Laporan Penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN
OLEH :
RAISSYA ARMILLA
11141030000012
PROGRAM STUDI KEDOKTERAN DAN PROFESI DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
iv
KATA PENGANTAR
Assalamualaikum Wr. Wb
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan nikmat yang telah diberikan sehingga penulis dapat belajar higga tepat pada waktunya penulis harus menuliskan laporan penelitian ini. Penulis menyadari, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak maka penelitian ini tidak akan pernah terselesaikan. Oleh karena itu penulis mengucapkan terima kasih:
1. Kepada Prof. Dr. H. Arif Sumantri, SKM, M.Kes, Prof. Dr. dr. Sardjana, Sp.OG (K), SH, Yardi, PhD, Apt, Fase Badriah, SKM, M.Kes, Ph.D selaku Dekan dan Wakil Dekan FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Kepada dr. Nouval Shahab, SpU, Ph.D, FICS, FACS selaku Ketua Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menggali ilmu di PSKPD FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 3. Kepada Bapak Chris Adhiyanto, S.Si, M.Biomed, PhD selaku pembimbing 1
yang telah mempercayai untuk bergabung dalam penelitian Beliau, serta tak pernah lelah untuk mencurahkan waktu, tenaga, semangat, dan ilmunya untuk berbagi bersama penulis dan timnya. Serta, selaku penanggung jawab modul riset yang turut memupuk semangat penulis untuk menyelesaikan penelitian ini tepat pada waktunya dan pembimbing akademik peneliti.
4. Kepada dr. Yanti Susianti SpA(K) selaku pembimbing 2 yang turut mencurahkan waktu, tenaga, semangat, dan ilmunya serta tak pernah lelah untuk mengoreksi laporan penelitian ini.
5. Kepada dr. Hari Hendarto, Sp.PD-KEMD, PhD, FINASIM selaku penguji 1 dan Ibu Dr. Zeti Harriyati, S.Si, M.Biomed selaku penguji 2 yang telah menyempatkan waktunya untuk menguji pada ujian skripsi.
6. Kepada dua orang tercinta, orang tua saya, Arif Sumantri dan Almarhumah Jamilla Upik Noras yang mungkin tidak dapat melihat saya lagi dalam menyelesaikan skripsi ini, namun saya berterima kasih atas limpahan kasih sayang dan pengorbanan yang tak dapat terbalaskan oleh apapun. Terimakasih
v
banyak atas doa yang senantiasa mengiringi langkah putrimu, atas perjuangan yang tak kenal lelah selama mencari responden satu per satu, dan atas kesabaran yang telah mengajarkan putrimu banyak hal.
7. Kepada kakak tersayang, dr. Arifah Shabrina, terimakasih atas doa dan dukunganmu, semoga kelak peneliti bisa mengikuti langkahnya sebagai dokter muslim.
8. Kepada dr. Siti Nur Aisyah Jauharoh, Ph.D terimakasih atas perannya yang turut serta memberikan dukungan dalam menyelesaikan laporan ini.
9. Kepada Nenek tersayang, R. Aisyah dan Hj. Satiti Ruslan Atmowiryo yang senantiasa mengiringi langkah cucunda dengan doa hingga penulis kelak akan menjadi seorang dokter.
10. Kepada saudara-saudara: Atha, Rahma, dan Zulfa, serta Pakde Uun dan Cik Salma. Terimakasih atas doanya dan dukungan yang diberikan kepada penulis. 11. Kepada saudara-saudara yang ada di Jawa dan Sumatera yang mungkin tidak
dapat disebutkan satu per satu .
12. Kepada Ajeng Ristia yang telah senantiasa menemani penulis untuk menyusun laporan ini, serta suka duka bersama membaca hasil sequence DNA.
13. Teman-teman satu kelompok penelitian: Ajeng Ristia, Nurul Fathimah, M. Rizki Ramadhan. Terimakasih atas kerjasama dimulai dari tahun 2014 setelah modul riset tingkat 1 hingga sekarang yang luar biasa selama melakukan penelitian dan menyusun laporan penelitian. Tidak pernah mengenal lelah dalam kegagalan membaca hasil PCR dan Elfor. Kegagalan kami adalah canda tawa dan pembelajaran yang berharga untuk kami.Tiga tahun sudah kita berjalan bersama, terhitung cukup lama namun berbuah hasil yang menyenangkan.
14. Sahabat-sahabat yang turut mewarnai hari-hari selama masa kuliah; Putri Rahma Azizah, Desy Islamiati, Amalina Fitrasari, Selvia Oktaviani A, Harningtyas Alifin Jasmin, Nida Rania, dan Sherly Trisna. Terimakasih untuk selalu ada saat suka dan duka. Terimakasih untuk tak pernah lelah untuk mengingatkan.
15. Sahabat yang setia menemani saat down ataupun saat hampir menyerah untuk melanjutkan penelitian: Witha Novialy dan Putri Rahma Ajizah. Tawa dan
vi
semangat kalian tidak pernah terlupakan oleh penulis untuk melanjutkan penelitian hingga tuntas, dengan kalian penulis merasakan artinya persahabatan. Terimakasih Pujah dan Witha.
Penulis menyadari bahwa laporan penelitian ini masih jauh dari kata sempurna. Oleh karena itu saran dan kritik dari berbagai pihak sangat penulis harapkan. Demikian laporan penelitian ini penulis susun, semoga bermanfaat bagi perkembangan ilmu kedokteran di Indonesia. Aamiin.
Wassalamu’alaikum Wr. Wb
Ciputat, 16 Juni 2017
vii ABSTRAK
Raissya Armilla. Program Studi Kedokterandan Profesi Dokter. Penapisan Mutasi Gen Beta Globin pada Siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi.
Mutasi beta globin merupakan mutasi yang menyebabkan penyakit thalassemia. Thalassemia adalah suatu penyakit herediter yang ditandai dengan berkurangnya produksi hemoglobin (Hb) yang tidak adekuat sebagai akibat berkurangnya atau tidak adanya sintesis rantai polipeptida globin. Tujuan penelitian ini untuk melakukan penapisan mutasi gen beta globin pada siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. Penelitian ini menggunakan metode deskriptif, jumlah sampel sebanyak 81 orang dari satu sekolah dengan rentang usia 15-18 tahun yang telah dipilih secara
Simple Random Sampling. Pengambilan darah dilakukan untuk memeriksa kadar hemoglobin,
dan mutasi beta globin dengan menggunakan PCR dan sequencing DNA. Tipe mutasi yang terbanyak yaitu heterozigot IVSI-5 G>C frekuensi 5% dengan sifat patogenik. Sedangkan untuk non patogenik kami dapatkan pada mutasi kombinasi CD 2 T>C dan IVSII-16 G>C.
Kata kunci: Beta globin, Hb, IVSI-5 G>C, CD 2 T>C, IVSII-16 G>C.
ABSTRACT
Raissya Armilla. Medical Education Study Program and Doctor Profession. Screening Mutation of Beta Globin Gene on the Students of SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi.
Beta globin mutation is a mutation which causes thalassemia disease. Thalassemia is a hereditary disease characterized by inadequate production of hemoglobine (Hb) as a result of reduced or absent globin polypeptide chain synthesis. The purpose of this research is to screen the mutation of beta globin gene on the students of SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. This researched used descriptive method the amount of samples is 81 people from one school with the age range 15-18 years that have been choosen by simple random sampling. Blood taking is done to check hemoglobine levels and beta globin mutation by using PCR and DNA
sequencing.The type of mutation that we get the most is heterozygot IVSI-5 G>C frequency 5%
with pathogenic nature. As for non pathogenic we get on the combinationof CD 2 T>C and IVSII-16 G>C.
viii
DAFTAR ISI
LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .... Error! Bookmark not defined. LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ... Error! Bookmark not defined. PENGESAHAN PANITIA UJIAN ... Error! Bookmark not defined.
