PROSES-PROSES AWAL EKSPRESI GEN PADA TANAMAN

PROSES-PROSES AWAL EKSPRESI GEN PADA TANAMAN DR. IR. EDY BATARA MULYA SIREGAR, MS

Fakultas Pertanian

Program Studi Ilmu Kehutanan Universitas Sumatera Utara 1. Pendahuluan

Fenotip yang dapat kita amati dari suatu genotip tanaman tertentu merupakan manifestasi ekspresi gen. Tulisan ini mencoba memberikan gambaran beberapa proses yang berhubungan dengan akumulasi dari mRNA atau protein sesudah terjadinya proses transkripsi.

Meningkat atau menurunnya ekspresi suatu gen dari tanaman tertentu akan dipengaruhi oleh kondisi lingkungan dimana tanaman tersebut berada dan oleh perkembangan dari tanamannya. Faktor lingkungan yang berpengaruh pada ekspresi gen antara lain akibat adanya infeksi patogen atau berbagai faktor abiotik (cahaya, suhu, keberadaan oksigen, kekeringan, kelebihan atau kekurangan nutrisi). Perkembangan tanaman dapat dilihat sebagai temporal (berhubungan dengan waktu) dan atau spatial (berhubungan dengan tempat) serta sejalan dengan berbagai proses seperti perkecambahan, perkembangan organ (akar, daun), transisi dari pucuk vegetatif ke morfologi bunga, perkembangan biji, pemasakan buah, dan berbagai proses lainnya. Yang menjadi pertanyaan adalah bagaimana perubahan-perubahan ekspresi gen tersebut di atur ?

Pada tulisan ini juga digambarkan tentang struktur dari gen yang berasal dari tanaman dan diuraikan tentang berbagai mekanisme yang dapat memodulasi ekspresi suatu gen. Beberapa contoh tentang respon suatu gen terhadap perkembangan dan kondisi lingkungan tertentu, serta teknik yang digunakan untuk menguji bagaimana suatu gen diatur ekspresinya juga akan disampaikan.

2. Struktur Gen Tanaman

Semua gen tersusun dari sequensi DNA yang ditranskripsi menjadi RNA dan diapit oleh sekuensi DNA dimana proses transkripsi dimulai dan diakhiri (Gambar 1). Sekuensi yang dapat ditranskripsi diapit oleh elemen tertentu yang diperlukan untuk inisiasi dan regulasi proses transkripsi. Proses transkripsi sendiri dilakukan oleh enzim RNA polimerase. Berbagai gen yang ada dalam genom inti ditranskripsi oleh salah satu dari tiga jenis enzim RNA polimerase. RNA polimerase I dan III bertanggung jawab untuk mensintesis rRNA dan tRNA., sedangkan RNA polimerase II bertanggung jawab untuk mentranskripsi gen yang mengkode suatu protein tertentu.

Dalam satu gen tertentu, ada yang mempunyai beberapa exon, yaitu bagian yang akan mengkode protein atau biasa disebut open reading frame (ORF) dan yang tidak ditranslasi menjadi protein tetapi berperanan dalam proses transkripsi

(non-translated 5’ atau 3’ region). Hasil transkripsi seringkali juga membawa sekuensi

yang disebut sebagai intron, yang bisa ada di bagian ORF atau di bagian

non-translated 5’ atau 3’ region. Secara bertahap intron ini akan dibuang dari transkrip

yang terbentuk dan exon yang ada akan digabungkan membentuk mRNA yang siap untuk ditranslasi menjadi protein.

Gambar 1. Struktur Gen Tanaman dan Representasi Ekspresinya

Selain yang ada dalam genom inti, sel tanaman juga mempunyai berbagai gen yang ada di dalam genom mitokondria dan kloroplas. Berbagai gen ini mengkode beberapa protein yang diperlukan bagi mitokondria atau kloroplas untuk menjalankan fungsinya. Berbagai gen yang ada dalam genom organel ini mempunyai karakter seperti gen dari organisme prokariot, seperti polisistronik dan mempunyai konsensus Shine-Dalgarno.

