelitian ini menggunakan

MSCs dari sumsum tulang kelinci New Zealand. Kultur hipoksia dengan

menggunakan Anaeropack-anaero (MGC). Viabilitas MSCs, diukur dengan

_MTT

assay,

derajat apoptosis dengan

fluorescence

dye Hoechst

33342, sedangkan

p38MAPK dengan ELISA, caspase-9 dan caspase-3 dengan

colorimetric.

Analisis

data

dengan menggunakan one way anova. Hasilnya didapatkan

vi

a

bll

i

tas MSCs pada kondisi

h

ip

o

k

s

i

a meningkat secara signifikan

_(p,O,OS)

pada setlap kelompok begltupula dengan derajad apoptosls yang

menurun

(p,0,05)

selrlng dengan menlngkatnya dosls genistein sedan

gka

n

kadar p38MAPK,

caspase-9, dan caspase-3 menurun tldak signifikan (p>0,05). Keslmpulannya

genistein dapat meningkatkan viabilitas dan menurunkan derajad apoptosis tetapi

tidak untuk menurunkan p38MAPK, caspase-9, dan caspase-3.

(11)

DAFTARANGGOTA TIM PENELITI

1. dr. Candra Bumi, MSi (Ketua)

2. dr. Heni Fatmawati, MKes (Anggota)

3. dr. Nindya Shinta, MKed (Anggota)

IX • .. t • �

(12)

DAFTAR TABEL

No

Judul

1. Tabel 4.1. Hasil analisis statistik pengukuran viabilitas MSCs pada

kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis

Hal a man

genistein

. . . ... . . . ... ... 14

2.

Tabel

4.2.

Hasil analisis statistik pengukuran aktivitas p38 MAPK

pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa

dosis genistein

. . . ... . . . ... ... . ... . . ... 15

3. Tabel

4.3.

Hasil analisis statistik pengukuran aktivitas caspase 9

pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa

dosis genistein

. . . ... . . . ...

.

... 16

4.

Tabel 4.4.

Hasil analisis statistik pengukuran aktivitas caspase 3

pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa

dosis genistein

. . . ... : ... 16 5.

Tabel4.5. Hasil analisis statistik persentase jumlah apoptosis pada

kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein

... 17

(13)

•

DAFTAR GAMBAR

No

Judul

1.

Gambar

4.1.

Gambaran sel MSCs pada hari pertama

Halaman

setelah k

u

l

tu

r

... 11 2.

Gam bar

4.2.

_{Gamba ran sel MSCs setelah dilakukan pencucian}

_{... 11}

3. Gam bar 4.3.

Gambaran sel MSCs masih 30% dengan bentuk

spindel

. . . .. . . ... 12

4.

Gam bar

4.4.

Gamba ran sel MSCs yang sudah konfluen 80%

. . . ... 12

5.

Gam bar

4.5.

Gamba ran hasil identifikasi sel MSCs

... . ... . ...

13

6. Gam bar 4.6. Diagram batang hasil pengukuran viabilitas MSCs

dengan menggunakan MTT assay pada kultur MSCs hipoksia

yang dipapar beberapa dosis genistein

. . . ... ... ... . . ... 14 7.

Gam bar

4. 7.

Diagram batang hasil pengukuran aktivitas p38 MAPK

pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein

... 15 8.

_{Gambar 4.8. Diagram �atang hasil peng}

_u

k

u

ran

kadar caspase 9

pada kultur MSCs hlpoksla

yang

dlpapar

beberapa dosls g

e

n

i

s

tein

... 15

9. Gambar

4.9.

Diagram batang hasil pengukuran kadar caspase 3

pada kultur MSCs hipo

k

s

i

a yang dipapar beberapa dosis

genistein

... 16

10

Ga

m

ba

r 4.10.

Gambaran apoptosis kultur MSCs menggunakan

pewamaan

fluorescence dye Hoechst 33342 ... 17

xi

(14)

DAFTAR LAMPIRAN

No

Judul

Halaman

1. Anal

isis Statistik

One Way A nova

. . . .-

... ... 24

(15)

•

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Penyebab

utama

gagal jantung adalah infark miokard yang mengarah pada

kerusakan permanen dari kardiomiosit dan diikuti oleh

remodelling

patologis dari

ventrikel

kiri 1•2. Me

ski

pun

pada

penelitian

terdahulu disebutkan terdapat pembelahan

•

dari

kardiomiosit setelah infark pada otot jantung,

tetapi kemampuan mit()sis tersebut

menjadi

sangat terl:iatas untuk menggantikan

sel-sel

yang

hilang

setelah

infark

miokard1. Terapi sel menggunakan

mesenchymal

stem

cells (MSCs) dari

bone

marrow

telah menunjukkan basil yang sangat menjanjikan dalam hal meregenerasi dan

mengembalikan miokardium yang iskemia, mengembalikan fungsinya serta merupakan

strategi efektif yang aman untuk terapi gaga! jantung iskemia 3•4•5•6. Namun demikian

minimnya

viabilitas

dari t

ranspla

n

t

a

si MSCs

pada jantung yang mengalami infark

menyebabkan efikasi

dari terapi

ini menjadi terbatas

7•8. Penelitian oleh Geng, th

2003,

menunjukkan

99%

MSCs

yang

diinjeksikan

ke ventrikel

kiri dari CB17SCID/tikus

dewasa

beige

mengalami

kematian

setelah

4

hari injeksi,

hal

ini membuk:tikan bahwa

lingkungan mikro

iskemi/microenvironment

yang iskemi

pada miokardium yang infark

tidak kondusif untuk

ketahanan

MSCs. Dugaan mekanisme yang mendasari

menurunnya fungsi MSCs adalah sel-sel MSC banyak yang mengalami apoptosis dan

kapasitas untuk melekat serta diferensiasi menjadi MSCs

turun.

Dengan demikian

meningkatkan ketahanan dari MSCs yang berimplantasi menjadi hal pen�ing untuk

peningkatan efikasi dari terapi

stem cells.

Tujuan

_{cardiomyop/asty}

seluler adalah untuk mengganti kardomiosit yang

hilang setelah

iskemia, menginduksi revaskularisasi pada

daerah trauma, dan mencegah

remodelling

patologis setelah infark 10•11.

Saat

ini

cardiomyoplasty

seluler

menggunakan

MSCs t

el

ah

menjadi altematif utama sebagai terapi

untuk

meningkatkan

fungsi pada penyakit otot jantung10. Kandidat yang

ideal untuk

cardiomyoplasty

seluler

adalah

sel yang mempunyai kemampuan berdiferensiasi penuh sebagai otot jantung 10•

12. Populasi

sel

tersebut dapat ditemukan pada sumsum tulang dewasa. Saat ini telah

diketahui bahwa populasi sel adheren 'yang diisolasi dari sumsum tulang dan di

ekspansikan

secara

in vitro, merupakan sumber yang potensial dari

undifferentiated

•

mesenchymal

stem

cells (MSCs) yang

akan

menjadi tipe seljaringan penyambung11.