KATA PENGANTAR ... iii
ABSTRAK ... vii
DAFTAR ISI ... viii
DAFTAR TABEL ... xi
DAFTAR GAMBAR ... xii
DAFTAR GRAFIK ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
BAB I PENDAHULUAN ... 1 1.1 Latar Belakang ... 1 1.2 Rumusan Masalah ... 3 1.3 Pertanyaan penelitian ... 3 1.3 Tujuan Penulisan ... 3 1.4 Manfaat Penulisan ... 4 1.4.1 Peneliti ... 4 1.4.2 Civitas Akademika ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 5
2.1 Landasan Teori ... 5
2.1.1 Thalassemia ... 5
2.1.2 Klasifikasi Thalassemia ... 9
2.1.3 Patogenesis Thalassemia ... 11
ix
2.3 Diagnosis Molekular ... 27
2.4 Kerangka Teori ... 31
2.5 Kerangka Konsep ... 32
BAB III METODE PENELITIAN ... 36
3.1 Desain Penelitian ... 36
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian ... 36
3.3 Populasi dan Sampel ... 36
3.3.1 Populasi Target ... 36
3.3.2 Populasi Terjangkau ... 36
3.3.3 Perkiraan Besar Sampel ... 36
3.3.4 Kriteria Pemilihan Sampel ... 37
3.3.5 Teknik Pengambilan Sampel ... 37
3.4 Alat dan Bahan ... 39
3.5 Cara Kerja Penelitian ... 40
3.5.1 Pengumpulan Data ... 40
3.5.2 Isolasi DNA ... 41
3.5.3 Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA ... 43
3.5.4 PCR ... 43
3.5.5 Analisis Fragmen DNA Menggunakan Elektroforesis ... 46
3.5.6 Analisis Hasil Sequencing ... 46
3.5.7 Alur Kerja Penelitian ... 47
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 49
4.1 Hasil Pengamatan ... 49
4.1.1 Hasil Isolasi Genom dari Darah Responden ... 49
4.1.2 Amplifikasi Gen β-globin Menggunakan PCR dan Sequencing ... 51
4.2 Pembahasan ... 56
4.2.1 Analisa Mutasi Gen β-Globin ... 56
4.2.2 Keterbatasan Penelitian ... 61
BAB V SIMPULAN DAN SARAN ... 61
5.1 Simpulan ... 61
x
PERNYATAAN PENELITIAN ... 62
DAFTAR PUSTAKA ... 63
LAMPIRAN ... 68
Lampiran 1. Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian ... 68
Lampiran 2. Lembar Persetujuan Responden ... 69
Lampiran 3. Alat dan Bahan Penelitian ... 71
Lampiran 4. Gel Documentation Hasil Elektroforesis Agarose dari Produk PCR Genom DNA Sampel. ... 73
Lampiran 5. Hasil Sequence DNA yang Tidak Terbaca ... 75
Lampiran 6. Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel. ... 76
xi
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Jenis Thalassemia Berdasarkan Sifat Homozigot dan Heterozigot ... 10
Tabel 2.2 Parameter Hematologi Thalassemia ß... 22
Tabel 2.3 Diagnosis Banding Thalassemia dan Anemia Defisiensi Besi. ... 22
Tabel 2.4 Perbedaan Fisik dan Kimia Antara Oksihemoglobindan Dioksihemoglobin. ... 24
Tabel 2.5 Tabel Definisi Operasional ... 33
Tabel 3.1 Alat dan Bahan Penelitian ... 39
Tabel 3.2 Langkah Isolasi DNA... 41
Tabel 3.3 Komposisi mix PCR ... 45
xii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Diagnosis Hemoglobinopati Dengan Pemeriksaan DNA. ... 7
Gambar 2.2 Prevalensi Hemoglobinopati di Dunia. ... 8
Gambar 2.3 Patofisiologi Gejala Klinis Anemia pada Thalassemia ... 11
Gambar 2.4 Situs Splicing pada Gen ß Globin. ... 16
Gambar 2.5 Lokasi Mutasi Penyebab Thalassemia- ß. ... 17
Gambar 2.6 Apusan darah tepi pasien thalassemia ß–HbE heterozigot. ... 21
Gambar 2.7 Apusan darah tepi pasien Hb E homozigot dengan gambaran mikrositik hipokrom, sel target dan poikilosit lain. ... 21
Gambar 2.8 Proses pembentukan hemoglobin. ... 26
Gambar 2.9 Aliran informasi genetik. ... 27
Gambar 2.10 Kerangka Teori ... 31
Gambar 2.11 Kerangka Konsep ... 32
Gambar 4.1 Hasil PCR Gen β-globin ... 50
Gambar 4.2.1 Interetasi Hasil SequencingNormal………...52
Gambar 4.2.2 Interpretasi Hasil SequencingMutasi Heterozigot IVS I-5 G>C... 52
Gambar 4.3.1 Interpretasi Hasil Sequencing Normal ... ...53
Gambar 4.3.2 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Heterozigot Codon 2 T>C . ...53
Gambar 4.3.3 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Homozigot Codon 2 T>C .. ...53
Gambar 4.4.1 Interpretasi Hasil Sequencing Normal ... ...53
Gambar 4.4.2 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Heterozigot IVS II-16 G>C ...53
Gambar 4.4.3 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Homozigot IVS II-16 G>C ...53
Gambar 4.5.1 Interpretasi Hasil Sequencing Normal ... ...54
Gambar 4.5.2 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Heterozigot IVS II-74 T>G ...54
Gambar 4.5.3 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Homozigot IVS II-74 T>G ...54
Gambar 4.6.1 Interpretasi Hasil Sequencing Normal ... ...55
xiii
DAFTAR GRAFIK
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1 Lembar Permohonan Ethical Approval Penelitian ...68
Lampiran 2 Lembar Persetujuan Responden ...69
Lampiran 3 Alat dan bahan penelitian ...71
Lampiran 4 Gel Documentation hasil elektroforesis agarose dari produk PCR genom DNA sampel ...74
Lampiran 5 Hasil Sequence DNA yang Tidak Terbaca ...75
Lampiran 6 Hasil Kemurnian dan Konsentrasi DNA Sampel ...76
1 BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Thalassemia adalah suatu penyakit herediter pada sel darah merah yang ditandai dengan berkurangnya produksi hemoglobin (Hb) yang tidak adekuat sebagai akibat berkurangnya atau tidak adanya sintesis rantai polipeptida globin.1
Prevalensi gen thalassemia mencapai 30-40% di Thailand bagian utara dan Laos, 4,5% di Malaysia, dan 5% di Filipina.2 Untuk Indonesia sendiri WHO menyatakan bahwa di Indonesia terdapat 6-10% orang dengan thalassemia beta minor.2
Menurut data statistik, prevalensi penyakit thalassemia di dunia cenderung semakin meningkat dari tahun ke tahun, termasuk di Indonesia. Beberapa hasil riset menunjukkan angka kejadian thalassemia di Indonesia cukup tinggi. Penelitian Injo LEL (1989) menyebutkan bahwa dari 36 pasien thalassemia di RSCM yang berusia 3-22 tahun, ditemukan 23 pasien dengan thalassemia dan 13 pasien thalassemia HbE.3 Data dari Pusat Thalassemia Departemen Ilmu Kesehatan Anak (IKA) Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (FKUI) Rumah Sakit Cipto Mangunkusomo (RSCM), sampai dengan akhir tahun 2008 terdaftar 1.455 pasien thalassemia yang terdiri dari 50% thalassemia , 48,2% thalassemia /Hb-E, dan 1,8% pasien thalassemia
Diperkirakan tiap tahunnya di Indonesia lahir 2.500 anak dengan thalassemia.4 Provinsi Jawa Barat merupakan daerah dengan prevalensi thalassemia terbanyak se-Indonesia, yaitu sebanyak 42% dari total 6.647 orang.1,5Di Sukabumi, berdasarkan informasi dari ketua Perhimpunan Orang Tua Penderita Thalassemia Indonesia (POPTI) Cabang Sukabumi dr. Hasan Basri mencatat sebanyak 150 anak di Sukabumi menderita thalassemia, yang mengalami peningkatan cukup besar setiap tahunnya.3
Salah satu metode pencegahan adalah melakukan skrining pada perempuan berusia 15-18 tahun, karena pada usia tersebut umumnya perempuan sudah siap menikah.6 Metode skrining (penapisan) ini sangat efektif dilakukan pada populasi masyarakat untuk menekan kejadian thalassemia baru.7 Individu usia subur yang siap menikah mudah dijaring melalui edukasi (penyuluhan) saat usia Sekolah Menengah Atas (SMA) dan akan sangat bermanfaat sebagai “agent of change” untuk memutus rantai thalassemia yang diturunkan dari perempuan atau calon ibu. Peneliti melakukan diagnosis molekuler mutasi gen globin dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dan sequencing DNA pada sampel darah siswi SMAN 1 Sukaraja Sukabumi yang berusia 15-18 tahun sebagai salah satu upaya deteksi dini terhadap kemungkinan penyakit thalassemia. Penapisan mutasi gen globin ini diharapkan memberikan kontribusi dalam peningkatan program promotif - preventif terhadap penekanan angka kejadian thalassemia baru.
1.2 Rumusan Masalah
Bagaimana prevalensi individu dengan mutasi globin pada perempuan berusia 15-18 tahun di wilayah Sukabumi?
1.3 Pertanyaan penelitian
1. Berapakah prevalensi mutasi globin pada remaja perempuan berusia 15-18 tahun di wilayah Sukabumi?
2. Bagimana gambaran genotip remaja perempuan berusia 15-18 tahun di Sukabumi?
3. Bagaimana variasi genetik globin pada remaja perempuan berusia 15-18 tahun di Sukabumi?
1.3 Tujuan Penulisan a. Tujuan Umum
Untuk mengetahui prevalensi mutasi globin pada remaja perempuan berusia 15-18 tahun di wilayah Sukabumi.
b. Tujuan Khusus
Mengetahui gambaran genotip remaja perempuan berusia 15-18 tahun di Sukabumi.
