REGULASI EKSPRESI GEN PADA
BAKTERI OFAGE DAN VI RUS
• Fage/ virus
Æ
memanfaatkan perangkat sel inang untuk sintesis DNA/ protein• Strategi memanfaatkan sel inang
Æ
mensintesis 4 makromolekul:1. RNA polimerase baru
Æ
khusus mentranskripsi kromosom virus2. Subunit RNA pol baru
Æ
berasosiasi dengan polimerase sel inang, hanya mentranskripsi kromosom virusRegulasi pada fage T7
2 kategori gen:
Gen awal (
early genes
): Klas IÆ
diekspresikan pertamaGen lambat (
late genes
):Klas I I dan Klas I I I Æ
Regulasi pada fage T7
3 kelompok gen
1. Produk gen awal
Æ
menghambat sintesis RNA inang
2. Produk gen metabolisme DNA (enzim untuk replikasi kromosom virus & nuklease untuk degradasi kromosom sel inang
Æ
nt bebas)Ekspresi T7
1. Gen-gen klas I diekspresikan oleh RNA pol sel inang
Æ
transkrip panjangÆ
dipotong oleh RNaseI I I dari sel inangÆ
5 mol mRNAÆ
translasi oleh ribosom dari sel inangProduk:
• antirestriksi (0.3)
Æ
melindungi kromosom virus dari degradasi oleh enzim restriksi sel inang• protein kinase (0.7)
Æ
modifikasi RNA pol sel inang, membatasi ekspresi gen klas I dan menjamin ekspresi gen klas I I dan I I I• RNA polimerase T7 (1)
Æ
transkripsi klas I I dan I I I (80% genom virus T7)• Ligase (1.3)
Æ
menyambung fragmen DNA 2. Gen-gen klas I I diekspresikan oleh RNA pol T7-replikasi DNA virus 3. Gen-gen klas I I I
Suharsono
.2005. BTK505. IPB
S
ik
lu
s
fa
g
e
T
Regulasi pada SPO1
• SPO1: virus besar, menginfeksi
Bacillus subtilis
• 3 kelompok gen:
early
,middle
,late
1. Gen awal
Æ
RNA pol sel inang (menghasilkan produk gen 28)2. Gen tengah
Æ
RNA pol sel I nang yang mengandung produk gen 28 pada posisi faktorσ
–Faktor
σ
mengenali –35: TTGACA dan -10: TATAAT pada gen awal SPO1–Produk gen 28 mengenali –35: AGGAGA dan -10: TTTTTT pada gen tengah SPO1
–Menghasilkan produk gen 33 dan 34
Regulasi pada SPO1 (lanjutan)
Transisi ekspresi gen awal ke gen tengah dan dari gen tengah ke gen akhir melibatkan modifikasi RNA
Regulasi pada
λ
Setelah menginfeksi
E.coli
,λ
menempuh: 1. Siklus litikÆ
sel inang lisisÆ
100 fageSiklus litik atau lisogenik?
