Vektor Dalam Terapi Gen Vektor Dalam Terapi Gen
1. Retro virus 1. Retro virus
Golongan virus yang
Golongan virus yang dapat membuat rantai gandapat membuat rantai ganda DNA da DNA dari genomnya dan disdari genomnya dan disatukanatukan dengan kromosom sel inangnya mis: HIV (human defisiensi virus)
dengan kromosom sel inangnya mis: HIV (human defisiensi virus) 2. Adeno virus
2. Adeno virus
Golongan virus dengan rantai DNA
Golongan virus dengan rantai DNA gandanya dapat menyebabkan infeksi pada salurangandanya dapat menyebabkan infeksi pada saluran pernapasan
pernapasan, saluran , saluran pencenaapencenaan dan n dan menimbulkan kematianmenimbulkan kematian mis: virus influenza
mis: virus influenza 3.Adeno-as
3.Adeno-assosiated sosiated virus.virus.
Virusnya kecil mempunyai single strandid DNA dan dapat memasukan material
Virusnya kecil mempunyai single strandid DNA dan dapat memasukan material genetik digenetik di tempat spesifik pada kromosom 19
tempat spesifik pada kromosom 19 4. Herpes simpleks
4. Herpes simpleks Golongan virus
Golongan virus dengan rantai gdengan rantai ganda DNA yang anda DNA yang menginfeksi semenginfeksi sebagian bagian dari sel sepedari sel seperti selrti sel neuron
neuron Retrovirus Retrovirus
Retrovirus adalah salah satu andalan pendekatan Terapi gen yang saat ini. Retrovirus Retrovirus adalah salah satu andalan pendekatan Terapi gen yang saat ini. Retrovirus rekombinan seperti virus murine leukemia Moloney memiliki kemampuan untuk rekombinan seperti virus murine leukemia Moloney memiliki kemampuan untuk mengintegrasikan ke dalam genom host dengan cara yang stabil. Mereka berisi transkriptase mengintegrasikan ke dalam genom host dengan cara yang stabil. Mereka berisi transkriptase yang memungkinkan integrasi ke host genom. Mereka telah digunakan dalam jumlah yang yang memungkinkan integrasi ke host genom. Mereka telah digunakan dalam jumlah yang disetujui FDA uji klinis seperti SCID-X 1 percobaan.
disetujui FDA uji klinis seperti SCID-X 1 percobaan.
Retroviral vektor dapat menjadi kompeten replikasi atau replikasi-cacat. Replikasi-cacat Retroviral vektor dapat menjadi kompeten replikasi atau replikasi-cacat. Replikasi-cacat vektor adalah pilihan yang paling umum dalam studi karena virus memiliki daerah coding vektor adalah pilihan yang paling umum dalam studi karena virus memiliki daerah coding untuk gen yang diperlukan untuk tambahan putaran virion replikasi dan kemasan yang untuk gen yang diperlukan untuk tambahan putaran virion replikasi dan kemasan yang digantikan dengan gen lain,
digantikan dengan gen lain, atau dihapus.atau dihapus. Virus ini mampu menginfeksi sel target
Virus ini mampu menginfeksi sel target mereka dan memberikan muatan virus mereka, tetapimereka dan memberikan muatan virus mereka, tetapi kemudian gagal untuk melanjutkan jalur lytic khas
kemudian gagal untuk melanjutkan jalur lytic khas yang mengarah ke sel Lisis dan kematian.yang mengarah ke sel Lisis dan kematian. Sebaliknya, kompeten replikasi virus vektor berisi semua gen yang diperlukan untuk sintesis Sebaliknya, kompeten replikasi virus vektor berisi semua gen yang diperlukan untuk sintesis virion, dan terus menyebarkan diri setelah infeksi t
virion, dan terus menyebarkan diri setelah infeksi terjadi.erjadi.
Karena genetika virus untuk vektor ini jauh lebih panjang, panjang dari gen dimasukkan Karena genetika virus untuk vektor ini jauh lebih panjang, panjang dari gen dimasukkan sebenarnya menarik terbatas dibandingkan dengan panjang mungkin insert untuk sebenarnya menarik terbatas dibandingkan dengan panjang mungkin insert untuk replikasi-cacat vektor.
cacat vektor.
Tergantung pada vektor virus, panjang maksimum khas memasukkan DNA
Tergantung pada vektor virus, panjang maksimum khas memasukkan DNA yang diizinkan diyang diizinkan di sebuah cacat replikasi virus vektor adalah biasanya sekitar 8-10 kB.
sebuah cacat replikasi virus vektor adalah biasanya sekitar 8-10 kB. Sementara ini membatasiSementara ini membatasi pengenalan banyak urutan genom, sebagian besar cDNA urutan
Kelemahan utama untuk menggunakan retrovirus seperti Moloney retrovirus melibatkan persyaratan untuk sel-sel membagi secara aktif untuk transduksi. Sebagai akibatnya, sel-sel seperti neuron sangat tahan terhadap infeksi dan transduksi oleh retrovirus.