Pengeluaran MSCs dari

bone marrow

sebagai

res pon terhadap

stimulus untuk

mobilisasi

merupakan interaksi yang komplek dalam

microenvironment

pada

marrow

1 t

(16)

setempat. Beberapa faktor yang mungkin berperan sebagai penyebab kematian awal dari sel MSC dipengaruhi oleh saat isolasi dan injeksi sel, hipoksia, atau ketidakberadaan

survival factor.

Adanya kondisi hipoksia pada miokardium yang infark, akan menstimulus respon imun untuk bereaksi dan mengakibatkan terjadinya proses potensi redoks yang menghasilkan peningkatan stress oksidatif pada sel otot

j

a

ntun

g

14.

P

en

i

ng

k

a

t

an

ROS

m

e

ny

e

b

ab

k

an

modulasi dari molekul proinflamatori

seperti molekul

TNF-a

yang pada akhirnya mengaktifkan jalur aktivasi mitogen

activated protein kinase (MAPK)15'16. Aktivasi MAPK selanjutnya menyebabkan

kondisi patologis yang mengaktifkan kaskade apoptosis melalui caspase-3

9•16.

Mengingat proses apoptosis menjadi faktor utama dari patogenesis kegagalar) MSCs berimplantasi pada daerah jantung yang infark, maka, penghambatan beberapa molekul yang terlibat pada apoptosis merupakan hal yang tepat untuk meningkatkan efektifitas terapi menggunakan

mesenchymal stem cells (MSCs).

Indonesia sebagai negara tropis mempunyai keragaman flora yang mempunyai p

ot

ensi besar untuk dikembangkan dalam dunia pengobatan. Akan tetapi

p

en

e

li

t

ia

n

tentang hal tersebut masih sangat sedikit, padahal berbagai kandungan zat yang

mempunyai khasiat sebagai obat banyak terdapat pada tumbuhan-tumbuhan tersebut.

Isoflavon dari

k

_ed

el

a

i

telah diterima

secara luas

dan menjadi perhatian selama beberapa

tahun karena potensinya dalam mencegah penyakit kronis. Genistein merupakan isoflavon utama yang berasal dari kedelai, bersifat sebagai fitoestrogen dan mempunyai berbagai aktivitas biologi. Sejauh ini genistein diketahui mempunyai beberapa efek antara lain menurunkan

_{stress oxidative}

17

dan meningkatkan sintesa NO 18• Meskipun beberapa data menujukkan genistein mempunyai peran proteksi pada penyakit jantung, namun mekanisme yang mendasarinya masih belum diketahui, dan penelitian tentang efek genistein pada penyakit jantung masih sangat terbatas.

Genistein diketahui mempunyai efek menurunkan kolesterol serum dan

menurunkan insiden penyakit ko'roner. Yang lebih menarik, genistein juga mampu

menghambat aktivitas sitokin proinflamasi, menurunkan apoptosis kardiomiosit,

memperbaiki fungsi endotel dan meningkatkan imunotoleransi setelah transplantasi

18•19. Bebcrapa penelitian lain juga membuktikan genistein berperan scbagai

antiapoptosis pada berbagai sel, diantaranya genistein mampu memperbaiki fungsi jantung pada tikus dan babi dengan stenosis aorta dengan menghambat apoptosis pada kardiomiosit 19.2°. Meskipun terdapat beberapa bukti bahwa genistein sebagai antiapoptosis, namun peranan genistein dalam melindungi MSCs pada kondisi hipoksia

(17)

masih belum diketahui. Untuk itu pada penelitian ini akan diungkap mekanisme kerja genistein pada MSCs khususnya kemampuannya pada regenerasi sel kardiomiosit melalui penghambatan apoptosis pada kondisi hipoksia

in vitro.

Berdasarkan

kemungkinan keterkaitan kemampuan regenerasi MSCs tersebut dengan potensi

genistein sebagai antiapoptosis dan antioksidan serta kemudahan untuk didapatkan dan

keamanan yang lebih tinggi, maka penelitian ini perlu dilakukan.

1.2 Rumusan Masalah

•

Apakah peranan genistein pada viabilitas dan derajat apoptosis pada

ku1tur

MSCs dengan

k

on

d

isi

h

i

pok

s

ia?

•

Bagaimana efektivitas

_{genistein terhadap ek}

s

_p_r_e

s

_{i p38MAPK, caspase-3 dan} .

(18)

ll.

TUJUAN PENELITIAN

2.1 Tujuan Umum:

Mengkaji

_efektifitas

genistein

_terhadap

ketahanan

_{mesenchymal stem cells}

(MSCs)

khususnya dalam kemampuannya pada regenerasi melaJui penghambatan

apoptosis pada kondisi hipoksia in vitro.

2.2 Tujuan Khusus:

•

Mempelajari peranan genistein terhadap viabilitas dan derajat apoptosis kultur

MSCs dengan

kondisi hipoksia.

•

Mempelajari efektivitas genistein terhadap aktivitas p38MAPK, caspase-3 dan

caspase-9

pada kultur MSCs

de

ngan

kondisi hipoksia.

2.3 Manfaat Riset

Dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan pengetahuan bahwa proses apoptosis pada kultur

mesenchymal stem

cells (MSCs) pada kondisi hipoksia melalui mekanisme yang melibatkanjalur p38 MAPK, caspase-3 dan caspase-9.

2.4 Hipotesis Riset

:

Pemberian genistein

mampu

meningkatkan viabilitas dan

proliferasi MSC menghambat pro

ses apo

p

_t

o

_s

i

_s

pada kultur Mesenchymal stem cells

kondisi hipoksia melalui hambatan jalur p38 MAPK, caspase-3, dan caspase-9.

(19)

m. BAHAN DAN METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Bahan

Medium Dulbecco's

_(IMDM),

fet!ll bovine serum (FBS), rabbit polyclonal antibodies,

anti

_TNFa,

anti MAPK (Cell Signal Technology, Beverly, MA), mouse monoclonal

antibodies, anti-�-actin (SantaCruz). Horse-radish peroxidase-conjugated secondary

antibodies (SantaCruz Biotechnology), Caspase-3 colorimetric assay kit (Biovision

Research, CA), Caspase-9

colorimetric

assay kit

(Biovision

Research, CA).

3.2 Variabel Penelitian

3.2.1 Klasifikasi Variabel Penelitian

Dalam penelitian ini melibatkan 3 varia bel:

1. V ariabel bebas: Genistein

2.

Variabel kendali: Kondisi

hip

oksia kultur MSCs

3.

