REGULASI EKSPRESI GEN PADA BAKTERIOFAGE DAN VIRUS

REGULASI EKSPRESI GEN PADA

BAKTERIOFAGE DAN VIRUS

• Fage/virus Æ memanfaatkan perangkat sel inang untuk sintesis DNA/protein

• Strategi memanfaatkan sel inang Æ mensintesis 4 makromolekul:

1. RNA polimerase baru Æ khusus mentranskripsi kromosom virus

2. Subunit RNA pol baru Æ berasosiasi dengan polimerase sel inang, hanya mentranskripsi kromosom virus

3. Protein represor Æ menghambat fungsi sel inang 4. Protein aktivator Æ mengatur ekspresi gen virus

Regulasi pada fage T7

2 kategori gen:

ƒGen awal (

early genes

): Klas I Æ diekspresikan pertama ƒGen lambat (

late genes

):

Klas II dan Klas III Æ

diekspresikan bila produk gen awal tersedia

Regulasi pada fage T7

3 kelompok gen

1.Produk gen awal Æ

menghambat sintesis RNA inang

2.Produk gen metabolisme DNA (enzim untuk replikasi kromosom virus & nuklease untuk degradasi kromosom sel inang Æ nt bebas)

3.Produk gen akhir (mantel, ekor & protein pembungkus kromosom virus). Produk terakhir: lisozim Æ lisis sel inang Æ + 250 fage

Ekspresi T7

1. Gen-gen klas I diekspresikan oleh RNA pol sel inang Æ transkrip panjang Æ dipotong oleh RNaseIII dari sel inang Æ 5 mol mRNA Æ translasi oleh ribosom dari sel inang

Produk:

• antirestriksi (0.3) Æ melindungi kromosom virus dari degradasi oleh enzim restriksi sel inang

• protein kinase (0.7) Æ modifikasi RNA pol sel inang, membatasi ekspresi gen klas I dan menjamin ekspresi gen klas II dan III

• RNA polimerase T7 (1) Æ transkripsi klas II dan III (80% genom virus T7)

• Ligase (1.3) Æ menyambung fragmen DNA

2. Gen-gen klas II diekspresikan oleh RNA pol T7 -replikasi DNA virus

3. Gen-gen klas III

Regulasi pada SPO1

• SPO1: virus besar, menginfeksi

Bacillus subtilis

• 3 kelompok gen:

early

,

middle

,

late

1. Gen awal Æ RNA pol sel inang (menghasilkan produk gen 28)

2. Gen tengah Æ RNA pol sel Inang yang mengandung

produk gen 28 pada posisi faktor σ

–Faktor σ mengenali –35: TTGACA dan -10: TATAAT

pada gen awal SPO1

–Produk gen 28 mengenali –35: AGGAGA dan -10: TTTTTT pada gen tengah SPO1

–Menghasilkan produk gen 33 dan 34

3. Gen akhir Æ RNA pol sel inang yang mengandung produk gen 33 dan 34

Regulasi pada SPO1 (lanjutan)

Transisi ekspresi gen awal ke gen tengah dan dari gen tengah ke gen akhir melibatkan modifikasi RNA

polimerase (melalui penggantian salah satu subunitnya, yaitu posisi faktor σ)

Regulasi pada

λ

Setelah menginfeksi

E.coli

, λ menempuh:

1.Siklus litik Æ sel inang lisis Æ 100 fage

2.Siklus lisogenik Æ kromosom fage menyisip kedalam

Siklus litik atau lisogenik?

Protein-protein regulator yang disandi λ

Regulasi selama siklus litik λ

Fase litik meliputi 3 fase: • Fase

Immediate-early

• Fase

Delayed-early

• Fase

Late

Fase

Immediate-early

Kromosom λ masuk, transkripsi

oleh RNA pol sel inang. Inisiasi transkripsi dimulai dari P_R

(transkripsi ke kanan) Æ gen

cro

dan P_L (transkripsi ke kiri) Æ gen

N

. Protein N diperlukan untuk

transisi dari

immediate-early

ke

delayed early

(seperti produk

Regulasi selama siklus litik λ

Fase

Delayed-early

Dimulai saat protein N

menstimulasi transkripsi gen-gen

delayed- early

, mengekspresikan

gen

cII

dan

cIII

(relevan untuk

siklus lisogenik), gen

O, P

(untuk

replikasi kromosom λ) dan

Q

(untuk transisi dari delayed-early

ke late, seperti produk

gen 33

dan

34

dari SPO1)

Fase

Late

Dimulai saat protein Q

menstimulasi transkripsi gen-gen

late

spt gen penyandi kepala,

Transkripsi gen-gen

immediate-early

RNA polimerase sel inang:

ƒKanan: P_R Æ

cro

Transkripsi

delayed-early

RNA polimerase sel inang (faktor δ diganti protein N)