Mengetahui variasi genetik globin pada remaja perempuan berusia 15-18 tahun di Sukabumi.
1.4 Manfaat Penulisan
Hasil penelitian diharapkan memiliki manfaat untuk: 1.4.1 Peneliti
a. Memiliki keterampilan bidang molekuler dalam mendeteksi adanya mutasi genetik dengan menggunakan teknik PCR dan sequencing DNA.
b. Merupakan syarat kelulusan preklinik Program Studi Kedokteran dan Profesi Dokter.
c. Menambah pengetahuan mengenai mutasi genetik globin. 1.4.2 Civitas Akademika
Sebagai sumber pengetahuan dan referensi bagi peneliti selanjutnya yang akan melakukan penelitian genetik biomolekuler.
5 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Landasan Teori 2.1.1 Thalassemia
Thalassemia adalah suatu penyakit herediter yang ditandai dengan berkurangnya produksi hemoglobin (Hb) yang tidak adekuat sebagai akibat berkurangnya atau tidak adanya sintesis rantai polipeptida globin. Thalassemia merupakan suatu penyakit herediter. Seiring dengan meningkatnya jumlah pasien thalassemia, membawa kecenderungan terjadinya peningkatan angka kematian akibat penyakit ini. Hal tersebut disebabkan karena thalassemia memunculkan beberapa komplikasi/penyulit di antaranya adalah kerentanan terhadap infeksi, anemia berat, gangguan pertumbuhan fisik (tulang), serta mental. Menurut Ratna Agung dikutip dari tesis yang berjudul Kendala Deteksi Mutasi: Thalassemia-β Sebagai Model, Thalassemia adalah suatu penyakit genetik pada sel darah merah, yang menyebabkan gangguan pada sintesis hemoglobin. Berdasarkan reduksi rantai globinnya, thalassemia dibedakan menjadi 2 jenis yaitu thalassemia a (alfa) dan b (beta). Bila yang mengalami gangguan pada rantai a maka disebut sebagai thalassemia a (alfa) dan apabila yang terganggu ada pembentukan rantai b (beta) maka disebut sebagai thalassemia b (beta). 8
Kedua penyakit ini merupakan penyakit dari hemoglobinopati. Hemoglobinopati ialah sekelompok kelainan herediter yang ditandai oleh gangguan pembentukan molekul hemoglobin.10 Kelainan ini dibagi menjadi 2 golongan besar, yaitu:
1. Hemoglobinopati struktural
Disini terjadi perubahan struktur hemoglobin (kualitatif) karena subsitusi satu asam amino atau lebih pada salah satu rantai peptida hemoglobin.10 Hemoglobinopati yang penting sebagian besar merupakan varian rantai beta.11 Contoh hemoglobinopati struktural adalah penyakit Hb C, Hb E, dan Hb S.10
2. Sindrom Thalassemia
Thalassemia adalah suatu sindrom yang ditandai oleh penurunan kecepatan sintesis atau absennya pembentukan satu atau lebih rantai globin sehingga mengurangi sintesis hemoglobin normal (kuantitatif).10 Sebagai akibatnya timbul ketidakseimbangan sintesis suatu rantai, salah satu rantai disintesis berlebihan sehingga mengalami presipitasi, membentuk Heinz bodies.10 Eritrosit yang mengandung
Heinz bodies tersebut mengalami hemolisis intrameduler sehingga
terjadi eritropoiesis yang inefektif, disertai pemendekan hidup eritrosit yang beredar.10 Hal tersebut diikuti dengan kompensasi pembentukan rantai globin lain sehingga membentuk konfigurasi lain.12 Misalnya pada thalassemia beta, rantai beta tidak terbentuk, sehingga rantai alfa mengalami ekses atau perannya melampaui batas yang mengakibatkan presipitasi pada rantai ini.10
Hemoglobinopati adalah kelainan bawaan akibat adanya mutasi pada gen yang mengatur pembentukan rantai globin. Perubahan pada gen tersebut dapat mengakibatkan adanya perubahan susunan asam amino pada rantai globin sehingga terbentuk rantai globin yang abnormal atau terjadi perubahan kecepatan pembentukan rantai globin normal. Apabila terjadi perubahan susunan amino pada rantai globin, maka disebut sebagai hemoglobin varian sedangkan bila terjadi perubahan kecepatan pembentukan rantai globin normal maka disebut thalassemia.
Hemoglobin varian merupakan kelainan globin yang sifatnya kualitatif sedangkan thalassemia merupakan kelainan yang sifatnya kuantitatif.7,8,9,13,15,16
Berikut prevalensi hemoglobinopati di populasi dunia, Indonesia masuk ke daerah South-East Asia dengan gen pembawa 5-40%.
2.1.2 Klasifikasi Thalassemia
Secara klinis thalassemia dapat dibedakan menjadi thalassemia mayor, intermedia, dan minor.
Klasifikasi thalassemia :17 Klinis
1. Hidrops fetalis
Thalassemia – dengan delesi empat gen. 2. Thalassemia mayor
Tergantung transfusi, homozigot.
Thalassemia o atau kombinasi sifat thalassemia lain. 3. Thalassemia intermedia
- Thalassemia homozigot Thalassemia + ringan homozigot. Pewarisan bersama thalassemia .
Peningkatan kemampuan untuk membuat hemoglobin fetus (produksi rantai - ).
- Thalassemia heterozigot
Pewarisan bersama gen globin- tambahan ( atau
).
Sifat thalassemia dominan.
- Thalassemia – dan hemoglobin fetus persisten herediter Thalassemia – homozigot.
Thalassemia – thalassemia heterozigot. Hb lepore homozigot (beberapa kasus).
- Penyakit hemoglobin H 4. Thalassemia minor
Sifat thalassemia - o. Sifat thalassemia – +.
5. Hemoglobin fetus persisten herediter Sifat thalassemia – .
Sifat thalassemia - o. Sifat thalassemia - +.
Tabel 2.1 Jenis Thalassemia Berdasarkan Sifat Homozigot dan Heterozigot
Jenis Haplotipe Sifat thalassemia heterozigot (minor)
Homozigot
Thalassemia +
-
o - -/ MCV, MCH rendah Hidrops fetalis
+ - MCV, MCH berkurang
minimal Seperti thalassemia
-o heterozigot Thalassemia - o MCV, MCH rendah (HbA2 > 3,5%) Thalassemia mayor (HbF 98% HbA2 2%) + MCV, MCH rendah (HbA2 > 3,5%)
Thalassemia mayor atau intermedia ( HbF 70-80%, HbA 10-20%, HbA2 variabel) Thalassemia dan hemoglobin fetus persisten herediter MCV. MCH rendah (HbF 5-20%, HbA2 normal) Thalassemia intermedia (HbF 100%) Hb Lepor Thalassemia Thalassemia dan hemoglobin fetus persisten MCV, MCH rendah (HbA 80-90%, Hb Lepore 10%, HbA2 berkurang)
Thalassemia mayor atau
Intermedia (HbF 80%, Hb Lepore 10-20%, HbA, HbA2 tidak ada)
Sumber: Thompson MW, Mc Innes RR, Willard HF. The Hemoglobinopathies: Models of Molecular Disease. in Thompson & Thompson, eda. Genetic in Medicine. USA: WB Saunders Company. 1991.