3. Gen hanya sebagian dari DNA tanaman

Secara umum, proses pertumbuhan dan perkembangan dari berbagai jenis tanaman tidak terlalu berbeda. Siklus pertumbuhan dan perkembangan meliputi tahapan perkecambahan, pembesaran dan diferensiasi bagian-bagian vegetatif tanaman, perkembangan struktur vegetatif (bunga) dan pembuahan yang mengarah kepada terbentuknya biji tanaman. Kemiripan proses-proses tersebut antara satu tanaman dengan yang lain membuat kita mengharapkan bahwa kandungan DNA total dari berbagai tanaman kira-kira juga akan sama. Tetapi sebagaimana yang telah ditunjukkan hal tersebut tidaklah benar. Arabidopsi thaliana mempunyai total DNA yang paling kecil diantara berbagai tanaman, yaitu sekitar 145 Mbp untuk setiap haploid genom. Variasi kandungan total DNA antara berbagai spesies tanaman tersebut terjadi karena perbedaan dalam jumlah DNA repeat yang ada dalam genom tanamannya. Bagian yang mengkode protein biasanya ditemukan pada bagian non-repetitive dari genom tanaman dan biasanya hanya dalam jumlah beberapa atau kadang satu kopi per genom. Kekecualian dari hal ini adalah untuk gen yang mengkode rRNA sitoplasmik.

4. Peranan dari proximal regulatory element

Berbagai elemen pengatur yang ada di bagian 5’ dari suatu gen dapat dibagi menjadi dua kelompok, yaitu : proximal element, yang mengatur agar proses inisiasi transkripsi dapat terjadi dengan benar dan distal element, yang mengatur dan memodulasi ekspresi gen. Meskipun kedua kelompok tersebut biasa disebut sebagai promotor, kedua elemen ersebut dapat terpisah oleh beberapa ratus nukleotida. Bagian proximal promoter terdiri dari tiga bagian :

1. bagian yang merupakan awal transkripsi (transcription start),

2. TATA box, letaknya kira-kira 30 bp di atas transcription start. Elemen ini berfungsi untuk mengarahkan enzim RNA polimerase agar menggunakan

3. CAAT atau AGGA box, letaknya kira-kira 75 bp di atas transcription site. Bagian ini berfungsi mengatur jumlah transkrip yang akan dibuat oleh suatu gen.

5. Peranan dari distal regulatory element

Elemen pengatur ini diketahui mengatur ekpresi gen yang dipengaruhi oleh berbagai faktor lingkungan dan ada yang dipengaruhi oleh perkembangan tanaman. Ada beberapa cara untuk menentukan letak dan mendeteksi elemen ini. Jika suatu gen telah berhasil diisolasi melalui proses kloning, regulatory element dapat ditentukan dengan membandingkan sekuensinya dengan sekuensi gen yang aktif terekspresi dalam kondisi yang sama, sehingga didapat suatu concencus sequences tertentu. Akan tetapi, hasil yang didapat dari cara di atas harus diuji kembali dengan analisis fungsi dari elemen yang didapat untuk menghindari kesalahan yang mungkin terjadi. Penggunaan tanaman transgenim dapat membantu analisis fungsi dari suatu elemen terhadap ekspresi gen. Prosedur eksperimen yang baku adalah membuat konstruksi dengan berbagai delesi di bagian 5’ dari gennya. Delesi dapat dilakukan dengan menggunakan situs enzim restriksi yang ada (Gambar 2) atau menggunakan enzim nuklease Bal31. Masing-masing kontruksi gen yang didapat selanjutnya diintroduksikan ke tanaman model (biasanya tembakau) dan ekspresi dari masing-masing gennya dianalisis.