Varia

bel Moderator:

Kultur MSCs

4. Variabel tergantung: jumlah apoptosis, prol

iferasi sel, kadar p38MAPK, kadar

caspase-9, kadar caspase-3.

3.2.2 Definisi Operasional Variabel Penelitian a. Variabel Bebas:

Genistein: Genistein adalah sediaan fitoestrogen yang dipakai sebagai terapi harmon (Sigma Chemical, St. Louis,MO). Diberikan dalam berbagai dosis yaitu 1 �mol/L,

5

�mol/L, 10 �mol/L

b. Variabel Ke

n

d

al

i:

Kondisi hipoksia: kultur MSCs dikondisikan hipoksia dengan konsentrasi

₀₂

0.5%.

Kondisi hipoksia dilakukan dengan memberikan Anaeropack Anaero dari

MGCA

yang mengandung asam askorbat sehingga dapat mengubah

₀₂

menjadi

C02

selam

a

1

jam.

c. Variabel Moderator:

Kultur MSCs: MSCs diambil dari sumsum tulang kelinci New Zealand jantan,

usianya 6 bulan dan berat badan 900 gr. Usia 6 bulan merupakan usia remaja

bagi kelinci sehingga diharapkan mendapat BMSCs yang bagus. Sebelum

5 t

(20)

diambil kelinci dilakukan pembiusan kemudian dengan menggunakan spuit

₁₀

ml yang sudah ada heparinnya stimsum tulang diambil secara aseptis. Setelah

didapat aspirat dari sumsum tulang kemudian aspirat di biakkan dalam medium k:ultur BMSCs.

d.

V

ariabel tergantung.

I. Jumlah Apoptosis: banyaknya BMSCs yang mengalami apoptosis diwarnai dengan fluorescent dye

H

oechst dan propidium iodide. Analisis morfologi dilihat dengan mikroskop fase kontras dan mikroskop fluoresens (Olympus).

Inti set yang berpendar biru menunjukkan apoptosis sedangkan nukleus yang berwarna pink menunjukkan nekrosis. Junilah sel dihitung dalam 10 lapang pandang tiap 400 sel yang kemudian hasilnya di rata-rata.

2.

Proliferasi sel: banyaknya sel mengalami mitosis yang diukur menggunakan MTT assay berdasarkan aktivitas dehidrogenase. Bila aktivitas meningkat maka wama pada well akan semakin ungu. Besamya intensitas warna diuk:ur dengan menggunakan spektrofotometer.

3. Kadar p38MAPK: kadar p38 MAPK yang terfosforilasi pada kultur set MSCs yang diukur dengan ELISA

(p38 immunoassay kit assay design).

Nilai disajikan dalam satuan pg/mL.

4. Kadar caspase-3: banyak:nya caspase-3 di dalam _selMSCs yang dideteksi dengan Colorimetric assay. Caspase-3 dideteksi berdasarkan hidrolisis dari peptida asetil-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilid� (pNA) sehingga melepaskan

pNA. pNA mempunyai absorbansi tinggi pada

405

nm. Tingginya kadar

pNA dapat diukur dengan menggunakan ELISA reader. Nilai satuan

disajikan dalam �glml.

5. Kadar caspase-9: banyaknya caspase-9 di dalam sel MSCs yang dideteksi

dengan Colorimetric assay. Caspase-9 dideteksi berdasarkan hidrolisis dari

peptlda asetii-Asp-Giu-Vai-Asp p-nltroanlllde (pNA) sehlngga melepaskan pNA. pNA mempunyai absorbansi tinggi pada

405

nm. Tlngglnya kadar pNA dapat diukur dengan menggunakan ELISA reader. Nilai satuan

(21)

•

3.3. Metode Penelitian

• _{llolall dan}

Kultur Kultur MSCs

Isolaai MSCs dilakukan dengan mensambil

bone marrow

(sumsum tulana) kelinci sehat

secara aseptis. Sel-sel dari

marrow

yang diperoleh kemudian diletakkan pada kultur disk dengan densitas lxl06 sel/cm2 pada 6 well dengan medium IMDM yang berisi 15% FBS, suplemen stimulator MSC, dan antibiotik (100

U

pe

n

i

c

il

l

in/1

0

0 J.Lg/mL

streptomycin) pada suhu 37°C, 5% C02 ·dan udara 95%. Sel-sel yang

tidak.

melekat di

_gant

i

_{dengan medium yang}

baru setelah 72

j

a

_{m dan}

se

_l

a

_n

j

_u

tn

_{ya set}

iap

₄

hari sekali.

Identifikasi sel-sel MSC dilakukan menggunakan flowcytometry (CD 105 dan CD 45).

Induksi apoptosis pada MSCs dilakukan dengan kondisi hipoksia yaitu dengan

me

m

asukk

an

flask kultur

k

e

dalam inkubator khusus

yang didalamnya diberikan anaeropack dari MGCA 13.

• Perlakuan Genistein.

Setelah konfluen, sel diinkubasi dengan genistein. Konsentrasi genistein (Sigma) yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1, 5, dan 1 OJ.Lmol/L. MSCs diinkubasi dengan beberapa konsentrasi genistein selama 24

jam.

•

Uji

MTT Assay

Viabilitas sel untuk pengujian proliferasi sel menggunakan metode uji MTT (Cell

proliferation kit

1, KPL Diagnostic)

dimana garam

tetrazolium berwarna

kuning

dimetabolisme oleh sel viabel menjadi kristal formazan yang berwana ungu. MSCs diinkubasi selama 3 jam dengan larutan MTT (5 mg/ml). Kristal formazan dilarutkan dalam bufer SDS (100/o SDS dalam

_{O.OIN HCI)}

semalam dan produk diukur secara spektrofotometri pada A. 570 run.

• Kadar p38 MAPK dengan ELISA.

Kadar

TNF-n

dan MAPK intraseluler pada set MSC dengan beberapa k

o

n

d

i

si

hipoksia diuku r dengan metode ELISA, prosedur pengukuran dilakukan sesuai

dengan petunjuk yang tertera pada label Anti Rat ELISA Kit (Assaydesign).

7

(22)

• Detekll Sel Apoptosis dan

Nekrosis.

Untuk mengidentifikasi set apoptosis dan nekrosis, kondensasi kromosom diwamai d

e

nga

n

fluorescent dye

Hoechst 33342 (Sigma) dan propidium iodide (Sigma)

(

Jank

ow

s

ka et a/, 1997).

Sel-sel difiksasi pada suhu ruang

selama 30 m

e

_ni

t dalam

PBS yang mengandung

1%

_glutar

al

d

e

h

y

d

e

, dicuci 2

kali

dengan

PBS selanjutnya

dipaparkan pada

₅

�g/ml

Hoechst

33342 d

_al

am

PBS

s

el

_ama

30

menit suhu

ruang.

