EKSPRESI γH2AX SEBAGAI RESPON ADAPTIF SEL LIMPOSIT
PENDUDUK DESA TAKANDEANG DAERAH DENGAN RADIASI ALAM
TINGGI
Iin Kurnia, Teja Kisnanto, dan Yanti Lusiyanti
Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional Jalan Lebak Bulus Raya No.49 Jakarta 12440
email: kurnia@batan.go.id
ABSTRAK
EKSPRESI γH2AX SEBAGAI RESPON ADAPTIF SEL LIMPOSIT PENDUDUK DESA TAKANDEANG DAERAH DENGAN RADIASI ALAM TINGGI. Penduduk yang tinggal pada daerah dengan radiasi alam tinggi mempunyai potensi mengalami kerusakan DNA sebagai bagian dari respon adaptif akibat pajanan radiasi. Kerusakan DNA ini juga berpotensi menginisiasi ketidakstabilan genom yang dapat menimbulkan sel kanker. Kerusakan DNA diantaranya dapat diamati dengan γH2AX sebagai biomarker terjadinya patahan untai ganda DNA. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ekspresi γH2AX sebagai respon adaptif dari limfosit penduduk yang tinggal di daerah radiasi alam tinggi setelah diiradiasi dosis tantang 2 Gy. Sampel darah dari 12 penduduk diiradiasi dosis 2 G, selanjutnya dilakukan deteksi dan penghitungan foci γH2AX sebelum dan setelah iradiasi pada 50 sel limfosit. Dari hasil penelitian diketahui adanya peningkatan yang bermakna secara stattistik jumlah foci γH2AX limposit setelah iradiasi 2 Gy (p=0.004). Tidak ditemukan adanya perbedaan yang bermakna secara statistik pada jumlah foci γH2AX dengan umur dan jenis kelamin baik sebelum ataupun setelah iradiasi. Dari data ini dapat disimpulkan iradiasi 2 Gy secara langsung dapat menimbulkan kerusakan DNA DSB sebagai bagian dari respon adaptif secara in vitro yang dapat diamati dengan biomarker γH2AX.
Kata kunci: radiasi alam dosis tinggi, γH2AX, respon adaptif.
ABSTRACT
γH2AX EXPRESSION AS ADAPTIVE RESPONSE OF LYMPHOCYTE CELLS IN RESIDENT OF TAKANDEANG VILLAGE AREA WITH HIGH BACKGROUND NATURAL RADIATION. Resident that living in high natural radiation has the potential for DNA damage due to exposure to radiation as a part of radiation adaptive response. It has also potentially initiation of genome instability that can cause cancer cell. DNA damage which can be observed with the γH2AX as biomarkers of DNA double strand break. This study aims to determine the expression γH2AX as the adaptive response of lymphocyte of populations living in areas with high natural radiation after being irradiated with challenge dose of 2 Gy. Blood samples from 12 residents were irradiated with 2 Gy and then the detection and counting of γH2AX foci were performed before and after irradiation at 50 lymphocyte cells. From the results study it was found a significant increase in the number of γH2AX foci in lymphocytes after receiving irradiation (p = 0.004). There were no significant differences in the number of γH2AX foci by age and gender either prior to or after irradiation. From this data we can conclude that 2 Gy irradiation directly causes DNA damage as in vitro adaptive response that observed by expression of γH2AX foci.
Keywords: high background natural radiation, γH2AX, adaptive response
PENDAHULUAN
ndonesia memiliki wilayah dengan laju dosis tinggi radiasi pengion alamiah. Mamuju, sebuah desa di pinggiran Sulawesi Barat di Laut Sulawesi memiliki radiasi latar belakang sekitar 13 kali lebih tinggi dari normal. Tempat ini memiliki laju dosis rata-rata tertinggi dibandingkan dengan daerah lain di pulau Sulawesi dan bahkan Indonesia, yang dapat mencapai hingga 2.800 nSv/jam [1, 2].
