i SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Farmasi
Oleh: Devi Nathania NIM : 078114127
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA
iv
Karya ini kupersembahkan kepada:
Tuhan Yesus Kristus
Orang tuaku, Wadijono Joedi & Tjan Tek Fung
Adik-adikku
Teman-teman yang kusayangi
Almamaterku tercinta Janganlah takut sebab DIA selalu beserta kita.
vii
karena atas berkat, rahmat dan cinta-Nya yang diberikan, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul ”Uji Efek Antiinflamasi Asetil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki yang Diinduksi Formalin 0,5% pada Mencit Jantan Galur Swiss”.
Dalam proses pelaksanaan dan penyusunan skripsi yang merupakan tugas akhir untuk memenuhi salah satu syarat guna memperoleh gelar Sarjana Strata satu Farmasi (S. Farm.), program Studi Ilmu Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta, penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada pihak-pihak yang telah banyak mendukung. Dukungan baik langsung maupun tidak langsung, bimbingan moril maupun pengetahuan juga telah dirasakan oleh penulis. Maka ucapan terima kasih yang tulus khususnya penulis tujukan kepada :
1. Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
2. Ipang Djunarko, M. Sc., Apt. selaku dosen pembimbing yang telah bersedia mengarahkan, mendampingi, dan meluangkan waktu untuk berdiskusi bersama penulis selama proses penelitian hingga selesainya skripsi ini.
3. Phebe Hendra, M. Sc., Ph. D., Apt. selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan waktu, saran dan masukan demi kesempurnaan skripsi ini. 4. Jeffry Julianus, M. Si. selaku dosen penguji skripsi yang telah memberikan
viii
nasehat dan dukungannya yang tidak pernah terlewatkan sehingga penulis dapat semangat dalam menyelesaikan skripsi ini.
7. Adikku Devi Christina, Ayu Florencia, dan Stefanny Rahayu Joedi yang memberikan semangat dan doa.
8. Temanku Maya, Yosephine, Dika, dan Yudi untuk kerjasama dan dukungannya selama melakukan dan menyelesaikan skripsi ini.
9. Sahabatku Dita, Olive, dan Frissa yang telah memberikan semangat, doa, dan dukungan bagi penulis.
10. Teman-teman kost Talenta: Mba Ocha, Cik Winny, Ussy, Iema, Amma, Tika, Soso, Mengty, Fanny, dan Inggrid.
11. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah membantu penulis dalam menyelesaikan skripsi ini.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dan ketidaksempurnaan yang ada dalam penyusunan skripsi ini. Maka penulis mengaharapkan kritik dan saran yang dapat membuat karya ini menjadi lebih baik. Akhir kata, semoga penelitian skripsi ini dapat bermanfaat bagi pembaca terutama bagi perkembangan ilmu kefarmasian.