Regulasi selama siklus litik
λ
Fase litik meliputi 3 fase: • Fase
I mmediate-early
• Fase
Delayed-early
• Fase
Late
Fase
I mmediate-early
Kromosom
λ
masuk, transkripsi oleh RNA pol sel inang. I nisiasi transkripsi dimulai dari PR(transkripsi ke kanan)
Æ
gencro
dan PL (transkripsi ke kiri) Æ gen
N
. Protein N diperlukan untuk transisi dariimmediate-early
kedelayed early
(seperti produkRegulasi selama siklus litik
λ
Fase
Delayed-early
Dimulai saat protein N
menstimulasi transkripsi gen-gen
delayed- early
, mengekspresikan gencI I
dancI I I
(relevan untuk siklus lisogenik), genO, P
(untuk replikasi kromosomλ
) danQ
(untuk transisi dari delayed-early ke late, seperti produk
gen 33
dan
34
dari SPO1)Fase
Late
Dimulai saat protein Q
menstimulasi transkripsi gen-gen
Transkripsi gen-gen
immediate-early
RNA polimerase sel inang:
Kanan: P
RÆ
cro
Transkripsi
delayed-early
RNA polimerase sel inang (faktor
δ
diganti protein N)Kanan: P
RÆ
cI I , O, P, Q
Keadaan lisogeni
• Siklus lisogeni memerlukan:
1. Protein represor
λ
Æ
menghambat ekspresi gen-gen untuk siklus lisis– Disandi oleh gen
cI
di bawah kontrol PRE (promoter for repressor establishment
)2. Protein I nt
λ
Æ
integrasi ke kromosomE. coli
– Disandi oleh gen
I nt
di bawah promoter PI NTProtein cI I dan cI I I
• Protein cI I
Æ
protein regulator (aktivator) seperti CAPÆ
mengikat daerah –35 dari PRE dan PI NTÆ
menstimulasi RNA pol menempel pada promoter sehingga kedua operon ditranskripsikan
Mekanisme Lisogeni
• Represor
λ
Æ
mengikat operator (OL dan OR),mencegah transkripsi gen-gen yang dikontrol PR dan PL yaitu: gen N dan cro
• N dan CRO tidak stabil
Æ
konsentrasi di dalam sel turun (rendah)• N rendah
Æ
menghambat transkripsi gen-gendelayed-early
yang tergantung N, yaitu: O, P, Q• Q rendah/ tidak ada
Æ
mencegah ekspresi gen-gen danlate
Æ
tidak terjadi siklus lisis• Protein I nt
Æ
perantara rekombinasi situs spesifikStrategi
λ
dalam memilih siklus
1. Menghasilkan protein-protein N dan Q, yang
berinteraksi dengan RNA pol dan mempengaruhi pembacaan terminator
Æ
lisis2. Menghasilkan protein aktivator cI I yang mengikat
daerah promoter dan memudahkan RNA pol menempel pada promoter
Æ
lisogeniI nteraksi represor- operator
• Mutasi gen cI
Æ
plak jernih (WTÆ plak keruh: lisis & lisogeni)• Mutasi cI I - dan cI I I -
Æ
plak jernih• Represor: stabil, 26 kDa, berinteraksi dengan operator sebagai dimer
• Mutan operator (OL- dan OR-)
Æ
virulen (represor normal tapi tidak dapat mengikat operatorÆ
tidak dapat• Operator mempunyai 3 situs penempelan (OL1, 2, 3; OR1, 2, 3)
• Operator tumpang tindih dengan promoter
• Setiap situs penempelan = 17 nt, dipisahkan dengan yang lain oleh daerah kaya AT
• Setiap mutasi pada situs penempelan
Æ
virulen= mutasi Æ virulen
Lisis- Lisogeni
• Lisis/ lisogeni ditentukan oleh 6 protein regulator yang berkompetisi, yaitu: N, Q, cI I , cI I I , cI , dan cro
•
Protein cro
(control of repressor and other things
) – paling menentukan terjadinya siklus lisis ataulisogeni
– diekspresikan segera setelah infeksi
λ
– tidak memerlukan protein N– ada sebelum produk cI (represor), cI I dan cI I I ada di dalam sel
– represor, dapat mengikat OR dan OL seperti represor cI (tapi kurang efisien dan kurang stabil) Æ tidak dapat menghambat secara penuh ekspresi gen-gen
Mekanisme Lisis- Lisogeni
• Lisogeni memerlukan ekspresi gen
cI
Æ
perlu cI I dan cI I I untuk mengaktifkan PRE• Lisis memerlukan ekspresi seluruh gen
Æ
perlu antiterminator N dan Q• Transkripsi
cI
lebih sensitif terhadap penurunan cI I / cI I I daripada transkripsi untuk gen-gen yang terlibat dalam siklus lisis terhadap penurunan N dan QÆ
jika cro banyakÆ
menempel pada OR dan OLÆ
cI I dan cI I I rendahÆ
cI tidak diekspresikanÆ
ekspresi seluruh genλ
Æ
siklus lisisÆ
jika cro sedikitÆ
tidak kuat menempel pada OR dan OLÆ
ekspresi cI I dan cI I I normalÆ
cIdiekspresikan
Æ
siklus lisogeni– tingkat produksi cro
Æ
temperatur, keadaanKeadaan
E. coli
lisogeni
• Bakteri lisogenik untuk
λ
(E. coli
(λ
)) kebal terhadap superinfeksi (+λ
)•
E. coli
(λ
) +λ
Æ
DNAλ
masuk tapi tidak terjadi lisis pada bakteri• Profage mensintesis represor cI pada tingkat rendah
Æ
menempel pada PROR dan PLOL pada profage (menjaga kondisi lisogeni) dan PROR dan PLOL padaλ
yang masuk (mencegah replikasi dan integrasi kedalam kromosomE.