Pemantauan petanda biologis (biomarker) pada manusia, sebagai alat untuk mengidentifikasi risiko kesehatan dari pengaruh lingkungan seperti radiasi alam, mendapat perhatian khususnya dalam rangka
pengkajian resiko kanker dan respon terhadap terapi. Sasaran lainya adalah untuk mengevaluasi biomarker yang terjadi akibat adanya dari paparan radiasi pengion dosis rendah dan tingkat dosis rendah, termasuk evaluasi risiko sebagai bahan pertimbangan dasar untuk standar proteksi radiasi [3-5].
Di beberapa wilayah dengan latar belakang radiasi tinggi di dunia seperti Brazil, India, Cina dan Iran, radiasi tingkat penduduknya orang-orang yang mirip dengan atau lokal di atas orang-orang dari orang-orang yang bekerja dalam industri nuklir atau radiasi terkait medis [6-10].
Pajanan radiasi pengion berpotensi menimbul-kan kerusamenimbul-kan deoxy nuclei acid (DNA) berupa
double strand break (DSB) atau single strand break (SSB). Terjadinya DSB sebagai awal terjadinya ketidakstabilan genom serta karsinogenesis [11]. γH2AX merupakan nukleosoma dari histon (protein yang mengikat DNA) yang berperan mengatur respon terhadap kerusakan DNA yang dilanjutkan aktivasi sinyal perbaikan. Pada proses ini terjadi fosforilasi γH2AX disekitar area DSB membentuk foci γH2AX. Pembentukan γH2AX ini dapat terjadi setelah pajanan radiasi dari 1mGy dan jumlahnya meningkat seiring peningkatan dosis. Jumlah foci γH2AX per inti sel sama dengan jumlah DSB yang terjadi pada sel [12, 13].
Mengingat masih terbatasnya penelitian yang membahas efek radiasi alam DNA sebagai system biologis utama, maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek radiasi alam dan sekaligus sebagai studi awal respon adaptif limposit penduduk yang tinggal di Mamuju setelah pemberian radiasi 2 Gy dengan mengamati ekspresi foci γH2AX.
TATA KERJA
Sampel
Dua belas sampel darah berasal dari penduduk yang tinggal di desa Takandeang, Mamuju, Sulawesi Barat.
Tempat dan Waktu Penelitian
Kegiatan penelitian dilakukan pada laboratorium radiobiologi dan radiobiologi molekuler serta laboratorium sitogenetik, Pusat Teknologi Keselamatan dan Metrologi Radiasi Badan Tenaga Nuklir Nasional (BATAN) bulan April 2015.
Iradiasi Sampel Darah
Untuk perlakukan sanpel yang diiradiasi sebelum dilakukan isolasi limposit, darah diiradiasi dengan dosis 2 Gy dengan Gamma Cell, Pusat Aplikasi Isotop Radiasi, BATAN.
Pemeriksaan Biomarker γH2AX
Sampel darah dari darah intravena volunteer diisolasi dengan prosedur standard untuk memperoleh limfosit murni. Limfosit diteteskan pada kaca slide, difiksasi dengan formaldehid 2% selama 5 menit, dan difiksasi Triton-X 0,25% dalam PBS selama 5 menit dan dengan larutan BSA 1% dalam PBS selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan antibodi pertama γ H2AX dalam BSA 1% selama 15 menit dan ditambahkan antibody 1 (γ H2AX) selama 45 menit di atas moist chamber. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan BSA 3 x 5 menit, inkubasi antibodi ke 2 selama 30 menit, pencucian PBS 3 x 15 menit, kering angin dan mounting dengan entellan. Pengamatan terhadap gamma γH2AX dengan mikroskop flouresen perbesaran 100x. Untuk penghitungan γ H2AX, mencari rerata jumlah foci atau kelompok foci γ H2AX dalam 100 sel. Apabila jumlah Foci γ H2AX
yang dijumpai stabil sampai jumlah 100 sel maka cukup dihitung 50 sel [14].