Aktivitas ekspresi dari berbagai konstruksi gen tersebut dapat diamati dengan dua cara, yaitu (1) dengan mengamati akumulasi mRNA-nya dengan teknik Northern

bloting, atau (2) dengan mengamati protein yang disandikan oleh masing-masing

kontruksi gen dengan menggunakan antibodi tertentu. Pada Gambar 3 dapat dilihat hasil dari penggunaan teknik yang kedua untuk mengidentifikasi regulatory element dari gen legA legumin tanaman kacang kapri (Pisum sativum). Tiga konstruksi dengan berbagai delesi pada bagian regulatory element dan satu kontruksi dengan gen utuh diintroduksikan ke tanaman tembakau sehingga terbentuk satu seri tembakau transgenik yang masing-masing membawa salah satu dari keempat konstruksi gen yang dibuat. Protein legumin yang dihasilkan diisolasi dari masing-masing individu tanaman transgenik tembakau dan dideteksi dengan teknik ELISA. Hasil yang didapat menunjukkan konstruksi dengan delesi yang berakhir sampai dengan –97bp di atas transcription start (kontruksi –97) menghilangkan aktivitas dari gen (protein legumin tidak diproduksi dari kontruksi gen ini). Sintesis legumin pertama kali dapat dideteksi dalam tanaman yang membawa konstruksi –549. Hal ini berarti bahwa sekuensi upstream dari –97 diperlukan untuk mengaktifkan gen

legA. Biji dari tanaman transgenik yang membawa kontruksi –833 dan konstruksi –

1203 (yang tidak mengalami delesi) menunjukkan ekspresi legumin yang tinggi, pada beberapa tanaman dapat mencapai 0.5% dari total protein sel. Hasil yang sama dengan data ELISA juga diperoleh ketika jumlah transkrip (mRNA) yang terbentuk dari masing-masing konstruksi gen ditentukan dengan menggunakan teknik Northern blotting.

Contoh analisis in vivo menggunakan tanaman transgenik seperti ini dapat memberikan gambaran tentang dua hal penting yang berkaitan dengan regulatory element pada tanaman, yaitu : (1) sekuensi DNA yang diperlukan untuk ekspresi dalam jumlah rendah dan yang bersifat spesifik jaringan biasanya berada di sekitar 500 bp upstream dari transcriptional start, dan (2) elemen yang berada lebih jauh lagi dapat meningkatkan ekspresi gen tanpa berpengaruh terhadap eks[resi gen yang bersifat spesifik jaringa. Beberapa dari elemen tipe ini tidak akan berfungsi jika dipisahkan dari gen-nya semula, sedangkan beberapa yang lain dapat berfungsi sebagai enhancer ketika digabungkan dengan gen lain. Dengan demikian, kesimpulan dari percobaan menggunakan gen legA menunjukkan sekuensi DNA

sampai dengan –549 bp berperanan dalam mengatur ekspresi yang bersifat spesifik jaringan, sedangkan sekuensi antara –549 dengan –1203 bp dapat meningkatkan ekspresi gen.

6. Enhancer

Enhancer adalah sekuensi DNA regulator yang posisinya relatif jauh dari transcription start, dapat berfungsi tanpa tergantung pada posisi atau orientasinya, dan dapat mendorong proses transkripsi berbagai gen yang ada di dekatnya. Sekuensi enhancer ditemukan pada gen conglycinin (seed storage protein) yang berasal dari kedelai. Letak dari enhancer ini ada diantara nukleotida –159 sampai – 257 upstream dari transcription start. Diantara nukleotida tersebut terdapat beberapa kopi DNA repeat yang masing-masing berukuran 6 bp dengan urutan sebagai berikut :

A

AGCCCA A

Dalam suatu percobaan, DNA repeat tersebut disisipkan dalam berbagai posisi dan orientasi yang berbeda, upstream dari suatu gen reporter. Sistem gen reporter yang dibuat terdiri dari : distal element dari gen conglycinin, cauliflower mosaic virus (CaMV) promoter, dan sekuensi pengkode enzim chloramphenicol acetyl transferase (CAT). Konstruksi gen ini telah diintroduksikan ke dalam tanaman model sehingga terbentuk populasi tanaman transgenik yang masing-masing membawa gen reporter tertentu. Tanaman transgenik yang membawa gen reporter dengan DNA elemen yang ada diantara –257 dan –159 mampu mengekspresi enzim CAT dalam biji sebanyak 25 kali lipat lebih tinggi dibanding tanaman kontrol. Hal ini memberikan indikasi bahwa pada sekuensi DNA diantara –257 dan –159 tersebut terdapat elemen yang berlaku sebagai enhancer.