ix
HALAMAN PENGESAHAN ... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ... iv
PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH……….… v
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... vi
PRAKATA ... vii
DAFTAR ISI ... ix
DAFTAR TABEL ... xii
DAFTAR GAMBAR ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
INTISARI ... xvi
ABSTRACT ... xvii
BAB I. PENGANTAR ... 1
A. Latar Belakang ... 1
1. Permasalahan ... 2
2. Keaslian penelitian ... 3
3. Manfaat penelitian ... 4
B. Tujuan Penelitian ... 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ... 6
A. Inflamasi ... 6
x
F. Asetil Eugenol ... 12
G. Metode Pengujian Antiinflamasi ... 12
H. Landasan Teori ... 13
I. Hipotesis ... 14
BAB III. METODE PENELITIAN ... 15
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ... 15
B. Variabel Penelitian ... 15
C. Definisi Operasional ……... 16
D. Bahan dan Alat Penelitian ... 17
1. Bahan ... 17
2. Alat ... 18
E. Tata Cara Penelitian ... 18
1. Orientasi waktu pengolesan senyawa terhadap edema kaki………. 18
2. Orientasi konsentrasi eugenol sebagai kontrol positif ... 19
3. Orientasi pelarut asetil eugenol ... 19
4. Penentuan peringkat konsentrasi asetil eugenol ... 19
5. Pengelompokan hewan uji ... 20
6. Pengamatan ... 21
F. Tata Cara Analisis Hasil ... 21
xi
1. Orientasi rentang waktu pengolesan senyawa pada edema kaki
mencit………... 23
2. Orientasi konsentrasi eugenol sebagai kontrol positif……… 26
3. Orientasi pelarut dan peringkat konsentrasi asetil eugenol……… 28
B. Hasil Uji Efek Antiinflamasi Asetil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki Mencit yang Diinduksi oleh Formalin 0,5%... 29
C. Hasil Uji Hubungan Linieritas Konsentrasi Asetil Eugenol terhadap Daya Antiinflamasi yang Ditimbulkan…………... 40
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN... 42
A. Kesimpulan ... 42
B. Saran ... 42
DAFTAR PUSTAKA ... 44
LAMPIRAN ... 48
xii
setiap jam selama 5 jam pengamatan ... 24 Tabel II. Hasil analisis paired T-test orientasi rentang waktu pengolesan
setiap 10 menit selama 1 jam pengamatan ... 25 Tabel III. Hasil analisis AUC total ketiga konsentrasi eugenol menggunakan
One-Way ANOVA taraf kepercayaan 95% dengan uji Scheffe……. 27 Tabel IV. Hasil analisis rata-rata nilai AUC total tebal edema kaki mencit
yang diinduksi formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan menggunakan one way ANOVA taraf kepercayaan 95% dengan uji Scheffe... 32 Tabel V. Nilai hasil uji Scheffe % penghambatan inflamasi yang diinduksi
formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan... 35 Tabel VI. Nilai hasil uji Scheffe % daya antiinflamasi yang diinduksi
xiii
beserta aksinya... 7
Gambar 2. Struktur eugenol ... 11
Gambar 3. Struktur asetil eugenol ... 12
Gambar 4. Skema jalannya penelitian ... 20
Gambar 5. Grafik rata-rata tebal edema kaki mencit yang diinduksi formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan... 30
Gambar 6. Diagram batang nilai AUC total masing-masing perlakuan... 33
Gambar 7. Turunan diaril- atau aril/heteroaril-eter dan –tioeter... 37
Gambar 8. Struktur Asetil Eugenol…... 37
Gambar 9. Interaksi antara asetil eugenol dengan valin... 38
Gambar 10. Bentuk radikal dari asetil eugenol……... 38
xiv Lampiran 2.
a. Sertifikat Kalibrasi Jangka Sorong merk Mitutoyo... 53 b. Tabel hasil pengukuran presisi jangka sorong merk Mitutoyo... 55 Lampiran 3. Skema orientasi peringkat konsentrasi kontrol positif eugenol…. 55 Lampiran 4. Surat Keterangan Pembelian Mencit di LPPT-Universitas Gajah
Mada (UGM)……… 56
Lampiran 5.
a. Orientasi rentang waktu pengolesan edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% dengan pengukuran setiap jam selama 5 jam pengamatan ... 57 b. Orientasi rentang waktu pengolesan edema kaki yang diinduksi
formalin 0,5% dengan pengukuran setiap 10 menit selama 1 jam pengamatan ... 60 Lampiran 6.