2.1.3 Patogenesis Thalassemia
Thalassemia ß merupakan kelainan sel darah pada rantai ß. Thalassemia ß adalah kelainan autosomal resesif yang diturunkan oleh individu yang kedua alelnya mengalami mutasi pada thalassemia ß, baik
herediter
Sel tersebut bersifat lebih kaku dan sukar menembus celah-celah endotel
sumsum tulang Badan inklusi menurunkan kelenturan membran eritrosit Pada eritrosit ditemukan badan inklusi yang masih berinti di sumsum tulang yang dapat dilihat
dengan pewarnaan supravital
Jaringan Hipoksia Pembentukan HbF dan HbA2
Daya ikat yang kuat terhadap oksigen
Sebagian akan berikatan dengan rantai dan
Rantai berlebihan dalam eritrosit
Thalassemia Kelainan genetik -globin
Berkurang atau tidak diproduksinya rantai -globin
Tabel 2.1 Jenis Thalassemia Berdasarkan Sifat Homozigot dan Heterozigot (Lanjutan)
Akibatnya eritrosit berinti tersebut akan hancur atau rusak dan terjadi
kebocoran isi sel
Umur eritrosit menjadi pendek
Eritropoiesis berlangsung tidak efektif Masuk ke dalam peredaran
darah Masuk melalui limpa
Badan inklusi difagosit oleh makrofag
Kerusakan sel dan terbentuk tear
drop cell Anemia mikrositik hipokrom
homozigot ataupun heterozigot. Thalassemia ß tersebut merupakan kelainan herediter yang berupa berkurangnya polipeptida globin pada rantai ß.18Kondisi tersebut mengakibatkan sintesis hemoglobin berkurang dan ketidakseimbangan antara rantai globin dan rantai globin ß yaitu berlebihnya jumlah rantai globin . Rantai globin yang berlebih tersebut akan membentuk suatu rantai yang abnormal yaitu 4 rantai globin . Rantai globin yang abnormal ini merupakan rantai globin yang tidak stabil dan mudah berpresipitasi pada prekursor sel darah merah di sumsum tulang sehingga mengganggu pembentukan eritrosit atau eritropoiesis,19 juga mengakibatkan sel darah merah mudah rusak (hemolisis) di sirkulasi perifer.20
Dasar kelainan genetik penyakit thalassemia beta disebabkan adanya mutasi gen beta, yang dapat berupa:
1. Delesi gen
Delesi gen ini jarang terjadi pada thalassemia beta, tersering pada thalassemia beta yang kompleks seperti thalassemia gamma beta. Delesi gen ini dapat terjadi mulai dari bagian intron sampai akhir dari bagian exon. Kelainan ini banyak ditemukan pada suku Indian dan penyebarannya hampir 30% suku bangsa tersebut. Umumnya keadaan penyakit berat.18,19
2. Mutasi transkripsi
Merupakan penyebab yang paling sering terjadi pada thalassemia beta. Mutasi ini terjadi pada proses pembentukan m-RNA. Pada kelainan ini terjadi mutasi basa nukleotida promoter region. Berat ringannya
kelainan ditentukan oleh banyaknya basa nukleotida yang terganti, sehingga mempengaruhi aktivitas DNA dan dapat menyebabkan berkurangnya m-RNA yang terbentuk. Mutasi ini didapat pada thalassemia ß+ Mediteranian, terjadi mutasi satu basa sitosin ke guanine yang menyebabkan penurunan 10% produksi m-RNA. Pada thalassemia ß+ China terjadi mutasi adenin ke guanin dan menyebabkan penurunan produksi m-RNA sebanyak 20-30%. Pada kedua tipe ini fenotip penyakit tampak ringan.18,19,20
3. Mutasi prosesing RNA
Pada kelainan ini tidak terjadi splicing yang normal pada basa nukleotida tertentu yaitu AG dan GT, Karena adanya mutasi pada salah satu basa nukleotida tersebut.
Mutasi pada thalassemia beta terjadi terutama karena perubahan G (guanin) ke A (adenin) pada GT dan G (guanin) ke C (sitosin) pada AG. Perubahan ini akan mengakibatkan bagian intron akan lebih memanjang ke bagian ekson, sehingga bagian ekson yang berisi kodon untuk membentuk m-RNA berkurang. Selain itu processing mutation ini juga menjadi dasar terjadinya kejadian Hb varian. Mutasi tersebut mengakibatkan terjadinya kesalahan pelepasan bagian intron yang menyebabkan terjadinya kelainan susunan basa nukleotida kodon di bagian ekson sehingga terjadi pembentukan asam amino yang lain. Sebagai contoh pada HbE rantai ßE merupakan mutasi yang menghasilkan perubahan satu asam amino, yaitu perubahan dari glutamat (Glu) ke lisin (Lys). Jenis mutasi ini sering terjadi pada
bangsa-bangsa di Asia, khususnya Asia Tenggara, China, dan Negro.
18,19,20,21
4. Mutasi nonsense
Pada keadaan ini terbentuk m-RNA yang tidak dapat berfungsi secara baik karena terhentinya proses translasi sebelum terbentuk rangkaian asam amino yang lengkap. Hal ini disebabkan adanya mutasi penggantian nukleotida tertentu dan dikenal sebagai akhir pembacaan kodon. Kelainan dengan terbentuknya kodon UAA sering terjadi pada thalassemia ß Mediteranian dan kelainan terbentuknya kodon UAG pada thalassemia ß Sardinia. Keduanya merupakan kelainan yang berat karena hampir seluruh globin rantai ß tidak terbentuk. Mutasi ini sering terjadi pada bangsa – bangsa Mediteranean, Indian, dan Asia.19,20,21,22
2.2.1 Struktur Molekul dan Kontrol Gen Globin-ß
Sintesis rantai globin pada manusia disandi oleh 2 kelompok gen, yaitu gen globin -like dan gen globin ß-like. Kedua gen ini membentuk suatu gugus gen yang terletak pada kromosom yang berbeda.22,23 Rantai globin- mengandung 141 asam amino, sedangkan rantai globin- ß tersusun atas 146 asam amino.24,25
Gen globin- ß terdiri dari 3 ekson yang dipisahkan oleh 2 intron (IVS, intervening sequence). Ukuran masing-masing ekson dan intron ini tidak sama, ada yang panjang dan pendek. Ekson 1 merupakan yang terpendek, tersusun atas 30 kodon, sedangkan ekson 2 membentang dari kodon 31-104 merupakan ekson terpanjang, dan ekson 3 tersusun dari
kodon 105-146. Intron pertama (IVS1) terletak di antara kodon 30-31 dengan panjang 130 pb, sedangkan intron kedua (IVS2) terletak diantara kodon 104 dan 105 dengan ukuran 850 pb.24
Secara umum setiap gen globin terdiri atas tiga ekson dan diantara ketiga ekson terdapat intron (intervening sequence=IVS). Bagian hulu atau upstream atau 5’ dan sebelah hilir atau downstream atau 3’ terdapat segmen DNA yang masing-masing dinamakan DNA sisi 5’ (5’ flanking
DNA) dan DNA sisi 3’. Setelah transkripsi, ujung hulu 5’ dari mRNA akan
ditempati oleh rangkai (sequence) yang terdiri atas 2 atau 3 nukleotid yang mempunyai struktur khusus, yang disebut cap, sehingga tempat tersebut dinamakan cap site. Ujung hilir dari DNA sisi 3’ merupakan tempat penambahan poliadenil.26
Heksanukleotid yang terdapat pada batas ekson-intron penting sekali untuk berlangsungnya proses splicing.27 Rangkai tersebut dinamakan consensus splice sequence. Insiasi translasi dari mRNA bermula dari kodon AUG dan berakhir pada kodon UAA, UAG, atau UGA.28
2.2.2 Thalassemia ß Mayor
Thalassemia mayor akibat diturunkannya dua mutasi yang berbeda, masing-masing mengenai sintesis globin-ß (heterozigot campuran). Pada beberapa kasus, terjadi delesi gen ß, gen dan ß, atau bahkan gen , ß, dan .17
Gambaran klinis:
1. Anemia berat menjadi nyata pada usia 3-6 bulan setelah kelahiran ketika seharusnya terjadi pergantian dari produksi rantai ke rantai ß. 2. Pembesaran hati dan limpa terjadi akibat destruksi eritrosit yang
berlebihan, hemopoiesis ekstramedular, dan lebih lanjut akibat penimbunan besi. Limpa yang mengalami pembesaran tersebut, meningkatkan kebutuhan darah dengan meningkatkan volume plasma, dan meningkatkan destruksi eritrosit dan cadangan (pooling) eritrosit. 3. Pelebaran tulang yang disebabkanoleh hiperplasia sumsum tulang yang
hebat menyebabkan terjadinya facies thalassemia dan penipisan korteks di banyak tulang, dengan ciri khas terjadinya fraktur dan penonjolan tengkorak dengan gambaran ‘rambut berdiri (hair on end)’ pada foto ronsen.
4. Penimbunan besi pasca transfusi darah. 5. Mudah terkena infeksi.
6. Osteoporosis.17 2.2.3 Thalassemia ß Minor
Keadaan pada thalassemia ini biasanya tanpa gejala yang berat. Gambaran darah sangat jelas, mikrositik hipokrom (MCV dan MCH
sangat rendah) namun jumlah eritrosit tinggi (>5,5 x 102/mm3) dan anemia ringan (hemoglobin 10-15 g/dl).17 Untuk memastikan diagnosis karena hampir sama sifatnya dengan thalassemia , maka dilihat kadar HbA2
yang tinggi (>3,5%). Indikasi terpenting untuk memastikan diagnosis yakni konseling prenatal pada pasien dengan seorang pasangan yang juga mempunyai kelainan hemoglobin yang nyata.17
2.2.4 Thalassemia Intermedia.
Thalassemia intermedia merupakan thalassemia dengan derajat tingkat keparahan sedang pada (Hb 7,00-10,0 g/dl) yang tidak memerlukan transfusi teratur. Dapat disebabkan oleh pengaruh genetik. Thalassemia ß homozigot dengan produksi Hb F yang lebih dari biasanya atau dengan defek genetik pada sintesis rantai ß atau oleh sifat thalassemia ß sendiri tetapi dengan derajat kelainan globin ringan seperti Hb Lepore.17 Gejala klinis yang biasa ditemukan yaitu, deformitas tulang, pembesaran hati dan limpa, eritropoiesis ekstramedular, dan gambaran kelebihan besi yang disebabkan oleh absorpsi yang meningkat.17
2.2.5 Thalassemia .
Penyakit ini merupakan kegagalan pada produksi rantai dan . Pada keadaan homozigot hanya ditemukan HbF, dan secara hematologik gambarannya seperti thalassemia intermedia.17