Ada kekhawatiran bahwa mutagenesis insertional karena untuk integrasi ke genom host dapat mengakibatkan kanker atau leukemia.
Lentiviruses
Lentiviruses adalah sebuah subclass retrovirus. Mereka baru-baru ini telah diadaptasi sebagai gen pengiriman kendaraan (vektor) Terima kasih kepada kemampuan mereka untuk mengintegrasikan ke dalam genom non-membagi sel, yang merupakan fitur unik Lentiviruses sebagai retrovirus lain dapat menginfeksi hanya sel-sel pemisah.
Genetika virus dalam bentuk RNA sebaliknya-ditranskripsi ketika virus memasuki sel untuk menghasilkan DNA, yang kemudian dimasukkan ke dalam genom pada posisi acak oleh enzim integrase virus.
Vektor, yang sekarang disebut provirus, tetap di genom dan diteruskan ke keturunan sel ketika membagi. Situs integrasi ini tak terduga, yang dapat menimbulkan masalah.
Provirus dapat mengganggu fungsi gen selular dan mengakibatkan aktivasi dari onkogen, mempromosikan perkembangan kanker, yang menimbulkan keprihatinan untuk aplikasi mungkin lentiviruses dalam gen terapi.
Namun, penelitian telah menunjukkan bahwa lentivirus vektor memiliki kecenderungan untuk mengintegrasikan di tempat-tempat yang berpotensi menyebabkan kanker daripada gamma retroviral vektor.
Lebih khusus lagi, satu studi menemukan bahwa vektor lentiviral tidak menyebabkan peningkatan dalam insiden tumor atau awal awal tumor pada tikus ketegangan dengan insiden tumor jauh lebih tinggi.
Selain itu, uji klinis yang dimanfaatkan vektor lentiviral untuk memberikan gen terapi untuk pengobatan HIV mengalami peningkatan dalam peristiwa mutagenik atau oncologic.
Untuk alasan keamanan vektor lentiviral tidak pernah membawa gen yang diperlukan untuk replikasi mereka. Untuk menghasilkan lentivirus, beberapa plasmid transfected ke garis sel disebut kemasan, biasanya HEK 293.
Satu atau lebih plasmid, biasanya disebut sebagai kemasan plasmid, menyandikan protein virion, seperti capsid dan reverse transcriptase.
Plasmid lain berisi materi genetik yang disampaikan oleh vektor. Ini ditulis untuk menghasilkan genetika virus RNA tunggal dan ditandai oleh kehadiran urutan ψ (psi).
Urutan ini digunakan untuk paket genom ke virion. Adenoviruses
Sebagai lawan untuk lentiviruses, adenoviral DNA tidak mengintegrasikan ke genom dan tidak direplikasi semasa pembelahan.
Hal ini membatasi penggunaannya dalam penelitian dasar, meskipun vektor adenoviral kadang-kadang digunakan dalam eksperimen '' in vitro''. Aplikasi utama mereka berada di Terapi gen dan vaksinasi.
Karena manusia biasanya datang dalam kontak dengan adenoviruses, yang menyebabkan pernafasan, pencernaan dan mata infeksi, memicu respon imun yang cepat dengan konsekuensi yang berbahaya.
Untuk mengatasi masalah ini para ilmuwan sedang menyelidiki adenoviruses manusia yang tidak memiliki kekebalan.
ADO-terkait virus
ADO-terkait virus (AAV) adalah virus kecil yang menginfeksi manusia dan beberapa spesies primata lainnya. AAV tidak diketahui menyebabkan penyakit dan akibatnya virus menyebabkan respon imun yang sangat ringan. AAV dapat menginfeksi pemisah maupun non-membagi sel dan dapat memasukkan genom ke yang sel inang. Fitur ini membuat AAV calon yang sangat menarik untuk menciptakan virus vektor untuk terapi gen.
Zat-zat yang nonviral seperti Ormosil telah digunakan sebagai vektor DNA dan dapat memberikan banyak DNA sel-sel khusus ditargetkan pada hidup hewan. (Singkatan dari Ormosil '' Organik diubah silika atau silikat.)''