a. Perhitungan Peringkat Konsentrasi Eugenol sebagai Kontrol Positif ... 63 b. Hasil Analisa Rata-rata AUC total Eugenol 25% v/v, 50% v/v,
xv
Formalin 0,5% menggunakan General Linear Model tingkat kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe……. 67 Lampiran 9. Hasil Analisa Nilai AUC total masing-masing perlakuan
menggunakan One-Way ANOVA tingkat kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe ... 72
Lampiran 10. Perhitungan nilai % penghambatan inflamasi pada kelompok kontrol eugenol 50% v/v; asetil eugenol 100% v/v; 50% v/v; dan 25% v/v ... 76
Lampiran11. Hasil analisa % penghambatan inflamasi menggunakan One-Way ANOVA tingkat kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe ... 77
Lampiran 12. Hasil analisa % daya antiinflamasi menggunakan One-Way ANOVA tingkat kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe ... 79
xvi
minyak cengkeh yang terbukti memiliki efek antiinflamasi. Asetil eugenol merupakan turunan eugenol yang juga berkhasiat sebagai antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk menguji secara in vivo efek antiinflamasi asetil eugenol secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss sehingga didapatkan nilai EC50-nya.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah. Model pengukurannya dengan menggunakan jangka sorong. Mencit dibagi dalam 6 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif formalin 0,5%; kelompok kontrol negatif VCO; kontrol positif eugenol 50% v/v; kelompok perlakuan asetil eugenol 25% v/v; 50% v/v; dan 100% v/v. Pengolesan senyawa uji dilakukan pada menit ke-60 setelah injeksi formalin dan pengukuran tebal edema dilakukan tiap jam selama 6 jam pengamatan. Data tebal edema diolah menjadi nilai AUC total kemudian dianalisis dengan uji Kolmorogorof-Smirnov, dilanjutkan dengan analisis ANOVA satu arah dengan taraf kepercayaan 95% dan uji Scheffe serta Post Hoc.
Hasil persentase penghambatan inflamasi asetil eugenol 25% v/v, 50% v/v, dan 100% v/v berturut-turut adalah 41,52%; 16,96%; dan 9,04%; sedangkan persen daya antiinflamasinya berturutturut sebesar 8,23%; 30,32%; dan -42,74%. Berdasarkan uji regresi linier, semakin meningkatnya konsentrasi asetil eugenol, persen penghambatan dan persen daya antiinflamasinya semakin menurun. Dari persamaan regresi linier tersebut didapatkan nilai EC50 sebesar 15,45%.
xvii
tract. Eugenol is the main compound of clove oil that proven its anti-inflammatory effect. Acetyl eugenol is eugenol’s derivate that also have anti-inflammatory effect. It had proven in in vitro study. This study aims to prove that acetyl eugenol really has in vivo anti-inflammatory effect.
This research includes pure experimental studies of completely randomized one-way pattern design. Measurement of paw-edema induced formalin of mice using the vernier caliper Mitutoyo. Mice were divided into 6 groups, ie. negative control group of formalin 0.5% and VCO; positive control group of eugenol 50%; and acetyl eugenol 25%, 50%, and 100% v/v. Application of test compound is given in the 60th minute after formaldehyde injection and edema is measure every hour for 6 hours. Edema thickness data is processed into the value of total AUC and was analyzed with Kolmorogorof-Smirnov test, followed by a one-way ANOVA analysis with a 95% level of confidence and then Scheffe test and Post Hoc. Then proceed again with Linear Regression to know EC50.
The percentage of inflammatory inhibition of acetyl eugenol 25% v/v, 50% v/v, and 100% v/v are 41.52%; 16.96%; and 9.04%; and the potency of acetyl eugenol are 8.23%; -30.32%; and -42.74%. According to the linier regression’s result, the increasement of concentration acetyl eugenol will cause the decreasement of inflammatory inhibition and potency of acetyl eugenol. The effective concentration of acetyl eugenol is 15.45%.
1
Latar Belakang
Inflamasi atau yang biasa kita kenal dengan istilah peradangan merupakan mekanisme pertahanan tubuh terhadap infeksi maupun iritasi. Gejala-gejala inflamasi antara lain kalor, dolor, rubor, tumor, dan functiolaesa. Inflamasi ini sering kita alami dalam kehidupan sehari-hari dan tidak jarang menimbulkan rasa yang tidak nyaman bagi penderitanya. Rasa tidak nyaman yang timbul mendorong penderita untuk bergegas mengatasi peradangan yang terjadi.