2.2.6 Hemoglobin Lepore.
Merupakan suatu hemoglobin yang abnormal yang disebabkan oleh crossing over yang tidak seimbang pada gen dan yang
memproduksi rantai polipeptida yang terdiri dari rantai di ujung aminonya dan rantai di ujung karboksil.17
2.2.7 Thalassemia ß– Hb E
Thalassemia ß dapat dijumpai sebagai penyakit yang berdiri sendiri ataupun dalam bentuk heterozigot ganda dalam hemoglobin varian. Bentuk heterozigot ganda antara thalassemia dengan hemoglobin varian yang sering dijumpai adalah thalassemia ß – HbS, thalassemia ß – HbE, thalassemia ß – HbC, dan thalassemia – HbS.11,29 Bentuk Thalassemia ß– Hb E, yaitu genotip ßEßO atau ßEß+. Thalassemia ß– Hb E pertama kali dijumpai di Thailand.11 Thalassemia ß– Hb E sering ditemukan di Asia Tenggara, kedua gen terdapat dalam frekuensi tinggi.30 Hal ini disebabkan karena adanya pernikahan pasien thalassemia dan Hb E yang tidak terdeteksi.30
2.2.8 HbE (Cd26, GAG>AAG)
HbE ( 2 ß2 26Glu lys ) terjadi akibat adanya mutasi titik pada kodon
26 (GAG AAG), menyebabkan perubahan asam amino posisi 26 dari glutamat menjadi lisin. Mutasi ini mengaktivasi cryptic donor site pada kodon 25 selama process splicing m-RNA ßE sehingga terjadi splicing
abnormalsebesar 5 – 8 %, meskipun situs splicing normal masih tetap
aktif.31
Pada umumnya manifestasi klinis HbE ringan, baik dalam bentuk heterozigot (HbE trait) maupun homozigot (HbE/HbE).32 Heterozigot ganda HbE dengan thalassemia ß memberikan gambaran klinis yang bervariasi, mulai dari bentuk yang ringan sampai dengan ketergantungan
terhadap transfusi darah; dengan kadar Hb antara 3-13 g/dl.32 Kelainan Hemoglobin E ini banyak ditemukan di Asia Tenggara termasuk Indonesia.32
Gambar 2.6 Apusan darah tepi pasien thalassemia ß–HbE heterozigot.26 Mikrositik hipokrom Sel target Sel target Poikilosit
Gambar 2.7 Apusan darah tepi pasien Hb E homozigot dengan gambaran mikrositik hipokrom, sel target dan poikilosit lain.26
2.2.9 Parameter Hematologi Thalassemia ß Tabel 2.2 Parameter Hematologi Thalassemia ß.
Parameter Normal Heterozigot Homozigot
Hb (g/dl) Pria 15 2 9-11 2-3 Wanita 13,5 1,5 MCV (fL) 92 9 <76 50-60 HbA2 (%) 2,2-3,5 3,8-8 2-7 HbF (%) <1 1-5 <10->90 HbA(%) >95% - 0-80
Tabel 2.3 Diagnosis Banding Thalassemia dan Anemia Defisiensi Besi. Thalassemia Anemia defisiensi besi
Splenomegali + -
Ikterus + =
Perubahan morfologik eritrosit Tak sebanding dengan derajat anemi
Sebanding dengan derajat anemi
Sel target ++ +/-
Resistensi osmotik Meningkat Normal
Besi serum Meningkat Menurun
TIBC Menrun Meningkat
Cadangan besi Meningkat Kosong
Feritin serum Meningkat Menurun
HbA2/HbF Meningkat Normal
Sumber: Bunn, H. Franklin. Hemoglobin Molecular, Genetic, and Clinical Aspects. Philadelphia: W.B Saunders Company. 1986.
Sumber: Bunn, H. Franklin. Hemoglobin Molecular, Genetic, and Clinical Aspects. Philadelphia: W.B Saunders Company. 1986.
2.3 Hemoglobin
Fungsi dari hemoglobin yaitu sebagai pengikat oksigen yang sangat dibutuhkan untuk diedarkan ke seluruh tubuh. Sintesis hemoglobin dimulai dalam proeritroblas dan berlanjut bahkan dalam stadium retikulosit pada pembentukan sel darah merah.32 Oleh karena itu, ketika retikulosit meninggalkan sumsum tulang dan masuk ke dalam aliran darah, retikulosit tetap membentuk sejumlah kecil hemoglobin satu hari sesudah dan seterusnya sampai sel tersebut menjadi eritrosit yang matang.32
Ada banyak informasi tentang berbagai sifat fisik dan kimia pada hemoglobin. Banyak perbedaan sifat kimia pada oksihemoglobin dan deoksihemoglobin dapat diartikan dan diprediksikan dalam bentuk struktur tiga dimensi ditetapkan oleh Perutz dan rekan.11 Dioksihemoglobin terdisosiasi menjadi dimer jauh lebih mudah daripada oksihemoglobin.
Tabel 2.4 Perbedaan Fisik dan Kimia Antara Oksihemoglobindan Dioksihemoglobin.
Oksihemoglobin Deoksihemoglobin
Properti fisik
Spektrum yang terlihat:
puncak absorbansi
576,540 nm 555 nm
Spektrum soret 415 nm 430 nm
Kerentanan magnetic Rendah (diamagnetik) Tinggi (paramagnetik)
Properti kimia
Kelarutan Tinggi Rendah
Disosiasi kedalam
dimer
Cepat Lambat
Mengikat haptoglobin Cepat Lambat
Pencernaan oleh
karboksipeptidase
Cepat Lambat
Sumber: Orkin, S. H. Kazazian, H. H., Jr., Antonarakis, S. Linkage of –thalassemia mutations and globin gene polymorphisms with DNA polymorphisms in human globin gene cluster. Nature. 1982
Oksihemoglobin Deoksihemoglobin Properti kimia Reaktivitas 93-sistein SH Cepat Lambat Reaktivitas terhadap bromotimol Lambat Cepat Reaktivitas terhadap sianat
Lambat Lebih lambat
Sifat fungsional
Afinitas terhadap ligan heme
Tinggi Rendah
Afinitas terhadap proton Rendah Tinggi
Relatif afinitas untuk CO2 Rendah Tinggi
Afinitas untuk fosfat organik
Rendah Tinggi
Tabel 2.4 Perbedaan Fisik dan Kimia Antara Oksihemoglobindan Dioksihemoglobin.11 (Lanjutan)
4
Sumber: Orkin, S. H. Kazazian, H. H., Jr., Antonarakis, S. Linkage of –thalassemia mutations and globin gene polymorphisms with DNA polymorphisms in human globin gene cluster. Nature. 1982
Perbedaan terutama karena ikatan garam intersubunit, termasuk 2,3-DPG, yang menstabilkan struktur deoksi. Disosiasi hemoglobin menjadi dimer tampaknya diperlukan untuk mengikat haptoglobin dan untuk infiltrasi hemoglobin melalui glomeruli ginjal.32
Gambar 2.8 Proses pembentukan hemoglobin.32
Setiap rantai hemoglobin memiliki gugus prostetik heme yang mengandung satu atom besi, karena adanya empat rantai hemoglobin di setiap molekul hemoglobin, dapat ditemukannya empat atom besi di setiap molekul hemoglobin. Empat atom besi pada setiap molekul hemoglobin dapat berikatan dengan molekul oksigen pada setiap molekulnya, sehingga empat molekul oksigen dapat diangkut oleh setiap molekul hemoglobin.32
Suksinil KoA yang dibentuk dalam siklus
krebs Membentuk molekul pirol 4 pirol bergabung untuk membentuk protofirin IX Bergabung dengan besi membentuk molekul heme
Setiap molekul heme bergabung dengan rantai
polipeptida panjang, yaitu globin yang disintesis
oleh ribosom
Membentuk subunit hemoglobin yang disebut
Apabila adanya abnormalitas pada molekul hemoglobin menentukan afinitas ikatan hemoglobin terhadap oksigen. Abnormalitas tersebut dapat mengubah ciri-ciri fisik dari molekul hemoglobin. Contohnya pada anemia sel sabit, asam amino valin digantikan oleh asam glutamat pada satu titik, masing-masing di kedua rantai beta.32 Jika terpapar dengan oksigen berkadar rendah, akan terbentuk kristal panjang di dalam sel-sel darah merah yang panjangnya kadang-kadang mencapai 15 . Hal ini membuat sel-sel tersebut tidak dapat melewati kapiler-kapiler kecil, dan ujung kristal tersebut yang tajam cenderung merobek membran sel, sehingga terjadi anemia sel sabit.34
2.4 Diagnosis Molekular
Diagnosis molekular pada pemeriksaan thalassemia menggunakan DNA dari darah. Pemeriksaan ini dipakai untuk mencari gen thalassemia. Gen tersebut tersusun atas asam nukleat yang disebut asam deoksiribonukleat (deoxyribonucleic acid, DNA).33 Molekul tersebut berperan sebagai pembawa informasi genetik. 34
Gambar 2.9 Aliran informasi genetik.34
Replikasi DNA
Transkripsi
Transkripsi balik
RNA Protein
Diagnosis molekular menggunakan DNA bertujuan untuk mencari adanya mutasi. Mutasi adalah perubahan pada sekuens DNA tersebut.35
2.4.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan sebuah penggandaan DNA yang dilakukan secara in vitro. Cara ini banyak sekali dipakai, karena sifatnya yang cenderung lebih mudah, spesifik, dan sensitif. Prinsip PCR adalah apabila DNA dicampur dengan oligonukleotida yang komplementer dan diberi kondisi yang sesuai, maka oligonukleotida tadi akan berperan sebagai titik awal (primer) sintesis
copy dari DNA target. Dengan menggunakan dua primer, satu di sebelah
hulu (5’) dan satu di sebelah hilir (3’) (reverse primer), segmen DNA yang terletak di antara kedua primer tadi akan tergandakan. Dalam satu siklus reaksi, satu untai DNA tunggal akan tergandakan menjadi 2 untai. Dengan n siklus, dari satu DNA untai tunggal teoretis akan dihasilkan 2n copy. Dengan 25 siklus dari satu DNA untai tunggal akan dihasilkan lebih dari 30 juta copy.36
Dengan digunakan enzim Taq yang tahan panas sampai 1000 C maka dapat dicapai otomatisasi pengerjaan dan segmen DNA berukuran sampai beberapa kilo base pair (kb) dapat digandakan dalam waktu kurang dari 3 jam.37 Metode ini sangat sensitif, DNA sejumlah 1 telah cukup untuk satu sample. Dari single copy genes dapat diperoleh sejumlah copy DNA cukup untuk dianalisis.38
Pembentukan dimer pada prosedur PCR dimanfaatkan untuk diagnostik (cara Ligase Chain Reaction/LCR). Prinsip LCR ini yakni, dua
oligonukleotid yang menghibridasi segmen yang berdekatan dengan DNA target dapat mengalami penyambungan (ligase) bila ujung-ujungnya yang berdekatan dengan komplementer dengan DNA target. Bila ujung 3’ dari oligonukleotid yang berdekatan mismatch, maka ligasi tidak akan terjadi.39 Maasalah yang muncul pada prosedur diagnostik ini adalah;40
