1.3 TUJUAN PENELITIAN

5

Penelitian ini akan memproduksi enzim selulase dari tongkol jagung mengunakan Trichoderma reesei, Aspergillus niger dan campuran keduanya dengan waktu fermentasi yang divariasikan. Proses yang dilakukan diawali dengan pretreatment secara fisik dan inkubasi dengan proses Solid State Fermentation (SSF).

1.3 TUJUAN PENELITIAN

Adapun yang menjadi tujuan dari penelitian ini adalah:

1. Mempelajari pengaruh variasi rasio volume Trichoderma reesei dan Aspergillus niger dalam menghidrolisis selulosa dari tongkol jagung.

2. Mempelajari pengaruh variasi waktu inkubasi dalam menghidrolisis selulosa dari tongkol jagung.

1.4 MANFAAT PENELITIAN

Adapun yang menjadi manfaat dari penelitian ini adalah:

1. Memberikan informasi mengenai kinerja Trichoderma reseei, Aspergillus niger dan campuran keduanya yang terbaik untuk menghidrolisis selulosa. 2. Memberikan informasi bagi peneliti yang ingin melakukan penelitian sejenis

atau yang berhubungan.

1.5 RUANG LINGKUP PENELITIAN

Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Penelitian, Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik dan Laboratorium Mikrobiologi Farmasi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Dalam penelitian ini, bahan baku yang digunakan adalah tongkol jagung yang berasal dari proses limbah pertanian. Mikroorganisme yang digunakan dalam penelitian ini adalah Trichoderma reseei dan Aspergillus niger. Penelitian ini diawali dengan membuat kultur kedua mikroba dalam PDA (Potato Dextrose Agar) untuk mendapatkan jumlah mikroba yang cukup yang akan ditambahkan ke dalam percobaan yang dilakukan. Kemudian terhadap substrat terlebih dahulu dilakukan pretreatment secara fisik lalu proses fermentasi yang digunakan ialah Solid State Fermentation (SSF).

Adapun variabel-variabel dari penelitian ini adalah sebagai berikut: 1. Variabel tetap:

a. Berat sampel : 100 gram b. Temperatur inkubator : 20 0_C

c. pH : 4 – 5

d. Kadar air : 75%

2. Variabel divariasikan:

a. Perbandingan volume Trichoderma reseei dan Aspergillus niger : 1:0, 0:1, 1:1, 1:2, 2:1

b. Waktu inkubasi : 3, 4, 5, dan 7 hari

Analisis yang akan dilakukan didalam penelitian ini meliputi kadar selulosa, kadar glukosa, kadar selubiosa dan kadar glukosa tersebut akan dikonversi ke dalam aktivitas enzim.

7

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 TONGKOL JAGUNG

Produksi jagung di Indonesia mengalami fluktuasi dari tahun 2011 hingga 2015. Namun produksi jagung tersebut mengalami kenaikan pada tahun 2015 yaitu sebesar 19.833.289 ton [6]. Produksi jagung pipilan yang melimpah di Indonesia menyisakan tongkol jagung sebagai limbah pertanian. Komposisi dari tongkol jagung tersebut didominasi oleh selulosa. Selulosa merupakan salah satu komponen utama dalam tanaman dan merupakan bahan non beracun, biodegradable, terbarukan dan dapat dimodifikasi dengan mudah. Oleh karena itu selulosa memiliki potensi yang tinggi sebagai bahan industry [20]. Kandungan selulosa yang cukup tinggi dari tongkol jagung yaitu 41%, hal ini memungkinkan untuk dimanfaatkan sebagai substrat dalam produksi crude enzim selulase. Komponen utama lainnya yang cukup tinggi dalam biomassa lignoselulosa adalah hemiselulosa yang merupakan substrat dalam pembuatan xylanase [21]. Tabel berikut adalah data komposisi dari tongkol jagung.

Tabel 2.1 Komposisi Tongkol Jagung [18] Komponen Komposisi (%) Air 9,6 Abu 1,5 Hemiselulosa 36,0 Selulosa 41,0 Lignin 6,0 Pektin 3,0 Pati 0,014

Secara morfologi, tongkol jagung adalah tangkai utama yang termodifikasi. Tongkol jagung merupakan salah satu limbah lignoselulosik yang banyak tersedia di Indonesia. Limbah lignoselulosik adalah limbah pertanian yang mengandung selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Masing-masing merupakan senyawa-senyawa yang potensial dapat dikonversi menjadi senyawa lain secara biologi. Selulose merupakan sumber karbon yang dapat digunakan mikroorganisme sebagai substrat

dalam proses fermentasi untuk menghasilkan produk yang mempunyai nilai ekonomi tinggi [10].