Analisis morfologi dilihat dengan mikroskop fase k.ontras dan mikrosk.op fluoresens

(Olympus). Inti sel yang berpendar biru menunjukkan apoptosis sedangkan nukleus

yang berwama pink menunjukkan nekrosis.

• Kadar caspase-9 den gao

Colorimetric

Assay.

Kadar

Caspase·3 dan caspase·9 pada MSCs yang sudah dipapar dengan beberapa konsentrasi Genistein diukur deng

_an

Colorimetric Assay.

• Analisis Data

Data hasil p

e

n

gu

kur

a

n

ditampilkan dalam mean± SD. Data

di

anal

is

i

s dengan

menggunakan

one-way ANOVA

(

a

_n

al

is

i

s

ragam) dilanjutk.an dengan uji Tukey untuk

melihat perbedaan masing-masing variabel. Analisis data dilakukan dengan

komputerisasi menggunakan metode

SPSS

versi

11.

(23)

3.4 Diagram Alir Penelitian

ldentifikasi CD 105

Meta de

Pl

+ Genistein

lj.tmoi/L

Pl

r:

...

;+

_.

aenlstelh

t.:·

·

=:

:.s��ll:�: .

9 t

(24)

IV. BASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Basil Penelitian

4.1.1 Morfologi Kultur MSCs

Penelitian ini

m

enggu

nakan

sa.mpel dari sumsum tulang kelinci, Penelitian ini

telah

diajukan pada komisi etik Lembaga Penelitian Universitas Airlangga. Kriteria

donortikus

adalah d

e

n

gan

berat 150 gram dengan usi� 1,5 bulan.

Isolasi MNCs dilakukan dengan mengambil sumsum tulang kelinci sehat secara

aseptis dan diaspirasi ke dalam spuit yang telah diberi heparin 1000 unit. Pengambilan

aspirat sumsum tulang tikus dari daerah krista iliaka. Sebelumnya tikus dibius dengan

injeksi ketamin (untuk induksi) 20 mg!kgBB dan Xylasin (untuk sedasi)

3

mglkgBB.

Pada daerah pengambilan didisinfeksi

yang

kemudian ditutup doek

_steril.

Pada pengambilan pertama didapatkan kurang dari 1 ml

sumsum tulang.

Kemudian

MNCs

dipisahk:an dengan menggunakan Ficoll-paque (1077;Sigma). Setelah disentrifus 1600 rpm selama

15

menit maka Buffy coat yang terbentuk diambil dengan menggunakan pipet pasteur secara perlahan.

Kemudian sel MNCs

dibilas dengan PBS

lx

dan disentrifus 1600

rpm selama

10

menit. Pelet yang terbentuk diresuspensi dengan medium kultur yang komplit yang

berisi o.-MEM, FBS

20%,

1-Glutamin 2mM, dan antibiotik (100

U

penicillin/100 j.lg/mL

streptomycin). Hasil resuspensi diletakkan ke beberapa plate dengan volume masing

masing plate

5

mi. Kemudian sel diamati pertumbuhannya setiap

hari

dan setiap tiga

hari medium

d

ig

ant

i.

Pada pengambilan yang pertama

terjadi kegagalan pertumbuban

MSCs.

Pertumbuhan sel sangat lambat sehingga sel akhirnya mati. Hal ini diakibatkan karena kontak antar sel (cell signaling) terhambat sehingga tidak segera terbentuk koloni sel. Ketika diulang isolasi yang ke dua pada saat pengambilan aspirat terdapat kesulitan dan

hasil aspirat kurang

dari 1

ml.

S

et

e

l

ah sel

MNCs ditanam ke plate maka setelah diamati

pertumbuhannya lambat dan terjadi kontaminasi.

Keberhasilan isolasi MSC dari sumsum tulang sangat bergantung dari cara

pengambilan dan jumlah aspirat yang djdapat. Jika jumlah sel yang didapat sedikit

maka komunikasi antar sel juga terganggu. Cara pengambilan yang sulit mengakibatkan

kemungkinan terjadinya kontaminasi juga tinggi.

(25)

•

Dengan pertimbangan di atas maka diambil keputusan untuk mencoba donor sumsum tulang berasal dari kelinci. Berat badan kelinci yang digunakan adalah

₉₀₀

gr

dengan usia 6 bulan.

Setelah aspirat didapatkan dan set

_MNCs

dipisahkan dengan Ficoll-hipaque

maka sel tersebut dibiakkan kedalam plate dan ditambahkan medium

kultur

_yang

komplit. Pada hari pertama tampak sel masih berbentuk bulat dan b

e

l

um

menempel ke

dasar plate.

Gambar

_4.1.

Gambaran sel MSCs pada hari pertama setelah kultur. Tampak sel yang masih berbentuk bulat-bulat.

Pada

3 x

24 jam

sel harus dicuci

untuk

memisahkan antara MSC

dengan

sel

hemopoeitik. MSC akan melekat pada dasar plate sedangkan set hemopoeitik tidak: melekat pada dasar plate.

Gambar 4.2. Gambaran sel MSCs setelah dilakukan pencucian. Sel dengan

bentuk poligonal yarig telah adheren.

I

(26)

Pada hari ke enam medium kultur perlu diganti dan tampak MSCs hari ke enam

(Gambar

4.3.).

Dari gambar di atas tampak sel sudah berbentuk �pindel dengan adanya koloni

yang terbentuk. Koloni tersebut mengadakan komunikasi antar sel sehingga sel dapat

berproliferasi dengan baik. Pertumbuhan sel masih

30%

sehingga belum dapat di

pasase.

Pada hari

ke

10 tampak sel

sudah memenuhi plate sebanyak

60%.

Dengan

pertumbuhan sel seperti spiral

(Gambar 4.4.)

Gambar 4.4. Gambaran sel MSCs yang sudah konflue·n

80%.

Sel ini siap untuk diberi

kondisi hipoksia dan pemberian genistein.

4.1.2 Pembuatan model hipoksia

Pembuatan model hipoksia dengan menggunakan anaeropack Anaero. Alat ini

mengandung asam askorbat yang dapat menyerap Oksigen dan mengubahnya menjadi

(27)

•

C02. Bila telah terjadi kondisi hipoksia maka bahan ini akan berubah warna menjadi

ungu. Hipoksia yang dihasilkan oleh alat ini

bisa

_{mencapai kadar 02 0,5% dalam}

₁

_jam.

Pada

kultur MSC

no

rmal

menunjukk:an gambaran sel yang normal, yang

mempunyai ciri-ciri bentuk sel poligonal dengan jarak antar sel yang teratur dan rapat, permukaan sel rata ditandai dengan penampakan inti, membran plasma, sitoplasma

serta

matriks ekstraseluler). Sedangkan pada MSC hipoksia menunjukkan ga.mbaran sel yang mengalami apoptosis. Hal ini ditandai dengan MSC yang mengalami sel

shrinkage,

membran menggelembung

(blebbing),

inti

sel fragmentasi.