Adenovirus merupakan virus generasi pertama yang di gunakan dalam terapi gen dan sangat efektif sebagai vektor pembawa transgen.Virus lain yang dapat digunakan dalam terapi gen adalah retrovirus, adeno-associated viruses, virus herpes simplex dan lain-lainnya termasuk virus penyebab HIV. 2 jenis virus yang banyak digunakan sebagai vektor adalah
Ø Retrovirus
Materi genetik pada virus ini adalah dalam bentuk RNA, sebaliknya materi genetik pada sel-sel tubuh sasaran adalah dalam bentuk DNA. Ketika retrovirus menginfeksi sel-sel sasaran (host), selain memasukkan RNA-nya, ia juga akan memasukkan ensim reverse transcriptase dan integrase kedalam sel sasaran tersebut. RNA ini kemudian akan diubah menjadi DNA melalui proses reverse transcription menggunakan ensim reverse transcriptase. DNA kemudian akan ditransfer kedalam inti sel sasaran dan kemudian akan berintegrasi pada tempat tertentu di genom sel sasaran dengan bantuan ensim integrase. Setelah DNA yang telah diperbaiki ini terintegrasi pada tempat t ertentu di genom sel ssasaran maka dikatakan bahwa genom sel-sel sasaran (host) ini telah dimodifikasi. Salah satu masalah yang dapat terjadi pada terapi gen menggunakan retrovirus adalah ensim integrase dapat menginsersikan materi genetik virus pada tempat yang kurang sesuai misalnya pada bagian tengah gen-gen endogen pada host, sehingga gen endogen ini tidak dapat berfungsi, dikenal sebagai
insertional mutagenesis. Bila gen-gen virus ini berinsersi pada gen pengatur fungsi gen lainnya, maka proses pembelahan sel dapat tidak terkendali dan berubah menjadi sel kanker. Hal ini sekarang dapat diatasi dengan menggunakan ensim Zinc finger nucleases.5
kesemua sel yang terinfeksi dan turunanannya, tetapi kerugiannya dapat menyebabkan terjadinya mutasi genetik yang berbahaya selama t ahap pengintegrasian.
Ø Adenovirus
Ketika virus adenovirus meninginfeksi sebuah sel inang, molekul DNA virus tersebut akan dimasukkan kedalam sel inang tersebut. Materi genetik adenovirus tidak bersatu dengan materi genetik sel inang. Molekul DNA virus terletak bebas dalam inti sel dan proses
transkripsinya berlangsung secara sendiri. Molekul DNA virus tidak ikut berreplikasi ketika sel mengalami pembelahan sehingga sel-sel inang hasil pembelahan tidak mengandung DNA virus.
Akibatnya pada terapi gen menggunakan vektor adenovirus membutuhkan pemasukkan kembali gen-gen yang sudah dimodifikasi ke dalam populasi sel yang baru. Sebaliknya keadaan ini akan mencegah terjadinya kanker. Gendicine adalah adenovirus yang telah
mengandung gen p53 yang digunakan pada terapi gen untuk mengobati penyakit kanker pada kepala dan leher. Gendicine sudah diizinkan oleh FDA China untuk di gunakan pada manusia pada tahun 2003, sementara itu FDA Amerika Serikat telah menyetujui advexin, suatu vektor yang serupa dengan Gendicine untuk digunakan di Amerika serikat pada tahun 2008.
F. Transfer genmenggunakan cara non virus
Disamping menggunakan cara tranfer gen yang diperantarai oleh virus (virus- mediated gene-delivery systems, ada beberapa metoda lain tanpa menggunakan virus. Metoda non virus ini mempunyai keuntungan yaitu dapat diproduksi dalam j umlah besar dan immunogenisitas pada sl inang yang rendah. Beberapa metoda non virus yang dapat digunakan adalah : 1. Naked DNA
Metoda ini merupakan metoda transfeksi non virus yang sangat sederhana. Penelitian klinik dengan cara menyuntikan naked DNA secara intramuskular menunjukkan sebagian hasil yang sukses dan sebagian lagi mengalami kegagalan. Ekspresi gen pada metoda transfeksi ini sangat rendah dibandingkan dengan cara transfeksi lainnya.
2. Oligonukleotida
Oligonukleotida sintetik digunakan untuk menginaktifkan gen-gen yang terlibat dalam proses penyakit. Beberapa metoda yang dapat digunakan antara lain adalah :
Ø Menggunakan antisense yang spesifik untuk gen sasasaran yang akan mengganggu proses transkripsi gen sasaran yang rusak.
Ø Menggunakan oligonukleotida rantai ganda (double strand oligonucleotide) yang akan mengikat faktor-faktor transkripsi yang diperlukan untuk regulasi promoter gen sasaran. 3. Lipoplexes and polyplexes
Untuk meningkatkan kwalitas pengangkutan DNA yang baru ke dalam sel, DNA tersebut harus dilindungi dari kerusakan dan pemasukkannya kedalam sel harus difasilitasi. Untuk memfasilitasi pemasukan gen ke dalam sel dapat digunakan molekul lipid yang dikenal sebagai lipoplexes dan polyplexes yang dirancang untuk melindungi DNA dari proses
degradasi selama proses transfeksi. Molekul lipid ini digunakan untuk membungkus plasmid yang mengandung DNA dalam bentuk seperti micelle atau liposome.
Lipoplexes atau polyplexes yang telah mengandung DNA dikenal sebagai lipoplex. Lipoplex akan berinteraksi dengan membran sel dan masuk kedalam secara endositosis. Endosome yang mengandung lipoplex ini kemudian akan lisis dan transgen yang ada di dalamnya akan dikeluarkan ke dalam sitoplasma sel untu kemudian akan masuk ke dalam inti sel