2.2 MIKROBA PENGHASIL ENZIM SELULASE

Pada proses fermentasi melibatkan beberapa enzim yang dikeluarkan oleh kapang, sehingga jumlah sel kapang yang hidup paling tinggi terdapat pada lama fermentasi 3 hari dan semakin lama fermentasi aktivitas kapang semakin menurun [22]. Selulase dapat dihasilkan dari mikroorganisme jamur, bakteri dan actinomycetes, namun jamur digunakan secara komersial untuk produksi enzim dan diantara jamur tersebut, Trichoderma dan Aspergillus telah dipelajari secara ekstensif [23].

Perpaduan antara Trichoderma reesei dan Aspergillus niger menunjukan keseimbangan terbaik dalam kegiatan selulosa dan hemiselulosa dan oleh karena itu sangat efektif untuk sakarifikasi dan lebih disukai untuk enzimatik berbagai biomassa selulosa [24]. Kodri (2013) melakukan penelitian dengan perpaduan antara kedua mikroba tersebut dan mendapatkan hasil terbaik dengan perbandingan 1 Aspergilllus niger : 2 Trichoderma reesei demikian juga penelitian yang dilakukan oleh Ahamed dan Patrick (2008). Namun, beberapa penelitian menunjukan hasil yang berbeda, hasil terbaik yang diperoleh ialah dengan menggunakan mono culture [15, 18, 19].

Mikroorganisme penghasil selulase umumnya merupakan pengurai karbohidrat dan tidak dapat memanfaatkan protein atau lipid sebagai sumber energi. Mikroba penghasil selulase terutama bakteri Cellulomonas dan Cytophaga serta kebanyakan fungi dapat menggunakan berbagai jenis karbohidrat lainnya selain selulosa, sedangkan spesies mikroba selulolitik anaerobik terbatas pada selulosa dan/atau produk hidrolisisnya. Tidak semua mikroorganisme yang dapat menggunakan selulosa sebagai sumber energi menghasilkan kompleks enzim selulase yang lengkap. Hanya beberapa strain yang dapat menghasilkan kompleks enzim selulase yang terdiri dari tiga komponen utama yaitu endo-β-glukanase, ekso-β-glukanase, dan β-glukosidase. Mikroba yang digunakan secara komersial untuk produksi enzim selulase umumnya terbatas pada T. reesei, H. insolens, A. niger, Thermomonospora fusca, dan Bacillus sp [15].

9

2.2.1 Trichoderma reesei

Organisme selulolitik yang mampu mensekresi sejumlah besar enzim selulolitik adalah jamur Trichoderma reesei berfilamen. Tiga jenis selulase bertindak dalam hubungannya satu dengan yang lain secara efektif untuk mengkonversi selulosa menjadi glukosa. Endo-β-1,4-glukonase secara acak membelah ikatan dalam pada bagian amorf dari rantai selulosa dan memperlihatkan akhir rantai untuk membuat target baru untuk set kedua enzim, yaitu selobiohidrolase. Enzim ini, pada gilirannya, menghidrolisis baik kristal dan selulosa amorf dari mengurangi dan tidak mengurangi hingga membebaskan selobiosa yang kemudian dibelah menjadi glukosa oleh set ketiga enzim, yaitu β-glukosidase [24].

Trichoderma reesei jamur berfilamen yang dapat menghasilkan endoglukanase dan eksoglukanase sampai 80% tetapi β-glukosidasenya lebih rendah sehingga produk utama hidrolisisnya bukan glukosa melainkan selobiosa [25].

Sistem selulolitik ekstraseluler dari T. reesei terdiri dari 60-80% cellobiohydrolases atau glucanases exo, 20-36% endoglukanase, dan 1% β-glucosidases, dan ketiga enzim bertindak secara sinergis untuk mengkonversi selulosa menjadi glukosa [26].