4.1.3. ldentifikasi Sel MSC

Dari hasil identifikasi dengan menggunakan CD

1 05/endoglin didapatkan bahwa

sel

yang di cat dengan FITC

mampu berpendar

hijau. Hal ini menunjukkan sel tersebut

mengekspresikan CD 105. Seperti diketahui CD 1 05+

merupakan

marker bagi sel MSCs.

Gambar 4.5. Gambaran hasil identifikasi sel MSCs. A. Merupakan

sel

MSCs yang

belum diidentifikasi.

B.

Sel MSCs yang yang telah diidentifikasi dengan

menggunakan CD1 05/endoglin dengan pengecatan FITC. Dengan

menggunakan mikroskop elektron tampak sel berpendar hijau.

4.1.4 Viabilitas MSCs pada kondisi bipoksia setelab pemberian genistein dengan menggunakan MTT assay.

Setelah terbentuk

MNC,

sel kemudian diinkubasi dengan genistein pada

konsentrasi

1,

5,

10 J.UllOl/L

selama

1 jam dengan kondisi hipoksia.

Pada

pengamatan

terhadap viabilitas kondisi hipoksia terjadi peningkatan viabilitas MSCs seiring dengan

peningkatan dosis genistein. Terdapat perbedaan yang signifikan (p<O,OS) antara dosis

0 J.UllOIIL

dengan do sis

1 �-tmol/L dan dosis

1 �-tmol/L dengan dosis

10 llffiOI!L

13

I

(28)

sedangkan dosis

5 J.unoVL dan dosis 10 J.Lmoi/L

tak

terdapat perbedaan yang signif"'tkan

(p>0,05) (gambar 4.6 dan tabel 4. 1).

\ ₁₄₀ ·.: co 120 --1 ,

*'

100 -

-0

80 "

Qi

_� _....... 60 � c

�

j

40 .,

:s

20 _j I IV ₀ _i· ·s ' �--� , __ .,_..,,..,,..,, ... � ... ·-·� ··---� ... -� ., ... ,. Hipoksia ... . . ... . . . ... '''')

Hlpoksia+Gen 1 Hipoksia+Gen 5 Hipoksia+Gen 10

�o�mol/l j..lmoi/L j..lmoi/L

Kelompok perlakuan

!

' ,, ,, ''" -� o '' ' • � O O ··�••M••<-' .. ,,,.,,,,�, "��"�"'"' """ ... v..• ... ... -.. -... � ... -.,. •• ..,... .... , ·-�_..,.,..,..,,,....,,_t

Gambar

4.6. Diagram batang hasil pengukuran viabilitas MSCs dengan menggunakan MTI assay pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa do

s

is gen

i

ste

i

n.

Tabel

4.1.

Hasil analisis statistik pengukuran viabilitas MSCs pada kultur MSCs

hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein

Per1akuan

Mean±SD

•

Hlpoksla

32,0::1:19,788

Hipoksia+Gen

1 !Jmoi/L 66,9::t:10,63b

Hipoksia+Gen

5

!JmOIIL

88,7::t:9,01bo

Hipoksia+Gen

10

j.Jmoi/L

99 8:1:20 _86°

Keterangan : notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata

(p>0,05)

4.1.5 Efek pemberiao genistein terhadap aktivitas p38

MAPK,

Caspase-3, dan

Caspase-9 pada kultur MSCs hipoksia

Setelah terbentuk

MNC,

sel kemudian diinkubasi dengan genistein pada

konsentrasi 1,

5,

10 )llllOIIL selama

1 jam dengan kondisi hipoksia. Pada pengamatan

terhadap aktivitas p38

MAPK,

kondisi hipoksia menyebabkan peningkatan pada

aktivitas p38

MAPK.

Pemberian genistein beberapa

dosis

pada kultur menunjukkan

t

e

lj

a

di penurunan

pad

a

aktivitas p38

MAPK

d

e

ng

an

penurunan tertinggi terjadi p·ada

pemberian genistein dosis 10

!lmoi/L (gambar 4.7

dan tabel 4.2).

14

(29)

" ... �·--· ... � ... .... .. ••··-··; ·--·�---� .. ---.��--·--···"'' r· .. ... .. �---··�--··--·· . . . ·---· · ... -· -- . . . . < ! 1,2

e

...

!

I

�

_Q. 1 0,8 0,6 . 0,4 0,2 0 Hipoksia I Hipoksia+Gen 1 Hipoksia+Gen 5 Hipoksia+Gen lo

l

.

· !

v.moi/L �-tmoi/L llmoi/L

,

Perlakuan

·

.

_I

!

. ... . . " . . .. J

Gambar 4.7. Diagram batang hasil pengukuran aktivitas p38 MAPK pada kultur MSCs hipoksia yang d

ipapar beberapa dosis genistein.

Perlakuan

Hlpoksla

0,9:t0, 14•

Hipoksia+Gen

1 �moi/L

0,8:t0,3111

Hipoksia+Gen 5

�moi/L

0,6:t0,12•

Hi oksia+Gen

10

moi/L

0,5±0,2411

Keterangan : notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata

(p>O,OS)

Hal yang serupa ditunjukkan pada aktivitas caspase-9 dan caspase 3 yaitu teljadi

penurunan tetapi tidak signifikan pada kelompok yang diberi genistein dibandingkan

dengan kelompok hipoksia, penurunan paling nyata pada kelompok genistein

konsentrasi

5 �ol/L.

- 140

'l

�

120 -1 c ₁₀₀

·1

.z.

_J

01 80 �

_!

a. 60

"!

., I rJ 40 ·

1

� 0 i , 2 1

�

' 0 .. ; . Hipoksia . ... . ... ! I < ' i

Hipoksia+Gen 1 Hipoksia+Gen ₅Hipoksia+Gen 10 i

( �mol/l 1Jmoi/L �oi/L

_!

;

Perlakuan !

< !

L--·----···---· ... . ... .. ... ... _, .. . ----···-·-· ...

--·-

--

--·----J

Gambar 4.8. Diagram batang hasil pengukuran kadar caspase 9 pada kultur MSCs hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein.

(30)

Tabel 4.3. Hasil analisis statistik pengukuran aktivitas caspase

9

pada kultur MSCs

hipok

sia vane dipapar beberaoa dosis aenistein

Caspase 9 Perlakuan Mean±SD

Hipoksia

100±3,7528

Hipoksia+Gen

1

_�moi/L

91,1±18,448

Hipoksia+Gen

5

�moi/L

88,3±27,858

Hipoksia+Gen

10

�moi/L

88,9±19,438

Keterangan : notasi yang sama menunJukkan tldak ada perbedaan yang nyata (p>0,05)

I

l

-I

!

� c: 2.