7. Fusi Promotor dan gen reporter

Jika teknik untuk menguji produk alami dari gen tertentu tidak tersedia atau jika ingin mengetahui di bagian jaringan/sel apa suatu gen akan terekspresi, maka ORF dari gen alami tersebut dapat diganti dengan ORF dari gen reporter yang relatif mudah untuk dideteksi. Gen reporter yang biasa digunakan adalah gen CAT (untuk ketahanan antibiotik), gen nptII (untuk ketahanan terhadap kanamycin), atau gen

uid (8-glucuronidase=GUS).

Jika suatu tanaman transgenik mengekspresikan fusi dari gen CAT atau nptII, dengan promotor dan distal element tertentu, maka jumlah enzim GUS atau CAT yang diproduksi (diukur berdasarkan tingkat aktivitasnya) akan dapat dengan mudah ditentukan dan produksi enzimnya akan sangat tergantung pada efektivitas promotor dan distal element-nya. Penggunaan fusi promotor-gen reporter CAT atau nptII tidak dapat memberikan gambaran di jaringan atau sel apa gen reporter ini terekspresi.

Gen reporter yang dapat dimonitor ekspresinya di berbagai tipe jaringan adalah gen uid (GUS). GUS adalah enzim dari E. Coli yang mengkatalisis pemecahan berbagai senyawa glukuronidase. Substrat dari enzim ini telah dibuat secara komersial untuk analisis menggunakan spektrofotometer, fluorometer, dan histokimia. Dengan adanya enzim GUS, X-gluc yang dipakai sebagai substrat analisis histokimia, akan memberikan reaksi warna biru yang dengan mudah dapat dilihat di bawah mikroskop. Selain itu, tipe-tipe sel atau jaringan tertentu yang mengekspresikan fusi promotor-GUS akan dapat diamati. Dengan teknik tersebut, aktivitas suatu elemen regulator tertentu di jaringan tanaman dapat.

8. RNA processing

Hasil awal dari proses transkripsi biasanya berupa molekul RNA yanga ada di dalam nukleoplasma (Gambar 4), yang dikenal sebagai heteronuklear RNA (hnRNA). Molekul hnRNA mempunyai ukuran jauh lebih besar dibandingkan dengan nukleotida yang ada pada mRNA fungsional.

Kelebihan DNA tersebut berupa : (1) 5’ un-translated sequence (5’ UTS), (2) 3’ UTS, dan (3) intron. Molekul hnRNA akan mengalami processing sebelum menjadi mRNA fungsional. Tahapan RNA processing yang harus dilalui antara lain: (1) pemberian gugus m7_{G-CAP (proses capping) pada ujung 5’ dari RNA, (2)}

penambahan sekuensi poli-(A) pada ujung 3’ dari mRNA, dan (3) splicing (penghilangan) intron. Berbeda dengan gen yang berasal dari genom inti, genom organel (mitokondria dan kloroplas) jarang ada yang mempunyai intron. Transkrip (mRNA) dari gen-gen yang ada di kloroplas biasanya tidak mengalami penambahan (A). Sedangkan mRNA dari organel mitokondria mengalami penambahan poli-(A) di bagian ujung 3’, tetapi tidak mengalami capping.

9. Penambahan gugus m7_{G-CAP (Capping)}

Pada molekul mRNA yang mengalami capping, sebuah residu 7-methyl guanosine ditambahkan ke ujung 5’ dari RNA-nya dengan ikatan 5’-5’ (Gambar 5). Struktur CAP ini berfungsi melindungi RNA dari aktivitas enzim eksonuklease dan membantu proses binding dari ribosom (subunit 40S) selama inisiasi proses translasi. Subunit ribosom ini mengenali gugus CAP diujung 5’ dan bergerak sepanjang mRNA sehingga mencapai strat kodon untuk memulai translasi.