Analisis Data
Sebelum dianalilis dilakukan Uji Kolmogorv Smirnov untuk memastikan normalitas data. Perbedaan antara foci γ H2AX sebelum da setelah iradiasi 2 Gy dengan Uji T, hubungan antara foci γ H2AX dengan umur menggunakan Uji Korelasi, serta foci γ H2AX dengan jenis kelamin dengan Uji Anova. Semua data diolah dengan Software Medcalc Versi 12.7.0.0.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Berdasarkan penelitian yang dilalukan maka hubungan ekspresi γ-H2AX sebelum dan setelah iradiasi 2 Gy dapat dilihat pada gambar berikut :
Gambar 1. Foci γH2AX limposit penduduk Mamuju
sebelum radiasi 2 Gy
Gambar 2. Foci γH2AX limposit penduduk Mamuju
setelah radiasi 2 Gy
Gambar 3. Foci γH2AX sebelum dan setelah iradiasi
Gambar 4. Hubungan antara foci γH2AX dan umur.
Gambar 5. Foci γH2AX pada laki laki dan
perempuan.
Seperti pada Gambar 1 dan 2 foci γH2AX berwarna hijau cemerlang dapat terlihat pada sel limposit. Dengan adanya pembentukan foci berarti terjadi kerusakan DNA DSB. Foci γH2AX ini juga dapat terbentuk pada sel normal dengan range tertentu. Diketahui bahwa histon H2AX dapat mengalami fosforilasi pada tempat terjadinya DSB yang tidak bersifat letal. Fosforilasi ini membentuk foci beberapa megabasa kromatin yang dekat dengan posisi DSB. Ini dapat terjadi secara spontan, insidentil atau karena perlakukan tertentu. Foci dengan jumlah yang kecil dapat terbentuk secara spontan, seperti yang diamati pada kultur sel mencit dan disimpulkan bahwa pembentukan foci dalam jumlah kecil juga sebagai bagan dari proses metabolisme. Disisi lain 1 foci juga terkait dengan terbentuiknya 1 DSB disekitar foci juga dikaitkan dengan proses perbaikan DNA dan penyusunan kembali kromatin [15].
Sebelum radiasi rerata foci γH2AX tiap sel 0,08±0,1 dengan range 0,00 sampai 0,3. Kalau dilihat dari nilai rerata nilai foci γ H2AX masih dapat dianggap normal tapi kalau diperhatikan dari nilai ambang tertingginya lebih besar pada penduduk desa Takandeang, Mamuju dibanding nilai normal foci γH2AX. Diduga radiasi alam berpotensi menimbulkan kerusakan DSB DNA yang lebih besar sebagai respon adaptif terhadap adanya paparan radiasi dibanding penduduk yang tinggal pada daerah tanpa radiasi alam yang tinggi. Dari penelitian yang dilakukan Cholpon et al., pada orang normal sebagai kontrol pengamatan foci γ H2AX adalah sekitar 0,1 [16].
Pada Gambar 2, terlihat adanya jumlah foci γH2AX sebelum dan setelah iradiasi 2 Gy yang berbeda secara statistik, seperti disajikan pada Gambar 3. Peningkatan ini disebabkan oleh terbentuknya DSB DNA akibat pemberian radiasi 2 Gy. Setelah iradiasi 2 Gy rerata foci per sel adalah 0,55±0,46 dengan range 0,06 sampai 1,4. Namun rerata foci yang terbentuk lebih rendah dibanding yang dilakukan oleh sejumlah peneliti. Pada sejumlah publikasi lain menyebutkan adanya peningkatan jumlah foci menjadi 10 setiap sel setelah limposit menerima radiasi 2 Gy. Lebih rendahnya nilai γ H2AX setelah iradiasi 2 Gy ini belum dapat dijadikan sebagai suatu asumsi bahwa ini bagian dari respon adaptif yang spesifik yang terkait dengan adanya radiasi alam dosis tinggi. Pada penelitian tersebut diinkubasi selama setengah jam sebelum dilakukan proses isolasi limposit dan pewarnaan immunofloresence untuk mendeteksi ekpspres foci γ H2AX (17-19). Sedangkan pada penelitian ini waktu inkubasi lebih pendek, diduga proses pembentukan foci γ H2AX sebagai biomarker terjadinya DNA DSB belum optimum dibanding penelitian di atas. yang diterima oleh limposit sebelum menerima iradiasi 2 Gy secara in vitro. Pada penelitian awal ini kerusakan DNA DSB merupakan bagian dari respon adaptif terhadap radiasi yang diberikan.