1. Kita harus tahu lebih dahulu spektrum mutasi dalam populasi untuk menyesuaikan oligonukleotid yang dipakai.
2. Kondisi reaksi menuntut persyaratan yang lebih tinggi dibanding PCR biasa, kenaikan 5 unit enzim pada tiap reaksi atau dua kali lipat konsentrasi oligonukleotid, demikian pula jumlah siklus lebih dari 25 atau 30 akan menyebabkan terjadinya reaksi bebas cetakan (template free reaction); oligonukleotid dengan panjang tidak tepat atau tidak mengandung fosfat 5’ akan menurunkan efisiensi reaksi yang berarti menurunnya sensitivitas.
Kelebihan metode ini adalah bahan radioaktif tidak diperlukan dan otomatisasi dapat diterapkan sehingga dapat dipakai untuk sejumlah besar sampel.41
2.4.2 Analisis Sequencing
Analisis sequencing digunakan untuk mengetahui suatu mutasi pada salah satu alel. Analisis tersebut dilakukan pada DNA untai tunggal. Secara garis besar proses ini meliputi: Reaksi PCR untuk mengamplifikasi fragmen DNA yang akan disekuens, mendapatkan DNA untai tunggal dengan teknik kloning dan sequencing template DNA tersebut.21 Hasil
sequencing tersebut kemudian dibandingkan dengan sekuens DNA
2.5 Kerangka Teori Faktor genetik Thalassemia ß: - CD2 - IVSI-5 - IVSII-16 - IVSII-74 - IVSII-81 - IVSII-81
Mutasi pada kompleks gen ß globin
Rantai ß berhenti atau berkurang
Presipitasi rantai yang berlebihan yang tidak mendapat pasangan rantai ß
Presipitasi rantai pada eritrosit Deposit Fe dalam jaringan Absorpsi Fe Eritropoiesis inefektif Presipitasi rantai intramedular
Pada eritrosit ditemukan badan inklusi yang masih berinti di sumsum tulang yang dapat dilihat
dengan pewarnaan supravital
Thalassemia Thromboembolism dan disfungsi vaskular Hemolisis Hypercoagulability dan disfungsi platetlet ANEMIA mikrositik hipokrom Perubahan bentuk eritrosit Kelenjar paratiroid dan tiroid Kelenjar pituitari Pankreas Testis dan ovarium Hati Jantung Sistem imun HbE:
Mutasi Codon 26glulys
2.6 Kerangka Konsep
Gambar 2.11 Kerangka Konsep
Siswi 15-18 tahun SMAN 1 Sukaraja Sukabumi
Gen ß globin
Identifikasi mutasi pada kompleks gen ß globin
Thalassemia ß: - CD2 - IVSI-5 - IVSII-16 - IVSII-74 - IVSII-81 HbE:
2.7 Definisi operasional
Dalam penelitian ini peneliti menggunakan istilah – istilah yang didefinisikan sebagai berikut
Tabel 2.5 Tabel Definisi Operasional
No Variabel Definisi Alat Ukur Skala Skor
1 Gen globin Variasi sequencing DNA pada gen globin Light cycler 480 Roche 04 909 631 001 Nominal Homozigot Heterozigot
35 BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Desain Penelitian
Penelitian ini merupakan studi deskriptif dengan desain cross sectional. 3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Februari sampai Mei 2017. Pengambilan sampel darah dilakukan di SMA Negeri 1 Sukaraja, Sukabumi. Proses perlakuan spesimen darah dilaksanakan di Laboratorium Riset, Biokimia dan Biologi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.3 Populasi dan Sampel 3.3.1 Populasi Target
Populasi target adalah remaja perempuan di wilayah Sukabumi. 3.3.2 Populasi Terjangkau
Populasi terjangkau adalah responden perempuan masyarakat Sukabumi berusia 15-18 tahun.
3.3.3 Perkiraan Besar Sampel
Dalam penelitian ini penentuan jumlah sampel peneliti menggunakan rumus besar sampel deskriptif:43
adalah deviasi baku alfa
adalah proporsi kategori variabel yang diteliti adalah
adalah presisi
untuk penelitian deskriptif, proporsi (P) yang dimaksud adalah proporsi dari kategori variabel yang diteliti.43 Untuk mentukan besar sampel yang akan diteliti maka nilai P yang digunakan adalah jumlah prevalensi thalassemia berdasarkan hasil survey riskesdas sejumlah 21,7 %.4
Pada penelitian deskriptif kategorik, presisi ( ) penelitian berarti kesalahan peneliti yang masih bisa diterima untuk memprediksi proporsi yang akan diperoleh. Peneliti menetapkan
bahwa selisih nilai yang akan diperoleh dengan nilai sebenarnya yang masih bisa diterima adalah 10%, maka presisi penelitian adalah sebesar 10%. Semakin kecil nilai presisi ( ), maka semakin kecil kesalahan penelitian, semakin baik presisi penelitian, akan tetapi semakin banyak subjek penelitiannya.
3.3.4 Kriteria Pemilihan Sampel
Kriteria pemilihan sampel dalam penelitian ini terdiri dari kriteria inklusi, eksklusi, dan kriteria drop out.
3.3.4.1 Kriteria inklusi
a. Siswi perempuan SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi b. Berusia 15-18 tahun
c. Menyetujui informed consent 3.3.4.2 Kriteria eksklusi
Mengalami gangguan pembekuan darah.
Mengalami menstruasi
3.3.4.3 Kriteria drop out
Sampel yang digunakan rusak selama proses penelitian berlangsung.
3.3.5 Tehnik Pengambilan Sampel
Pengambilan sampel menggunakan metode Simple Random
Sampling. Sampel dipilih secara acak dari jumlah yang telah
ditentukan. Subjek yang terlibat terlebih dahulu menyatakan kesediannya untuk menjadi subjek penelitian dengan menandatangani lembar informed consent. Selanjutnya subjek yang
bersedia mengisi dan menandatangani informed consent secara sukarela memberikan 3-5 mL darahnya untuk dilakukan pemeriksaan screening genetik. Sampel darah dimasukkan ke dalam tabung EDTA dan diberi nomor, selanjutnya disimpan dalam cold room untuk dilakukan isolasi DNA, kemudian dilakukan PCR, dan sequencing DNA. Pengambilan sampel ini telah mendapat persetujuan etik dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
3.4 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian tertera dalam tabel di bawah ini.