2.2.2 Aspergillus niger

Aspergillus niger merupakan sebuah jamur berfilamen yang telah digunakan untuk memproduksi enzim komersial, bahan makanan, obat-obatan, dan asam organik karena efisiensi sekresi yang luar biasa [27]. Aspergillus niger merupakan salah satu spesies yang paling umum dan mudah diidentifikasi dari genus Aspergillus, Aspergillus niger dapat tumbuh dengan cepat, dapat tumbuh pada suhu 35ºC-37ºC (optimum), 6ºC-8ºC (minimum), 45ºC-47ºC (maksimum) dan memerlukan oksigen yang cukup. Aspergillus niger memiliki bulu dasar berwarna putih atau kuning dengan lapisan konidiospora tebal berwarna coklat gelap sampai hitam. Aspergillus niger merupakan salah satu jamur berfilamen yang dapat memproduksi enzim selulase. Enzim selulase diperoleh dari campuran enzim endoglukanase, eksoglukanase, dan β-glukosidase. Aspergillus niger menghasilkan

β-glukosidase tinggi akan tetapi endo-β-1, 4-glukanase dan ekso-β-1,4-glukanasenya rendah [25].

2.3 PRETREATMENT BAHAN BAKU

Teknologi pretreatment/praperlakuan yang dilakukan pada dasarnya adalah untuk mengubah atau memindahkan komposisi dan struktur yang menghalangi proses hidrolisis yang bertujuan untuk meningkatkan laju aktivitas enzimatis dan hasil fermentasi yang menghasilkan glukosa dari selulosa atau hemiselulosa. Praperlakuan biasanya dibutuhkan untuk membantu hidrolisis enzimatis dan biasanya dilakukan pada substrat berbahan lignoselulosa. Lignin yang melindungi selulosa sekaligus sebuah penghalang bagi mikroorganisme untuk memproduksi enzim khususnya selulase sehingga praperlakuan perlu dilakukan. Pada dasarnya, pada produksi enzim selulase yang menginduksi produksi adalah selulosa, dan substrat lignoselulosa yang tidak hanya terdiri dari selulosa saja, tetapi juga terdapat komponen lain membuat perolehan enzim selulase rendah dibandingkan dengan substrat selulosa murni. [15]. Struktur dari lignoselulosa ditunjukan pada gambar dibawah ini:

Gambar 2.1 Struktur Lignoselulosa [11]

11

Gambar 2.3 Struktur Hemiselulosa [28]

Adanya lignin (terutama) dan hemiselulosa pada permukaan selulosa dalam sebuah lignoselulosa merupakan salah satu faktor penghalang yang mencegah selulase menghidrolisis selulosa [11]. Lignin berperan atas kekakuan struktur sebuah lignoselulosa. Dengan demikian, aksesbilitas enzim terhadap selulosa dibatasi oleh lignin tersebut, sehingga perlu dilakukan delignifikasi untuk meningkatkan hidrolisis enzimatik. Hemiselulosa adalah penghalang fisik yang mengelilingi serat selulosa dan dapat melindungi selulosa dari serangan enzimatik.

Tongkol jagung memiliki beberapa komposisi dan yang menjadi penghalang dalam hidrolisis enzimatik ialah kandungan lignin yang terdapat pada tongkol jagung, yakni ±6% [18]. Berbagai prosedur pretreatment telah dievaluasi untuk efektivitas terhadap biodegradasi selulosa dan mungkin kesesuaian prosedur pretreatment dapat bervariasi tergantung pada bahan baku yang dipilih. Metode praperlakuan fisik seperti (ball mill) dapat digunakan sebagai pretreatment tongkol jagung yang akan mengurangi ukuran partikel sehingga meningkatkan luas permukaan yang tersedia saat hidrolisis enzimatik [28, 29].

Pra perlakuan harus memenuhi beberapa persyaratan berikut ini:

1. Meningkatkan pembentukan gula atau kemampuan untuk selanjutnya membentuk gula saat hidrolisis enzimatik.

2. Menghindari degradasi atau hilangnya karbohidrat.

3. Menghindari pembentukan produk samping yang menghambat pada saat proses hidrolisis dan fermentasi selanjutnya.

4. Biaya yang efektif dan meminimalkan pemakaian energy. [29, 14]

2.4 TEKNOLOGI PEMBUATAN ENZIM SELULASE

Saat ini, permintaan industri untuk selulase sedang dipenuhi oleh metode produksi menggunakan proses fermentasi terendam (SMF), menggunakan strain rekayasa genetika dari Trichoderma. Biaya produksi dalam sistem SMF meskipun tinggi dan tidak ekonomis untuk menggunakannya dalam banyak proses seperti produksi enzim yang memerlukan pengurangan biaya produksi dengan mengerahkan metode alternatif seperti SSF. Solid State Fermentation (SSF) dapat menjadi minat khusus dalam proses di mana produk fermentasi mentah dapat digunakan secara langsung sebagai sumber enzim. Hal ini sebagian karena proses yang melibatkan SSF memiliki kebutuhan energi yang lebih rendah, menghasilkan lebih sedikit air limbah dan ramah lingkungan seperti menyelesaikan masalah pembuangan limbah padat. Sistem enzim selulase terdiri dari 3 jenis, yaitu endo-1,4-β-glukanase, selobiohidrolase atau eksoglukanase, dan β-glukosidase [23].

Solid State Fermentation didefinisikan sebagai proses fermentasi dimana mikroorganisme tumbuh pada bahan padat tanpa kehadiran air bebas. Kelemahan dari proses SSF ini ialah tidak dapat digunakan dalam fermentasi bakteri. SSF menawarkan kemungkinan terbesar bila menggunakan jamur, tidak seperti mikroorganisme lainnya, jamur biasanya tumbuh di alam pada substrat padat seperti potongan kayu, biji, batang, dan akar [31]. SSF menawarkan banyak keuntungan untuk produksi bahan kimia dan enzim, di Jepang, SSF digunakan secara komersial untuk menghasilkan enzim dalam skala industri.

13

SSF memiliki banyak keuntungan dibandingkan dengan SMF, diantaranya ialah:

Tabel 2.2 Keuntungan dan Kerugian SSF dibanding SMF [32]

Keuntungan Kerugian

Produktivitas yang lebih tinggi Kesulitan pada scale up Sirkulasi oksigen yang lebih baik Efektifitas campuran rendah

Media dengan biaya yang rendah Sulit mengontrol parameter (pH, panas, kelembaban, kondisi nutrisi) Proses produksi yang mudah Produk pengotor yang lebih tinggi,

meningkatkan biaya pemulihan produk Rendahnya energi yang dibutuhkan

Teknologi sederhana

Jarang mengalami masalah operasional Menyerupai habitat alami bagi beberapa mikroorganisme

Biaya utilitas hidrolisis enzimatik rendah dibandingkan dengan hidrolisis asam atau basa karena hidrolisis enzimatik biasanya dilakukan pada kondisi ringan (pH 4,8 dan suhu 45 - 50 oC) dan tidak memiliki masalah korosi [29].

2.5 ENZIM SELULASE

Selulase merupakan komponen yang terdiri dari campuran kompleks enzim yang bertanggung jawab untuk menghidrolisis selulosa. Mikroorganisme tertentu menghasilkan partikel yang dinamakan selulosom. Partikel inilah yang akan terdisintegrasi menjadi enzim yang secara sinergis mendegradasi selulosa. Selulase dapat dibagi menjadi tiga kelas aktivitas enzim utama [33], yaitu:

1. Endo-1,4-β-D-glucanase (endoselulase, carboxymethylcellulase atau CMCase), yang mengurai polimer selulosa secara random pada ikatan internal α-1,4-glikosida untuk menghasilkan oligodekstrin dengan panjang rantai yang bervariasi.

2. Exo-1,4-β-D-glucanase (cellobiohydrolase), yang mengurai selulosa dari ujung pereduksi dan non pereduksi untuk menghasilkan selobiosa.

3. β–glucosidase (cellobiase), yang mengurai selobiosa untuk menghasilkan glukosa [15].

Gambar 2.5 Mekanisme kerja selulase [21]

Selulase adalah enzim yang penting dalam industri yang diaplikasikan di berbagai industri seperti tekstil, kertas dan pulp, dan industri makanan. Dalam industri makanan, selulase dikombinasi dengan pectinase yang akan membantu dalam ekstraksi yang lebih baik dan klarifikasi dari jus buah. Selulase dikenal baik dalam industry dan sangat diperlukan terutama untuk produksi bioethanol dari lignoselulosa [23]. Selulase diterapkan untuk menghasilkan gula pereduksi dari lignoselulosa, yang dapat lebih dimanfaatkan untuk menghasilkan etanol. Dalam kasus tersebut, sistem selulase digunakan untuk mendegradasi bahan lignoselulosa seperti biomassa limbah pertanian. Selain aplikasi dalam produksi biofuel, selulase juga digunakan dalam buah, sayur industri, tanaman minyak, teh, tekstil, dan pulp [26]. Selulase terdiri dari enzim kompleks yang terlibat dalam degradasi alami dari selulosa, polisakarida utama sel tumbuhan. Enzimatik kompleks dapat mengkonversi selulosa untuk oligosakarida dan glukosa. Mikroorganisme seperti jamur dan bakteri adalah produsen penting dari selulase. Perhitungan biaya substrat untuk sebagian kecil utama dari biaya produksi selulase dan penggunaan sumber daya yang murah biomassa sebagai substrat dapat membantu mengurangi harga selulase [34].