10. Penambahan Poli-(A)

Setelah capping, transkrip primer mengalami penambahan sejumlah residu adenosin (poli-[A] ) di ujung 3”. Pada tanaman, signal yang diperlukan untuk penambahan poli-(A) ini mempunyai sekuensi konsensus AAUAAA. Poli-(A) akan ditambahkan pada posisi 13-23 bp setelah signal AAUAAA. Kadang-kadang suatu gen tanaman mempunyai lebih dari satu signal untuk penambahan poli-(A).

Pada hewan, poli-(A) berfungsi melindungi mRNA dari aktivitas enzim ribonuklease dan membantu dalam proses transportasi mRNA dari inti ke sitoplasma. Fungsi yang sama juga diduga dipunyai oleh poli-(A) dari mRNA tanaman.

11. RNA Splicing

Proses yang terakhir yang dialami oleh hnRNA sebelum menjadi mRNA fungsional adalah splicing intron dari mRNA. Proses splicing melibatkan interaksi antara intron, dan u-type small nuclear ribonucleoprotein particle (snRNP), dan beberapa protein lain yang belum jelas identitas dan fungsinya, serta merupakan proses yang memerlukan energi (energy dependent), sehingga memerlukan adanya ATP.

Antara intron dan ekson diketahui mempunyai batasan tertentu, yaitu batas ujung 5’ dari intron adalah pasangan nukleotida GT dan batas ujung 3’ adalah pasangan nukleotida AG. Proses splicing diawali dengan terbentuknya struktur kompleks yang disebut spliceosome. Proses splicing akan berlanjut melalui dua tahapan seperti yang diilustrasikan pada Gambar 3.

Gambar 3. Intron splicing dalam pembentukan mRNA matang.

Sekuensi konsensus batas intron-ekson untuk tanaman berbeda dengan hewan dan organisme eukariot seperti ragi. Dengan demikian, jika gen yang berasal dari hewan atau eukariot lain diekspresikan di sel tanaman dengan teknik rekayasa genetika, maka proses splicing dari gen yang diintroduksi akan terganggu.

Kesimpulan

Semua gen tersusun dari sequensi DNA yang ditranskripsi menjadi RNA dan diapit oleh sekuensi DNA dimana proses transkripsi dimulai dan diakhiri.

Gen hanyalah sebagian dari DNA total yang terdapat di dalam suatu tanaman. Hasil awal proses trasnkripsi adalah molekul RNA yang terdapat di nukleoplasma dan dikenal sebagai heteronuklear RNA (hnRNA). Molekul hnRNA akan mengalami processing sebelum menjadi mRNA fungsional, anatara lain : (1) proses

Daftar Pustaka

Boss, W.F. & J.D. Morre. 1989. Second Messengers in Plant Growth and Development. Liss. New York.

Budle, R.J.A. & D.D. Randall. 1990. Light as a signal influencing the phosphorilation status of plant proteins. Plant Physiol. 94:1501-1504

Datta, N. & A.R. Cashmore. 1989. Binding of pes nuclear protein to promoters of certain photoregulated genes is modulated by phosphorilation. Plant Cell. 1:1069-1077.

Hames, B.D. & D.M. Glover. 1989.Transcription and Splicing. IRL Press. Oxford. Old R.W. & S.B. Primrose. 1985. Principles of Gene Manipulation: an introduction to

genetic engineering (3rd ed.) Blackwell Sci. Pub. Oxford.

SambrookJ., E.F. Fritsch & T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Shewry, P.R. & A.S. Tatham. 1990. The prolamin storage proteins of cereal seed: structure and evolution. Biochem J. 267:1-12.

Zimmerman J.L., N. Apuya, K. Darwish & C. O’Carroll. 1989. Novel regulation of heat shock genes during carrot somatic embryo development. Plant Cell. 1:1137-1146.