ƒKanan: P_R Æ

cII, O, P, Q

Keadaan lisogeni

• Siklus lisogeni memerlukan:

1. Protein represor λ Æ menghambat ekspresi gen-gen untuk siklus lisis

– Disandi oleh gen

cI

di bawah kontrol P_RE

(

promoter for repressor establishment

)

2. Protein Int λ Æ integrasi ke kromosom

E. coli

– Disandi oleh gen

Int

di bawah promoter P_INT

3. P_RE dan P_INT: sekuensi mirip, memerlukan protein cII

dan cIII supaya RNA polimerase mengenalinya Æ cII

Protein cII dan cIII

• Protein cII Æ protein regulator (aktivator) seperti CAP

Æ mengikat daerah –35 dari P_RE dan P_INT Æ

menstimulasi RNA pol menempel pada promoter sehingga kedua operon ditranskripsikan

• Protein cIII Æ menonaktifkan protease yang dapat mendegradasi protein cII (Æ menjaga stabilitas cII) • CII dan cIII memerlukan protein N

Mekanisme Lisogeni

• Represor λ Æ mengikat operator (O_L dan O_R),

mencegah transkripsi gen-gen yang dikontrol P_R dan P_L yaitu: gen N dan cro

• N dan CRO tidak stabil Æ konsentrasi di dalam sel turun (rendah)

• N rendah Æ menghambat transkripsi gen-gen

delayed-early

yang tergantung N, yaitu: O, P, Q

• Q rendah/tidak ada Æ mencegah ekspresi gen-gen dan

late

Æ tidak terjadi siklus lisis

• Protein Int Æ perantara rekombinasi situs spesifik

antara attP dan attB sehingga kromosom λ terintegrasi kedalam kromosom

E. coli

Strategi λ dalam memilih siklus

1. Menghasilkan protein-protein N dan Q, yang

berinteraksi dengan RNA pol dan mempengaruhi pembacaan terminator Æ lisis

2. Menghasilkan protein aktivator cII yang mengikat

daerah promoter dan memudahkan RNA pol menempel pada promoter Æ lisogeni

3. Menghasilkan represor Æ mengikat operator Æ lisogeni

Interaksi represor-operator

• Mutasi gen cI Æ plak jernih (WTÆ plak keruh: lisis & lisogeni)

• Mutasi cII- dan cIII- Æ plak jernih

• Represor: stabil, 26 kDa, berinteraksi dengan operator sebagai dimer

• Mutan operator (O_L- _{dan O}

R-) Æ virulen (represor normal

tapi tidak dapat mengikat operator Æ tidak dapat

• Operator mempunyai 3 situs penempelan (O_L1, 2, 3; O_R1, 2, 3)

• Operator tumpang tindih dengan promoter

• Setiap situs penempelan = 17 nt, dipisahkan dengan yang lain oleh daerah kaya AT

• Setiap mutasi pada situs penempelan Æ virulen

= mutasi Æ virulen Operator

Lisis-Lisogeni

• Lisis/lisogeni ditentukan oleh 6 protein regulator yang berkompetisi, yaitu: N, Q, cII, cIII, cI, dan cro

• Protein cro (

control of repressor and other things

)

– paling menentukan terjadinya siklus lisis atau lisogeni

– diekspresikan segera setelah infeksi λ

– tidak memerlukan protein N

– ada sebelum produk cI (represor), cII dan cIII ada di dalam sel

– represor, dapat mengikat O_R dan O_L seperti represor

cI (tapi kurang efisien dan kurang stabil) Æ tidak dapat menghambat secara penuh ekspresi gen-gen

N

dan

cIII

(dibawah P_L) dan

cro

,

cII

,

O

,

P

, dan

Q

(di bawah P_R)

Mekanisme Lisis-Lisogeni

• Lisogeni memerlukan ekspresi gen

cI

Æ perlu cII dan

cIII untuk mengaktifkan P_RE

• Lisis memerlukan ekspresi seluruh gen Æ perlu antiterminator N dan Q

• Transkripsi

cI

lebih sensitif terhadap penurunan cII/cIII

daripada transkripsi untuk gen-gen yang terlibat dalam siklus lisis terhadap penurunan N dan Q

Æ jika cro banyak Æ menempel pada O_R dan O_L Æ cII

dan cIII rendah Æ cI tidak diekspresikan Æ ekspresi seluruh gen λ Æ siklus lisis

Æ jika cro sedikit Æ tidak kuat menempel pada O_R dan

O_L Æ ekspresi cII dan cIII normal Æ cI

diekspresikan Æ siklus lisogeni

– tingkat produksi cro Æ temperatur, keadaan

metabolit sel inang, genotipe sel inang, genotipe fage

Keadaan E. coli lisogeni

• Bakteri lisogenik untuk λ (

E. coli

(λ)) kebal terhadap superinfeksi (+λ)

•

E. coli

(λ) + λ Æ DNA λ masuk tapi tidak terjadi lisis pada bakteri

• Profage mensintesis represor cI pada tingkat rendah Æ

menempel pada P_RO_R dan P_LO_L pada profage (menjaga

kondisi lisogeni) dan P_RO_R dan P_LO_L pada λ yang masuk

(mencegah replikasi dan integrasi kedalam kromosom

E.

coli

krn situs attB sudah ditempati) Æ kromosom λ

berada di sitosol Æ jumlahnya berkurang (hilang) bila

E.