2.6 FAKTOR-FAKTOR YANG MEMPENGARUHI HIDROLISIS ENZIMATIK

Modifikasi struktural yang terjadi pada saat pretreatment biomassa lignoselulosa memiliki pengaruh yang signifikan dalam hidrolisis enzimatik.

15

Komposisi biomassa berperan penting dalam menentukan hidrolisis enzimatik. Selain pretreatment, keadaan proses terkait enzim juga memiliki pengaruh yang besar dalam hidrolisis enzimatik. Faktor utama yang mempengaruhi hidrolisis enzimatik dibagi menjadi dua kelompok, yaitu faktor yang berkaitan dengan enzim dan substrat.

A. Faktor Terkait Enzim a. Suhu Inkubasi

Suhu memiliki efek mendalam dalam konversi enzimatik biomassa lignoselulosa. Suhu juga mempengaruhi adsorpsi selulase. suhu pada saat inkubasi dan adsorpsi ialah 60 oC [21].

b. Pengaruh Surfaktan

Surfaktan adalah senyawa amfilik yang mengandung kepala hidrofilik dan ekor hidrofobik. Beberapa surfaktan memiliki efek positif dalam hidrolisis enzimatik, yakni dapat meningkatkan efisiensi hidrolisis enzimatik sehingga hidrolisis lebih cepat. Asam lemak polietoksilat sorbitan (tween 80, tween 20) dan polietilen glikol (PEG) adalah salah satu surfaktan yang paling efektif untuk meningkatkan hidrolisis enzimatik [21].

c. Inhibitor

Meskipun proses pretreatment membantu meningkatkan pembentukan gula oleh hidrolisis enzimatik, pretreatment juga mengarah pada degradasi karbohidrat yang mengarah kepada pembentukan produk samping yang akan menghambat proses hidrolisis. Senyawa penghambat utama yang terbentuk selama pretreatment ialah:

- Asam organic: asam asetat, asam format dan asam levulinik.

- Produk degradasi gula: furfural dan 5-Hidroksimetilfurfural (5-HMF) - Produk degradasi lignin: vanillin, siringaldehid, dan

4-hidroksibenzaldehid. [21]

B. Faktor Terkait Substrat

Laju hidrolisis enzimatik lginoselulosa dipengaruhi oleh struktural selulosa yang meliputi kristalinitas selulosa, DP, luar permukaan, ukuran partikel, serta kehadiran hemiselulosa dan lignin.

a. Kristalinitas Selulosa

Kristalinitas selulosa berpengaruh pada aksesibilitas dalam hidrolisis enzimatik, penurunan tingkat kristalinitas selulosa diharapkan dapat meningkatkan aksesibilitasnya dalam hidrolisis enzimatis [21].

b. Derajat Polimerisasi

Efek dari derajat polimerisasi terkait dengan karakteristik substrat lain, seperti kristalinitas. Depolimerisasi berhubungan dengan kenaikan rekalsitran dari residu selulosa [21].

c. Aksesbilitas substrat

Aksesbilitas sering diukur dengan metode BET (Bennet-Emmit-Teller) yang mengukur luas permukaan yang tersedia untuk molekul nitrogen. Luas permukaan berkaitan erat dengan ukuran dan bentuk partikel. Sehingga pada pretreatment perlu dilakukan pengecilan ukuran dari biomassa lignoselulosa. Penghilangan hemiselulosa dan lignin juga meningkatkan luas permukaan dan aksesbilitas selulosa [21].

d. Konsentrasi substrat

Konsentrasi substrat merupakan salah satu faktor utama yang mempengaruhi hasil dan tingkat awal hidrolisis enzimatik selulosa. Konsentrasi substrat yang tinggi memungkinkan untuk produksi larutan gula pekat yang berguna untuk fermentasi berikutnya. Kandungan air dalam hidrolisis penting untuk interaksi antar enzim lignoselulosa [21].