Tabel 3.1 Alat dan Bahan Penelitian
Pengukuran konsentrasi hasil isolasi DNA Maestro Nano Drops
Alat Bahan
Pengambilan sampel (darah)
Spuit 3 cc EDTA dalam tabung
Tourniquet
Tabung berisi EDTA Sarung tangan Kapas alkohol
Isolasi genom DNA dari darah
Tabung mikro sentrifugasi 1,5 ml steril,
Penangas air (Water bath) AS ONE TRW 42TP 80 high temperature version, pipet mikro BIOHIT berbagai ukuran, vortex DADD, 2 mL collection tube, Alat sentrifugasi, Eppendorf, mikrotip Biologi ukuran 10 , 200 , dan 1000 , incubator EYELA NDO-400, biomedical freezer SANYO RBC Lysis Buffer GB Buffer Elution Buffer Ethanol Absolut W1 Buffer Wash Buffer
Alat Bahan
Polymerase Chain Reaction (PCR)
DNA sequencer ABI PRISM 3730x1 Genetic
Analyzer develop by Applied Biosystems, US
primer spesifik gen -globin
Elektroforesis genom DNA
Elektroforesis ATTO My Power II 300 AE8135, Timbangan analitik AdventureTM, gel doc system,
penggaris sumur
Agarosa
Ethidium bromide
Loading dye Plastic wrap
3.5 Cara Kerja Penelitian 3.5.1 Pengumpulan Data
Pengambilan darah dilakukan oleh tim dokter PSKPD–FKIK UIN pada bulan Februari 2017. Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah data primer dengan cara punksi darah vena untuk penapisan mutasi gen
-globin.
Responden sebanyak 85 orang yang telah mengisi lembar informed
consent (lampiran 1) dilakukan pengambilan darah sebanyak 3 cc.
Sampel darah diberi nomor dan disimpan dalam freezer/cold room untuk dilakukan isolasi genom DNA, kemudian dilakukan teknik PCR serta sequencing DNA dan selanjutnya dilakukan analisis hasil
sequencing.
3.5.2 Isolasi DNA
Tabel 3.2 Langkah Isolasi DNA
Persiapan Sampel
Fresh Blood
1. Darah sebanyak300 dimasukkan kedalam tabung mikrosentrifugasi berukuran 1,5 mL.
2. 900 RBC Lysis Buffer kemudian ditambahkan dan dikocok.
3. Tabung diinkubasi 10 menit dalam suhu ruangan. 4. Tabung disentrifugasi selama 5 menit pada
kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, supernatant dibuang.
5. 100 RBC Lysis Buffer ditambahkan untuk meresuspensi endapan leukosit, kocok, kemudian diproses dengan cell lysis.
Langkah 1 Cell Lysis
6. 200 GB Buffer ditambahkan kedalam tabung tadi.
7. Tabung diinkubasi pada suhu 60oC selama 10 menit untuk memastikan sampel terlisis dengan baik. 8. Pada saat yang sama, tabung lain berisi50 Elution
Buffer untuk tiap satu sampel disiapkan, kemudian
diinkubasi pada suhu 60oC.
9. Setelah tabung sampel tadi diinkubasi, tabung didinginkan di suhu ruangan.
Langkah 2 DNA binding
10. 200 ethanol absolute ditambahkan kedalam tabung tadi, kemudian secara cepat dikocok selama10 detik.
11. GD Column pada 2 mL Collection Tube disiapkan. 12. Campuran ethanol tadi dipindahkan kedalam GD
Column.
selama 5 menit.
14. Cairan pada 2 mL Collection Tube dibuang.
15. GD Collumn ditempatkan kembali pada 2mL Collection Tube.
Langkah 3 Wash
16. 400 w1 Buffer ditambahkan kedalam GD column kemudian disentrifugasi pada 14.000–16.000 x g selama 1 menit.
17. Cairan pada 2 mL Collection Tube dibuang.
18. GD Collumn ditempatkan kembali pada 2 mL Collection Tube.
19. 600 Wash Bufer ditambahkan kedalam GD Collumn.
20. Tabung disentrifugasi pada 14.000–16.000 x g selama1 menit.
21. Cairan pada 2 mL Collection Tube dibuang.
22. GD Collumn ditempatkan kembali pada 2 mL Collection Tube.
23. Tabung disentrifugasi kembali selama 1 menit untuk mengeringkan matriks kolom.
Langkah 4 DNA Elution
Standar elution buffer untuk 1 sampel adalah 100 . Jika sampel yang digunakan dalam volum yang sedikit, volume elusi sekitar 30-50 dapat meningkatkan konsentrasi DNA.
24. GD Collumn yang sudah kering dipindahkan kedalam tabung mikrosentrifugasi yang steril.
25. 50 elution buffer yang sudah diinkubasi ditambahkan kedalam matriks kolom, dibiarkan selama 3 menit.
26. Tabung disentrifugasi pada 14.000 – 16.000 xg. Table 3.2 Langkah Isolasi DNA (Lanjutan)
3.5.3 Pengukuran kemurnian dan konsentrasi hasil DNA
DNA genom hasil isolasi dianalisis secara kuantitatif dengan menggunakan Denovix Spectrophotometer sehingga diketahui konsentrasi dan kemurnian DNA.
1. Sebanyak 1 μl ddH2O dimasukkan ke dalam apparatus sebagai
blanko.
2. Apparatus dibersihkan dengan kertas tisu.
3. Sebanyak 1 μl elusi buffer dimasukkan ke dalam apparatus sebagai blanko.
4. Apparatus dibersihkan dengan tisu dan dapat dimulai pengukuran DNA.
5. Sebanyak 1 μl DNA hasil isolasi dimasukkan ke dalam apparatus kemudian dilakukan pengukuran.
6. Konsentrasi DNA dapat diketahui dari nanogram/μl dan kemurnianDNA dapat diketahui dari nilai 260/280.
3.5.4 PCR
Berikut prosedur dalam PCR yang akan digunakan :
a. DNA didenaturasi oleh panas dengan suhu 90-95oC selama 20 detik.
Dua untai terpisah karena rusaknya hidrogen yang mengikat mereka.
b. Campuran reaksi mengandung 4 deoxynucleotide triphosphates (
dATP, dCTP, dGTP, dTTP), dan thermostable DNA polymerase.
DNA polymerase tidak mengalami denaturasi pada suhu yang tinggi. Campuran tersebut kemudian mengalami pendinginan, suhu diturunkan menjadi 50-65O C.
c. Setiap helai molekul DNA mengalami proses annealing dengan primer oligonukleotida melengkapi kedua ujung urutan target yang membutuhkan waktu 20 detik.
d. Suhu dinaikan ke 60-75oC dan primer diperluas oleh aksi
polymerase DNA selama 30 detik. Polymerase yang mensintesis
urutan komplementer 5’ ke 3’ arah dari masing-masing primer. Jika
template mengandung nukleotida A, enzim menambahkan pada
nukleotida T untuk primer. Jika template berisi G, ia menambahkan C untuk rantai baru. Pada titik ini akan ada persis dua salinan dari urutan DNA target.
e. Campuran dipanaskan lagi di 90-95oC untuk denaturasi molekul dan memisahkan helai dan siklus diulang. Setiap helai baru kemudian bertindak sebagai template untuk siklus sintesis berikutnya. Jadi amplifikasi hasil pada eksponensial (logaritmik) tingkat, yaitu jumlah DNA yang dihasilkan ganda pada setiap siklus. Produk diperkuat pada akhir PCR yang disebut amplikon.
Standar PCR Protocol KAPA HiFi Hot Start Ready Mix PCR Kit
Step 1: persiapkan PCR mater mix. Tabel 3.3 Komposisi mix PCR
Step2:Mengatur reaksi individual
- Transfer volume yang sesuaiuntuk PCR Master mix,
template dan primer ke individu PCR tubes, atau sumur dari
PCR plate.
- Ditutup atau disegel setiap reaksi individu, mix dan kemudian di sentrifuge.
Step 3: Melakukan PCR dengan cycling protocol berikut Tabel 3.4 Tehnik PCR
Step Temperature Duration Cycle
Initial denaturation 950C 3 min 1 Denaturation 980C 20 sec 15-35 Annealing 60-750C 15 sec 15-35 Extension 720C 15-60 sec/kb 15-35 Final Extension 720C 1 min/kb 1
Komponendan konsentrasi bahan Volume akhir dalam larutan Kappa HifiHotStartReadyMix
PCR kit
12,5 μl
Primer forward (10 pmol) 1 μl Primer reverse (10 pmol) 1 μl DNA Template (100 ng/μl) 4 μl
ddH2o 6,5 μl
3.5.5 Analisis Fragmen DNA Menggunakan Elektroforesis
Hasil isolasi dan amplifikasi DNA dianalisis menggunakan elektroforesis. Tahap elektroforesis adalah sebagai berikut:
1. Pada elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,5% dengan cara mencampurkan 1,5 gram bubuk agarose dengan 100 mL buffer TAE 1x.
2. Larutan Ethidium bromide ditambahkan pada gel sebanyak 1 μl untuk visualisasi DNA.
3. Sebanyak 3 μl DNA hasil PCR dicampurkan dengan 1 μl
loadingdye dan dimasukkan ke dalam sumur.