I

"" � : ftl : Q. i "' l

a

i .. i ftl ' _"tJ tV :111:: 140

.1

120

-1:

-

-1

60 ·-1 40 I

.1

20 _'l 0 '

-Hipoksia

I

!

l I

t

Hipoksia+Gen lHipoksia+Gen

5

Hipoksia+Gen

•

�moi/L

10

�moi/L

P

er

l

_a

kua

n

Gambar 4.9. Diagram batang

hasil

pengukuran kadar caspase 3 pada kultur MSCs

hipoksia

yang dipapar

beberapa dosis ge

n

_i

stei

n.

Tampak penurunan

kadar

caspase

3

seiring dengan peningkatan dosis geniste

_i

n.

Perlakuan

Hipoksia

1 00±9,368

Hipoksia+Gen 1

_tJmoi/L

94,4±16,678

Hipoksia+Gen

5

_�moi/L

87 ,6±38,458

Hi oksia+Gen

10

moi/L

85,8±36,988

Keterangan : notasi yang sama menunjukkan tidak ada perbedaan yang nyata (p>0,05)

Paparan kondisi hipoksia meningkatkan aktivitas caspase-3 pada

·

kelompok

tanpa genistein

(100

±

9,364)

dibandingkan

dengan kelomj:>Ok yang diberi genistein

meskipun tidak signifikan.

4.1.6 Efek pemberian genistein terbadap apoptosis sel pada kultur

MSCs

hipoksia.

Gambaran apoptosis pada kultur MSCs beberapa kelompok menggunakan pewarnaan

fluorescence dye Hoechst

33342

₍

Si

g

ma

₎

dan

propidium iodide

(Sigma),

(31)

•

menunjukkan adanya gambaran apop

t

os

i

s

pada sel yang berwarna biru. Gambaran sel

apoptosis, ditandai dengan MSCs yang mengalami sel

shrinkage,

membran

menggelembung (b/ebbing),

dan inti set fragmentasi (gambar 4.8).

Hasil

a

na

l

is

i

s s

tat

ist

i

k

pe

rs

e

n

ta

se

j

u

m

l

a

h ap

o

p

t

osi

s

MSCs pada kultur MSCs

kondisi hipoksia yang dipapar beberapa dosis genistein

me

n

u

n

j

ukk

an terdapat

persentase jumlah sel apoptosis yang lebih tinggi pada kelompok tanpa diberi genistein

(45,6±4,560)

secara

nyata (p<0.05). Pemberian genistein menurunkan jumlah sel

apoptosis pada dosis

1 �mol/L tetapi tidak. berbeda nyata dengan hipoksia. Penurunan

yang signifikan terjadi pada dosis 5 Jlmol/L (1 8,4±6,066)

_dan

10 J.UnOIIL (22,4±3,578)

dibandingkan dengan tanpa pemberian genistein., namun pada dosislO J.UnOl!L terjadi

kenaikan kembali jumlah set apoptosis walaupun tidak berbeda nyata dengan kelompok

dosis

5 f.UllOVL.

Tabel

4.5. Hasil analisis statistik persentase jumlah apoptosis pada kultur MSCs

k

d

hipo sia yang

ipapar beberapa dosis genistein

Persentase apoptosis

Pertakuan

Mean±SD

H

i

p

o

ksi

a

45,6±4,568

Hip

o

ksi_a+

G

en 1 �moi/L

37,6±7,278

Hipoksia+Gen 5

1Jmoi/L

18,4±6,07

b'

Hipoksia+Gen

1 0 IJmOVL

22,4±3,58b

Keterangan : notas1 yang sama menunJukkan tldak ada perbedaan yang nyata (p>0,05)

Gambar

4.10.

Gambaran apoptosis kultur MSCs menggun

a

kan pewamaan nuorescence dye Hoechst 33342. Oengan menggunakan mikroskop

fluoresent

tampak inti sel yang berpendar biru seperti yang ditunjukkan

panah.

17

I

(32)

4.1

Pembahasan

Hasil penelitian menunjukkan kondisi hipoksia,

menghambat kemampuan

MSCs dalam membentuk koloni dan menurunkan aktivitas proliferasi. Kemungkinan

hipoksia menginduksi terjadinya ROS yang akan menginduksi tetjadinya apoptosis

pada

kultur

sel MSCs.

Genistein merupakan salah satu isoflavon yang terdapat pada kedelai. Genistein

•

mempunyai banyak efek diantaranya

_adalah

efek hormonal karena bersifat sebagai

fitoestrogen, anti inflamasi, anti oksidan, dan mempengaruhi proliferasi dari sel. Studi

pada sel MCF-7 (Human breast cancer cells) menunjukkan efek bifasik dari genistein

yaitu pada konsentrasi rendah memicu pertumbuhan sedangkan pada konsentrasi tinggi

menghambat pertumbuhan

_21.

Mekanisme yang terjadi untuk menjelaskan peristiwa

bifasik tersebut belum sepenuhnya jelas. Penelitian pada

set

otot genioglossus

didapatkan basil genistein pada konsentrasi rendah (

<

10 nM) tidak menunjuk:kan efek,

pada konse

ntras

i sedang ( 10

nM - 1

f.1M)

mam

pu melindungi sel terhadap

·

apoptosis

karena hipoksia, sedangkan pada konse

_ntras

i tinggi (>

1

f.1M) memicu terjadinya

apoptosis. Proteksi genistein pada hipoksia

d

i

du

ga

me

_l

al

u

i

pe

ni

n

g

_ka

t

an

_Akt

dan

ERK,

juga efek antioksidannya mampu menghambat

ROS,

disamping itu genistein juga

mempengaruhi rasio Bax/BCI2 menjadi turon

22.

Hasil pengukuran kadar p38

MAPK

menunjukkan pada kondisi hipoksia

menyebabkan

peningkatan aktivitas p38 MAPK. Pemberian

genistein beberapa

dosis

pada kultur menunjukkan terjadi penurunan pada aktivitas p38

MARK

dengan

penurunan terti

n

ggi terjadi pad a

pem

b

e

ri

a

n

genistein dosis

₁₀

�ol/L.

Hal

ini

menunjukkan bahwa hipoksia pada sel

kutur

MSCs merupakan

hal

yang potensial untuk

terbentuk

radikal

bebas yang akan menginduksi kematian sel apoptosis melalui induksi

jalur p38 MAPK. Peningkatan aktivitas p38 MAPK pada

sel

akan

menginduksi

apoptosis melalui fosforilasi faktor transkripsi p5328. Pengakiifan p53 selanjutnya

_akan

mengaktifkan bax sebagai proapoptosis yang akan menginduksi pengeluaran

cytochrome

c

dari mitokondria

29•30.

Pemberian genistein menurunkan aktivitas p38

MAPK

secara nyata pada dosislO

�,

menunjukkan genistein sebagai antioksidan

berperan menghambat pada jalur sinyal apoptosis ini.