• Transkripsi represor pada tingkat rendah di

E. coli

(λ) dikontrol oleh P_RM (

promoter for repressor maintenance

)

yang tidak memerlukan cII dan cIII (beda dengan P_RE)

• Transkripsi dari PRM dikontrol oleh protein cI:

Jika represor cI rendah Æ P_RM dirangsang Æ transkripsi

cI

Jika represor cI tinggi Æ transkripsi dari P_RM dihambat

Induksi lisis dari keadaan profage

• Lisis terjadi karena protein represor cI tidak dapat

menghambat ekspresi operon dari profage λ

• Kehilangan secara spontan profage λ dari kromosom

1. Induksi zigotik

• Sel donor lisogenik Hfr x sel resipien non lisogenik

– Jika kromosom yang mengandung profage masuk ke sel resipien Æ tidak menemui protein represor Æ transkripsi dari P_RO_R dan P_LO_L Æ siklus lisis

– Tidak terjadi lisis jika sel resipien adalah

E. coli

(λ)

2. Mutasi pada cI

• Mutan cI857 Æ sintesis protein represor thermolabil (stabil pada 30o_{C, tidak aktif pada 42}o_C)

3. Perlakuan bakteri lisogenik yang dapat

merusak DNA (dengan irradiasi UV, mitomisin, sinar X)

• Mekanisme: perbaikan DNA dengan sistem SOS

• Bila DNA rusak dan tidak dapat diperbaiki dengan replikasi,

E. coli

mensintesis protein RecA Æ

memudahkan sintesis enzim SOS termasuk untuk replikasi tanpa DNA cetakan. RecA adalah protease yang dapat merusak represor LexA (menekan enzim

sistem perbaikan kesalahan), dan represor λ dalam

E.

coli

(λ).

• Jika DNA rusak Æ sinyal untuk mensintesis protein

RecA Æ merusak represor λ Æ profage terinduksi

Regulasi SV40

Produk gen

early

• Antigen t (15kD) • Antigen T (96 kD)

Æ Transkrip sama, beda

splicing

Produk gen

late

• Protein kapsid (VP1, VP2,

VP3) Æ beda

splicing

– mRNA late Æ

splicing

: • 16S mRNA Æ VP1

• 19S mRNA: •VP2

•VP3

Æ Krn 2 kodon AUG

Arah transkripsi gen-gen early berbeda dengan gen-gen late

Regulasi sintesis protein SV40

• Infeksi (8-10 jam) Æ gen

early

(gen A penyandi

antigen T) ditranskripsikan oleh RNA pol dan ditranslasikan oleh ribosom sel inang

• Mutan tsA (antigen T thermolabile) Æ tidak dapat memulai replikasi kromosom virus & tidak dapat memulai transkripsi gen-gen late untuk protein kapsid virus

Antigen T Æ protein pengatur early yang esensial

Promoter early (EI dan EII) dekat dengan ORI dan gen early A

Situs penempelan antigen T (I, II, III) bebas Æ transkripsi oleh

RNA pol dari EI

Melekatnya antigen T (tetramer) pada situs I Æ Inisiasi transkripsi dari situs EII

Penempelan antigen T pada situs II Æ transkripsi gen A berhenti Æ ekspresi gen-gen late

Kromosom SV40 menginfeksi sel inang:

•RNA pol memilih promoter EI untuk memulai transkripsi genA Æ sintesis antigen T

•Akumulasi antigen T (tetramer) Æ mengikat situs I Æ inisiasi transkripsi dari EI dihambat, sehingga RNA pol

menempel pada promoter EII untuk melakukan transkripsi antigen T Æ jumlah antigen T banyak Æ mengikat semua situs I, dan II Æ transkripsi gen early berhenti, dan

replikasi DNA SV40 dan transkripsi gen-gen

late

dimulai Regulasi SV40

Kenapa terjadi early/late?

• Promoter EI dan EII jauh lebih kuat daripada promoter

pada gen-gen

late

sehingga transkripsi oleh RNA pol

pada gen A sangat intensif Æ produk antigen T banyak

• Antigen T menghambat ekspresi gen-gen

early

,

sehingga RNA pol memulai ekspresi gen-gen late

‰Sintesis antigen T Æ regulasi autogenous (~ represor λ

~ trp)

‰Mutan tsA Æ antigen T thermolabile didegradasi (situs I dan II bebas) Æ stimulasi 15x transkripsi gen early Æ overproduksi protein mutan T