4. Sebanyak 5 μlladder 100 bp dicampur dengan 1 μl loadingdye sebagai marker dimasukkan ke dalam sumur.
5. Elektroforesis berlangsung selama 60 menit dengan beda potensial 90 V dalam buffer TAE. Setelah elektroforesis selesai, gel ditempatkan pada UV transiluminator padaGel Doc System.
3.5.6 AnalisisHasil Sequencing
Analisishasil sequencing dilakukan setelah didapatkan produk PCR sekeuensing dilakukan dengan mengirimkan sampel ke lab
sequencing First Base. Gen yang akan dilakukan sequencing yaitu
β-globin. Setelah dilakukan sequencing, maka akan dibaca hasil
sequencing tersebut dari urutan awal hingga yang terakhir. Hasil
analisis sequencing kemudian dibandingkan dengan sequencing normal manusia yang didapatkan dari data Genebank. Apabila ada tumpang tindih atau overlapping dan susunan basanya berubah maka akan dihitung mutasi homozigot dan heterozigot. Setelah mutasi tersebut dibaca, maka ditentukan letak mutasi yang ditemukan,pada posisi kodon, intron, maupun eksonnya.
3.5.7Alur Kerja Penelitian
Desain Primer
Optimasi produk PCR meliputi formulasi dan program PCR Sequencing DNA Interpretasi Hasil Sequencing DNA menggunakan Chromas software Sampel Darah
Isolasi DNA dengan metode Geneaid
Analisis DNA genom dengan teknik
elektroforesis dan
Nano drop
Pita DNA diamati menggunakan gel
docsystem, dan dinilai purity DNA
menggunakan Nano
drop
Presentasi frekuensi mutasi gen -globin pada populasi
Sukabumi usia 15-18 tahun
49 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Pengamatan
4.1.1 Hasil Isolasi Genom dari Darah Responden
Sampel yang digunakan pada penelitian ini berupa sampel DNA yang diisolasi dari sel darah putih (white blood), terdiri dari 81 sampel DNA siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. Isolasi dan purifikasi DNA dari sampel darah (whole blood) dilakukan berdasarkan protokol Genomic DNA Mini Kit
(Blood/Cultur Cell) Geneaid GB100. Kemudian untuk memeriksa apakah DNA
telah terisolasi dan terpurifikasi dengan baik dilakukan elektroforesis yang dapat dilihat pada gambar (lampiran 4).
Setelah dilakukan isolasi genom, dilakukan uji spektrofotometri menggunakan
Nano Drop Spektrofotometer. Kemurnian DNA berkisar 0,82-1,94 yang dapat
dilihat pada tabel 6.1 (lampiran 5). Adapun nilai konsentrasi DNA dapat dilihat pada table 6.1 (lampiran 5). Uji spektrofotometri bertujuan untuk mengetahui nilai kemurnian, konsentrasi DNA, dan konsentrasi non DNA dari hasil isolasi genom. Kemudian beberapa sampel dipilih secara acak untuk dilakukan konfirmasi keberadaan pita genom menggunakan elektroforesis gel agarosa (lampiran 4).
Beberapa sampel dilakukan isolasi genom lebih dari satu kali. Hal tersebut disebabkan karena adanya darah yang menggumpal dalam proses isolasi sehingga kemurniannya kurang pada saat dilakukan Nano drop dan setelah elektroforesis tidak menunjukkan gambaran pita (lampiran 5).
Pada gambar 4.1 didapatkan gen β-globin yang terpendar pada pita seribu dua ratus pasang basa. Gen β-globin didapatkan dari sampel DNA setelah dilakukan PCR. Marker yang berada di bagian kiri berjajar merupakan segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. Pada hasil amplifikasi DNA gen β-globin marker atau penanda terbaca pada 1200 pasang basa. Sampel satu hingga sepuluh merupakan hasil amplifikasi DNA gen β-globin. Teknik yang digunakan adalah teknik amplifikasi fragmen DNA secara in vitro dengan menggunakan sepasang primer oligonukleotida melalui serangkaian reaksi denaturasi, anealing dan ekstensi. Primer yang digunakan akan berhibridasi terhadap untai DNA yang sekuensnya komplementer, sehingga fragmen DNA yang teramplifikasi adalah fragmen DNA yang terletak antara kedua primer tersebut.8 Alat yang digunakan untuk mengamati hasil dari elektroforesis tersebut adalah gel doc.
Marker Pita pada 1200 bp
Gambar 4.1 Hasil PCR Gen β-globin
Keterangan gambar: Sampel 1-10 merupakan hasil PCR gen β-globin, marker sebagai penanda posisi pasang basa DNA.
Sampel
4.1.2 Amplifikasi Gen β-globin Menggunakan PCR dan Sequencing
Sebanyak 77 nomor identitas dilakukan amplifikasi gen β-globin. Namun, hanya 72 nomor identitas yang memiliki hasil sequence DNA yang baik dan dapat diinterpretasikan. Lima sampel memiliki sequence yang buruk dan terlalu banyak noise sehingga tidak dapat diinterpretasikan.
Berdasarkan hasil sequencing ditemukan terdapat lima jenis mutasi (CD2 T>C, IVS I-5 G>C, IVS II-16 G>C, IVS II-74 T>G, IVS II-81 C>T) dari gen β-globin yang ditemukan dari 72 siswi SMAN 1 Sukaraja, Sukabumi. Dari seluruhnya, paling banyak mutasi pada CD2 T>C homozigot varian dan heterozigot (tiga puluh sembilan koma delapan puluh persen). Kedua yang paling banyak mutasi yaitu IVS-II-16 G>C homozigot varian dan heterozigot (24.18%) dan ketiga yang paling banyak mutasi yaitu IVS II-74 T>G homozigot varian dan heterozigot (16.38%).
Berikut adalah contoh hasil sequencing sampel DNA yang menyebabkan munculnya trait β-globin.
Pada gambar 4.2.2 didapatkan mutasi pada basa sitosin dan guanin tumpang tindih dalam IVS I-5 yang ditunjukkan dengan tanda biru.
Heterozigot 2 peak G dan C Hasil normal
Gambar 4.2.1 Interpretasi Hasil
Sequencing Normal
Gambar 4.2.2 Interpretasi Hasil
Sequencing Mutasi Heterozigot IVS I-5
Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi heterozigot pada intron 1 nukleotida 5.
Pada gambar 4.3.2 heterozigot didapatkan mutasi pada basa timin dan sitosin tumpang tindih dalam kodon 2 yang ditunjukkan dengan tanda biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi heterozigot pada kodon 2 ekson 1. Pada gambar 4.3.3 homozigot didapatkan mutasi basa timin menjadi basa sitosin dalam kodon 2 yang ditunjukkan dengan tanda biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi homozigot varian pada kodon 2 ekson 1.
Pada gambar 4.4.2 homozigot didapatkan mutasi pada basa guanin menjadi basa sitosin dalam IVS-II-16 yang ditandai tanda biru.
Heterozigot 2 peak T dan C Homozigot CGC menjadi CCC Heterozigot 2 peak G dan C Hasil normal Homozigot CAT menjadi CAC Hasil normal Gambar 4.3.1 Interpretasi Hasil Sequencing Normal
Gambar 4.3.2 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Heterozigot CD-2
Gambar 4.3.3 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Homozigot CD-2
Gambar 4.4.3 Interpretasi Hasil Sequencing Mutasi Heterozigot IVS-II-16 Gambar 4.4.2 Interpretasi
Hasil Sequencing Mutasi Homozigot IVS-II-16 Gambar 4.4.1 Interpretasi
Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi homozigot varian pada intron 2 nukleotida 16. Pada gambar 4.4.3 heterozigot didapatkan mutasi pada basa guanin dan sitosin tumpang tindih dalam IVS-II-16 yang ditandai tanda biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi heterozigot pada intron 2 nukleotida 16.
Pada gambar 4.5.2 homozigot didapatkan mutasi basa timin menjadi basa guanin dalam IVS-II-74 yang ditandai tanda biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi homozigot varian pada intron 2 nukleotida 74. Pada gambar 4.5.3 heterozigot didapatkan mutasi pada basa timin dan guanin tumpang tindih dalam IVS-II-74 yang ditandai tanda biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi heterozigot pada intron 2 nukleotida 74.
Heterozigot 2 peak T dan G Homozigot T menjadi G Hasil normal Gambar 4.5.3 Interpretasi Hasil Sekuensing Mutasi Heterozigot IVS-II-74 Gambar 4.5.2 Interpretasi
Hasil Sekuensing Mutasi Homozigot IVS-II-74 Gambar 4.5.1 Interpretasi
Pada gambar 4.6.2 didapatkan mutasi basa sitosin dan timin tumpang tindih atau dalam IVS-II-81 yang ditandai tanda biru. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki mutasi heterozigot pada intron 2 nukleotida 81.
Heterozigot 2 peak C dan T Hasil normal
Gambar 4.6.1 Interpretasi Hasil Sekuensing Normal
Gambar 4.6.2 Interpretasi Hasil Sekuensing Mutasi Heterozigot IVS-II-81