Seperti pada Gambar 4, tidak ditemukan adanya korelasi yang bermakna secara statistik maupun tendensi antara foci γH2AX dan umur. Sebaliknya pada Gambar 5, walaupun tidak mencapai perbedaan secara statistik foci γH2AX laki laki lebih tinggi dibanding perempuan. Lebih tingginya foci γH2AX pada laki laki dibanding perempuan diduga terkait dengan kebiasaan merokok yang dilakukan oleh hampir semua lelaki di desa Takandeang ini. Kebiasaan merokok diduga terkait dengan potensi terbentuknya radikal bebas dalam darah yang juga dapat memicu terjadinya kerusakan DNA.
Jumlah sampel yang sedikit serta prosedur deteksi γH2AX seperti inkubasi setelah radiasi yang belum optimum diduga masih menjadi titik yang menjadi perhatian untuk diperbaiki di masa datang sehingga data yang diperoleh akan menjadi lebih representatif.
KESIMPULAN
Iradiasi 2 Gy secara langsung dapat menim-bulkan kerusakan DSB DNA sebagai bagian dari respon adaptif terhadap radiasi secara in vitro yang dapat diamati dengan biomarker γH2AX dan tidak dapat ditemukan adanya asosiasi antara jumlah foci γH2AX dengan umur dan jenis kelamin baik sebelum iradiasi dan setelah iradiasi.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dibiayai oleh DIPA Pusat Teknologi Keselamatan dab Metrologi Radiasi, Badan Tenaga Nuklir Nasional tahun anggaran 2016. Penulis menyampaikan ucapan terima kasih pada seluruh pihak yang membantu proses penelitian ini di lapangan dan di laboratorium.
DAFTAR PUSTAKA
1. Iskandar, D., Bunawas, dan Syarbaini., Mapping radiation and radioactivity in Sulawesi island, in The Third Asian and Oceanic Congress on Radiation Protection (AOCRP-3), Toshiso Kosako (ed), pp, 2010.
2. Syaeful,H., Sukadana, I.G., dan Sumaryanto A., Radiometric Mapping for Naturally Occurring Radioactive Materials (NORM) Assessment in Mamuju, West Sulawesi. Atom Indonesia Vol 40, No 1:33-39, 2014.
3. Mastrangelo G., Fedeli U., Fadda E., Giovanazzi A., Scoizzato L. Dan Saia B., Increased cancer risk among surgeons in an orthopaedic hospital. Occup. Med. (Lond).5:498–500, 2005.
4. Putta S. dan Andreyev H. J., Faecal Incontinence: A late side-effect of pelvic radiotherapy. Clin. Oncol. (R Coll Radiol).17: 469-477, 2005.
5. Kase K.R., Radiation protection principles of NCRP. Health. Phys., 87: 251–257, 2004. 6. Mohanty A. K., Sengupta D., Das S. K., Saha S.
K. Dan Van K. V., Natural radioactivity and radiation exposure in the high background area at Chhatrapur beach placer deposit of Orissa, India. J. E. Radioact.75: 15–33, 2004.
7. Juliao L. M., Sousa W. O., Santos M. S. dan Fernandes P. C., Determination of 238U, 234U, 232Th, 228Th, 228Ra,226Ra and 210Pb concentration in excreta samples of inhabitants of a high natural background area. Radiat. Prot. Dosimetry.105: 379–382, 2003.