Hasil pengamatan terhadap aktivitas caspase-3 pada penelitian ini menunjukkan

hipoksia meningkatkan aktivitas caspase-3 pada kelompok

kontrol

(0,9±0,

139)

(p>0.05). Pemberian genistein bebetapa dosis mampu menurunkan

_kadar

caspase-3

tetapi tidak berbeda nyata dibandingk:an kontrol. Hal serupa juga terjadi pada aktivitas

18

(33)

•

oatpate-9. Hi

p

o

k

tia merupakan kondisi yang

po

tensial dalam

monalndukli terjadinya

stress oksidasi melalui peningkatan produk

reactive

oxygen species

(ROS) dan

perubahan fungsi sel MSCs.1.s ROS berperan penting pada proses apoptosis yang

diinduksi oleh hipoksia, hal ini juga menunjukkan bahwa hipoksia, melalui

_peningkatan

aktivitas caspase-9 dan caspase-3 dapat menginduksi terjadinya apoptosis sel MSCs.

Antioksidan genistein berperan pada penghambatan apoptosis sel, diduga genistein

mencegah caspase-9 dan caspase-3 memecah sitoskeleton maupun protein lain.

Pengamatan sel apoptosis menggunakan pewarnaan

fluorescence dye Hoechst

33342 menunjukkan terdapat

p

en

i

n

g

k

at

an

persentase jumlah

sel

apoptosis pada

kelompok kontrol (45,6±4,560) dan perlakuan genistein dosis

1 �mol/L s

ecara

nyata

(p<O.OS). Pada

kultur

MSCs hipoksia menunjukkan terjadi perubahan morfologi EPC

yang abnormal, ditandai dengan sel yang mengalami shrinkage,

dan

pembe

saran

membran

(membrane blebbing).

Inti sel tampak mengalami fragmentasi atau

kondensasi nukleus (Gambar 4.5B). Berdasarkan basil pengamatan morfologi tersebut

diatas, dapat disimpulkan bahwa terjadi apoptosis pada MSCs. Menurut Robbins,

et a/.

(1996),

terdapat dua b

ent

uk kematian sel

yang masing-masing mempunyai

c

i

_ri

-

c

iri

morfologi yang berbeda, yaitu apoptosis dan nekrosis32. Pada apoptosis terjadi kematian

sel yang terprogram, yakni fragmentasi kromatin, inti sel menjadi padat, ukuran sel

mengecil dan badan

sel

mengkerut. Sedangkan pada nekrosis, sel

nampak

men

gg

ele

m

bu

n

g

(swelling),

kromatin menggumpal, hilangnya integritas organel set dan

membran plasma, yang pada akhimya sel menjadi pecah

(membran

_{damage) .}

.

Perubahan morfologis dasar pada apoptosis dan nekrosis disebabkan teijadinya

dena

turas

i protein

dan

pen

cemaan

enzimatik organel dan sitosol.

Hal

ini menunjukkan

adanya proses stress oksidatif akibat kondisi hipoksia yang menyebabkan gangguan

proses replik.asi sel sekaligus menginduksi terjadinya apoptosis. Patomekanisme

terjadinya kematian sel disebabkan oleh jejas pada sel, salah satunya akibat jejas

kimiawi, yang menyebabkan meningkatnya produksi radikal bebas ataupun senyawa

oksigen reaktif (ROS) di dalam sel yang berasal dari reaksi oksidatif metabolik yang

berlebihan di dalam sel

27•33•34.

Pemberian genistein menurunkan jumlah sel apoptosis pada dosis

1 �mol/L

tetapi tidak berbeda nyata dengan kontrol. Penurunan yang signiflkan terjadi pada dosis

5 �moi!L (18,4±6,066)

dan

10 !J.ffiOI!L (22,4±3,578) dibandingkan dengar1 kontrol.

Penurunan gambaran apoptosis

sel

setelah pemberian genistein m

_enggu

nakan

pengecatan Hoechst 33342 ini sejalan dengan basil yang diperoleh pada pengukuran

(34)

aktivitas p38, caspase-9, dan caspase-3, me

n

u

n

j u

kk

an

bahwa

proses apoptosis terjadi melalui

j

a

l

u

r

yang

melibatkan p38, caspase-9, dan caspase-3. Diduga genistein

menurunkan apoptosis melalui penurunan aktivitas

p38

atau ketiganya,

p38 ca

s

pa

s

e

-

9,

dan

c

a

s

pase

-3

.

Peningkatan

aktivitas

p38

akan memicu sinyal

apoptosis melalui p

e

ni

n

gka

tan

fosforilasi faktor transkripsi p53

sehingga akan

meningkatkan aktivitas bax sebagai

proapotosis yang akan meningkatkan pengeluaran cytochrome c dari mitoko

n

dri

a

.

Cytochrome c akan berikatan dengan protein Apaf 1 sehingga akan menarik caspase-9

untuk membentuk apoptosome 30•36. Apoptosome selanjutnya akan mengaktifka.n caspase-3 sehingga akan memecah protein lain dan terjadi apoptosis (Gambar

4. _9).

Penurunan persentase gambaran sei apoptosis setelah pemberian genistein menunjukkan

te

rd

a

pa

t

peran antioksidan dalam menekan

a

pop

tos

is

melalui jalur

p38

_dan

caspase-3.

Dengan demikian p

a

d

a

pene

l

it

i

_a

n

ini dapat

disimpulkan

b

ahw

a

ti

n

gg

in

ya proses stress

oksidasi

p

a

d

a kondisi hipoksia menyebabkan meningkatnya apoptosis

s

e

l

.

P

e

ni

ngkat

an

apoptosis

set terjadi melalui jalur

yang melibatkan

p38 MAPK, caspase-9, dan

caspase-3.

Genistein sebagai antioksidan mampu menghambat peningkatan apoptosis dengan

dosis optimum 10

(35)

•

V. KES�PULAN DAN SARAN

V.l. Kesimpulan

Dari basil penelitian dapat disimpulkan

bahwa

genistein dapat meningkatkan

viabilitas MSCs secara signiflkan dan menurunkan derajad apoptosis MSCs

secara

signiflkan pada kondisi hipoksia seiring dengan meningkatnya dosis genistein. Terjadi

penurunan kadar p38MAPK, caspase-3" dan caspase-9 tetapi tidak signifikan. Hal

tersebut menun

j

ukkan bahwa genistein sampai dengan do sis

10 �mol/L bel urn efektif

menghambat p38MAPK, caspase-3 dan caspase-9.

V.2. Saran

Pcrlu

dilakukan penelitian yang lebih lanjut dengan menambah atau memperluas

variasi dosis genistein dan jalur lain yang menyebabkan apoptosis pada

MSCs

kondisi

hipokasia. Disamping perlu juga diketahui

_efek

penggunaan genistein pada terapi sel

punca MSCs secara invivo.