coli
krn situs attB sudah ditempati)Æ
kromosomλ
• Transkripsi represor pada tingkat rendah di
E. coli
(λ
) dikontrol oleh PRM (promoter for repressor maintenance
) yang tidak memerlukan cI I dan cI I I (beda dengan PRE) • Transkripsi dari PRM dikontrol oleh protein cI :Jika represor cI rendah
Æ
PRM dirangsangÆ
transkripsi cII nduksi lisis dari keadaan profage
• Lisis terjadi karena protein represor cI tidak dapat menghambat ekspresi operon dari profage
λ
• Kehilangan secara spontan profage
λ
dari kromosom1. I nduksi zigotik
• Sel donor lisogenik Hfr x sel resipien non lisogenik
– Jika kromosom yang mengandung profage masuk ke sel resipien
Æ
tidak menemui protein represorÆ
transkripsi dari PROR dan PLOLÆ
siklus lisis
– Tidak terjadi lisis jika sel resipien adalah
E. coli
2. Mutasi pada cI
• Mutan cI 857
Æ
sintesis protein represor thermolabil (stabil pada 30oC, tidak aktif pada 42oC)3. Perlakuan bakteri lisogenik yang dapat
merusak DNA ( dengan irradiasi UV, mitomisin,
sinar X)
• Mekanisme: perbaikan DNA dengan sistem SOS
• Bila DNA rusak dan tidak dapat diperbaiki dengan replikasi,
E. coli
mensintesis protein RecAÆ
memudahkan sintesis enzim SOS termasuk untuk replikasi tanpa DNA cetakan. RecA adalah protease yang dapat merusak represor LexA (menekan enzim sistem perbaikan kesalahan), dan represor
λ
dalamE.
coli
(λ
).Regulasi SV40
Produk gen
early
• Antigen t (15kD) • Antigen T (96 kD)
Æ
Transkrip sama, bedasplicing
Produk gen
late
• Protein kapsid (VP1, VP2, VP3)
Æ
bedasplicing
– mRNA late
Æ
splicing
:Regulasi sintesis protein SV40
• I nfeksi (8-10 jam)
Æ
genearly
(gen A penyandi antigen T) ditranskripsikan oleh RNA pol danditranslasikan oleh ribosom sel inang
• Mutan tsA (antigen T thermolabile)
Æ
tidak dapat memulai replikasi kromosom virus & tidak dapat memulai transkripsi gen-gen late untuk protein kapsid virusPromoter early (EI dan EII) dekat dengan ORI dan gen early A
Situs penempelan antigen T (I, II, III) bebas Æ transkripsi oleh
RNA pol dari EI
Melekatnya antigen T (tetramer) pada situs I Æ Inisiasi transkripsi dari situs EII
Penempelan antigen T pada situs II Æ transkripsi gen A berhenti Æ ekspresi gen-gen late
Kromosom SV40 menginfeksi sel inang:
• RNA pol memilih promoter EI untuk memulai transkripsi genA
Æ
sintesis antigen T• Akumulasi antigen T (tetramer)
Æ
mengikat situs IÆ
inisiasi transkripsi dari EI dihambat, sehingga RNA polmenempel pada promoter EI I untuk melakukan transkripsi antigen T Æ jumlah antigen T banyak
Æ
mengikat semua situs I , dan I I Æ transkripsi gen early berhenti, danreplikasi DNA SV40 dan transkripsi gen-gen
late
dimulaiKenapa terjadi early/ late?
• Promoter EI dan EI I jauh lebih kuat daripada promoter pada gen-gen
late
sehingga transkripsi oleh RNA pol pada gen A sangat intensifÆ
produk antigen T banyak • Antigen T menghambat ekspresi gen-genearly
,sehingga RNA pol memulai ekspresi gen-gen late