8. Ishima H., Koga T., Tatsumi K., Nakai S., Sugahara T., Yuany. dan Wei L., Dose measurement, its distribution and individual external dose assessments of inhabitants in the high background radiation areas in China. J. Radiat. Res. (Tokyo).41 Suppl: 9–23, 2000. 9. Nair M. K., Nambi K. S., Amma N. S.,
Gangadharan P., Jayalekshmi P., Jayadevan S., Cherian V. dan Reghuram K. N., Population study in the high natural background radiation area in Kerala. India Radiat. Res.152 Suppl: S145–S148, 1999.
10. Sohrabi M. World high level natural radiation and/or radon-prone area with special regard to dwellings. Proceedings of the 4th international conference on high levels of natural radiation, Beijing, China. Oct. 21–25, 1996 Elsevier sciences, Amsterdam. (luxin W., Tsutomu, S. and Zufan T. eds. ): 57–68, 1997.
11. Hanscheid M.H., Gassen D.,, Biko J., Meineke V., Christoph R.C dan Scherthan, H, In Vivo Formation of g-H2AX and 53BP1 DNA Repair Foci in Blood Cells After Radioiodine Therapy of Differentiated Thyroid Cancer, J Nucl Med, 51:1318–1325, 2010.
12. Rodrigue A., Lafrance M., Gauthier M.C., Mc Donald, D., Hendzel, M., West Sc., Jasin, M., dan Masson J.Y., Interplay between human DNA repair proteins at a unique double-strand break in vivo. EMBO J ;25:222-31, 2006.
13. Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S dan Bonner W.M., DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273:5858-68, 1998. 14. Cholpon S.D., Ines, E., Astrid K., Eike W.,
Luitpold V. D., Michael, F dan Bülent P., Radiosensitivity in breast cancer assessed by thehistone γ-H2AX and 53BP1 foci, Radiation Oncology 2013, 8:98, 2013.
15. Sedelnikova, O.A., Pilch, D.R., Redon, C., dan Bonner W.M,. Histone H2AX in DNA damage and repair. Cancer Biol. Ther. ;2:233–235, 2003 16. Sak A., Grehl S., Erichsen P., Engelhard M., Grannass A., Levegrun S.,Pottgen C., Groneberg M., dan Stuschke M,. Gamma-H2AX foci formation in peripheral blood lymphocytes of tumor patients after local radiotherapy to different sites of the body: Dependence on the dose-distribution, irradiated site and time from start of treatment. International Journal of Radiation Biology 83:639–652, 2007.
17. Scherthan H., Hieber L., Braselmann H., Meineke V., Dan Zitzelsberger H., Accumulation of DSBs in gamma-H2AX domains fuel chromosomal aberrations. Biochemical and Biophysical Research Communications 371:694– 697, 2008.
18. Mognato M., Girardi C., Fabris S., Celotti L., DNA repair in modeled microgravity: Double strand break rejoining activity in human lymphocytes irradiated with gamma-rays. Mutation Research 663:32–39, 2009.
19. Redon C.E, Dickey J.S, Bonner W.M., and Sedelnikova O.A., 2009. [gamma]-H2AX as a biomarker of DNA damage induced by ionizing radiation in human peripheral blood lymphocytes and artificial skin. Advances in Space Research 43:1171–1178.2009.
TANYA JAWAB
Efrizon Umar
– Apakah kerusakan DNA lebih tinggi di banding penduduk normal?
Iin Kurnia
– Kerusakan DNA penduduk Takandang Mamuju condong lebih besar
Djarot Sulistio Wisnubroto
– Apakah ada beda spesifik yang terlihat pada penduduk Mamuju akibat radiasi alam?
Iin Kurnia
– Belum terlihat, karena di butuhkan jumlah sampel yang lebih besar dan waktu lebih lama.