21

(36)

UCAPAN TERIMA KASm

Peneliti mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

.

1. Kepala beserta Staf Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan

Kementrian ·Kesehatan Republik Indonesia melalui program Risbin Iptekdok

yang telah menyediakan

dana penelitian.

2.

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Jember

yang telah

memberikan ijin

dan kemudahan dalam pelaksanaan penelitian.

3. Prof Dr. Fedik Abdul Rantam,

drh., yang telah

memberikan saran

_untuk

perbaikan penelitian.

4. Direktur

lTD

Unair atas fasilitasnya sehingga penelitian

1m dap

at

dilaksanakan.

5. Tim panel gizi atas berbagai saran dan masukan demi perbaikan penelitian.

6. Semua pihak yang telah membantu terselesaikannya penelitian ini, yang tidak

dapat kami sebutkan satu persatu.

(37)

DAFT AR PUSTAKA

1. Beltrami

AP,

Urbanek K, Kajstura

J, Yan

SM,

Finato

N,

Bussani

R,

Nadal-Ginard

B, Silvestri F, Leri A. Beltrami CA.

Anversa

P. 2001.

_{Evidence that}

human

cardiac

myocytes divide after myocardial infarction. N Engl J Med 344:

1750-1757.

2. _Bra

u

_n

w

_al

d

_E,

B

_ri

stow M.

2000. Congestive heart failure: fifty years

of

pr

o

gress. Circulation;

102:

IV 14-IV23.

3. Stamm C, Westphal B, Kleine HD, Petzsch M., Kittner C, Klinge

H,

Schumichen C,

Nienaber CA. Freund

M.,

Steinhoff G. 2003. Autologous bone-marrow stem-cell

tr

an

spla

n

t

atio

n

formyocardial regeneration. Lancet 361: 45-46.

4.

Katritsis DG, Sotiropoulou PA, Karvouni E, Ka�abinos

I,

Korovesis S, Perez SA,

Voridis EM, apamichailM. 2005. Transcoronary transplantation of autologous

mesenchymal stem cells and endothelial progenitors into

_infracted

human

myocardium. Catheter Cardiovasc Interv. 65:32 1-329.

5. Mark

FB, Adam

JE, Woo

YJ,

Timothy

JP, Lawrence

TB, Vasant

J,

Kevin

JM,

Timothy JG, Dennis ED, Sweeney

HL.

2006. Mesenchymal

stem cell

injection

after myocardial infarction improves myocardial compliance.

Am

J Physiol Heart

Circ Physiol 290:H2196-H2203.

6. Miyahara Y, Nagaya N, Kataoka M, Yanagawa

B,

Tanaka K, Hao H, Ishino K, Ishida H., Shimizu T, Kangawa K, Sano S, Okano T, Kitamura S, Mori H. 2006.

Monolayered mesenchymal stem cells repair scarred myocardium after myocardial infarction. Nat Med

12:459-465.

7. K

e

n

i

c

h

i

r

o

H,

Noritoshi

N,

Takashi

I,

Itoh

T,

Murakami S, Shimizu

Y, Taki W,

Miyatake

K,

Kangawa

K. 2005.

Adrenomedullin

enhances therapeutic potency of

mesenchymal stem cells

after e

x

p

e

r

i

me

n

tal

stroke in rats. Stroke 36:853-858.

8.

Tang

_YL,

Zhang

YC,

Qian,

Shen LP,

Ph

il

_l

i

p

s

MI.

2005.

Improved graft

mesenchymal stem

cell

survival in ischemic

heart

with a hypoxia-regulated

hemeoxygenase-1 vector. J Am Coli Cardiol 46: 1339-1350.

9.

Geng

Y

J

.

2003. Molecular mechanisms for cardiovascular

stem cell

apoptosis and

growth

in

the hearts with atherosclerotic coronary disease

and

ischemic heart

failure. Science, Ann NY Acad

1010:687-697.

10. Hamano K,

Li

TS, Kobayashi T, Hirata K, Yano

M.,

Kohno M, Matsuzaki M.

2002.

Therapeutic angiogenesis induced by local autologous bone marro

w

cell

implantation. Ann Thorac

Surg 73:1210-1215.

1 1 .

Toma C, Pittenger MF, Cahill KS, Byrne BJ, Kessler

PD. 2002. Human

mesenchymal stem cells differentiate to

a

cardiomyocyte phenotype in the adult

murine heart. Circulation 105: 93-98.

12. Wang J

-

S

,

Shum-Tim

D,

Galipeau

J,

et al. Marrow stromal cells for cellular

cardiomyoplasty: feasibility and potential clinical advantages.

_J

Thorac Cardiovasc

Surg.

2000; 120:999-1006.

13. Keira SM, Ferreira

LM,

Gragnani A, Campaner

AB.

2004. Experimental model

for

establishment of hypoxia in 75 cm2 culture flasks. Acta Cir Bras,

Vol

19 Special

Edition,

http://wvvw.scielo.br/acb.

23 t

(38)

14.

Zhu WQ, Chen

JH,

Cong

XF,

Hu

SS,

Chen

X. 2006. Hypoxia and serum

deprivation-induced apoptosis in mesenchymal stem cells. Stem Cells 24:416-425.

15. Maack C,

K

artes

T,

Kilter

H,

Scha .. fers

HJ, Nick

en

ig

G,

Bo

"hm M,

La

u

f

s U.

2003. Oxygen free radical release in human failing myocardium la aaaociated with increased activity of racl-GTPase and represents a target for statin treatment. Circulation 108:1 567-1574.

16. Xie J, Qian J, Yang J, Wang S, Freeman ME, lli, Yi Q. 2005. Critical roles of

Raf7MEK/ERK and

PI3K/AKT

signaling and inactivation of p38 MAP kinase in

the differentiation and

survival of monocyte-derived immature dendritic

cells. Exp

Hematol 33:564-572.

17. Wei H, Bowen R, Cai Q, et

_al,

1

₉

9 ₅

.

Antioxidant and antipromotional effects of the

soybean isoflavone genistein.

_{Proc Soc Exp Bioi Med.}

1995; 208:124-130.

18. Liu D, Homan L, Dillon

_J.

2004. Genistein Acutely Stimulates Nitric Oxide

Synthesis in Vascular Endothelial Cells by a Cyclic Adenosine 5'-Monophosphate

Dependent Mechanism . Endocrinology Vol. 145, No. 12 5532-5539.

19.

Min

JY,

L

i

a

o H, Wang JF,

Sullivan

MF, Ito

T,

and Morgan

JP. 2002. Gen

i

st

ein

Attenuates Postischemic Depressed Myocardial Function by Increasing

Myofilament Ca2+ Sensitivity in Rat Myocardium. Exp Bioi Med Vol. 227{8):632-638.