Salah satu upaya pertama yang dapat dilakukan untuk mengurangi rasa tidak nyaman yang timbul akibat inflamasi adalah dengan pemberian obat antiinflamasi lokal yang dapat dioleskan pada daerah yang terkena inflamasi. Hal ini dirasa lebih mudah, cepat dan praktis sebagai pertolongan pertama daripada pemberian secara oral terutama untuk obat-obat golongan Antiinflamasi Non Steroid (AINS) yang dapat menimbulkan efek samping berupa iritasi pada lambung. Efek samping ini timbul karena sebagian besar obat-obat golongan AINS tidak selektif terhadap enzim siklooksigenase-2 (COX-2) (Schror dan Meyer-Kirchrath, 2000).
Adapun isi dari minyak esensial tersebut antara lain β-caryophyllen dan eugenol sebagai komponen utama, α-humulen, eugenyl acetat, dan α-copaen. Tiap-tiap komponen dalam minyak esensial tersebut saling mempengaruhi satu sama lain dalam menimbulkan efek antiinflamasi. Oleh karena itu perlu dilakukan uji aktivitas antiinflamasi dari masing-masing komponen tersebut.
Hidalgo, Rosa, Carrasco, Cardona, Gallardo, dan Espinoza (2009) juga menyebutkan bahwa eugenol dan turunannya memiliki kemampuan sebagai antioksidan yang dapat menghambat peroksidasi lipid yang diinduksi oleh reaktif oksigen spesies, dimana reaktif oksigen spesies ini juga berpengaruh pada proses terjadinya inflamasi. Srivastava dan Maholtra (1991) juga melakukan penelitian tentang derivat eugenol, yaitu asetil eugenol. Dalam penelitian ini disebutkan bahwa asetil eugenol dapat menghambat agregasi dan metabolisme asam arakhidonat pada platelet manusia secara in vitro.
Berdasarkan uraian di atas, maka peneliti tertarik dan ingin mengetahui apakah asetil eugenol memiliki efek antiinflamasi apabila digunakan secara topikal dan berapakah % penghambatan inflamasi dan % daya antiinflamasinya serta konsentrasi efektif (EC50) dari asetil eugenol bila digunakan secara topikal.
1. Permasalahan
a. Apakah asetil eugenol memiliki efek antiinflamasi secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5 % pada mencit jantan galur Swiss?
b. Berapakah % penghambatan inflamasi yang ditimbulkan oleh pemberian asetil eugenol secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5 % pada mencit jantan galur Swiss?
c. Berapakah % daya antiinflamasi yang ditimbulkan oleh pemberian asetil eugenol secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5 % pada mencit jantan galur Swiss?
d. Berapakah konsentrasi efektif (EC50) asetil eugenol sebagai agen antiinflamasi terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5 % pada mencit jantan galur Swiss?
2. Keaslian penelitian
Sepanjang penelusuran pustaka yang dilakukan penulis, ada penelitian tentang asetil eugenol yang pernah dilakukan, yaitu Acetyl eugenol, a component of oil of cloves (Syzygium aromaticum L.) inhibits aggregation and alters
arachidonic acid metabolism in human blood platelets (Srivastava dan Maholtra,
1991). Dalam penelitian itu disebutkan bahwa asetil eugenol berpotensi sebagai agen penghambat platelet dan dapat menghambat agregasi asam arakhidonat pada konsentrasi 12 µM.
(Zingiber officinale Roscoe) yang Diberikan Topikal terhadap Udem Kaki Tikus yang Diinduksi Karagenin (Gunani, 2009). Hasil penelitian tersebut menunjukkan krim tipe A/M ekstrak etanolik jahe 10% memiliki daya antiinflamasi dengan persentase penghambatan (45,10 + 11,18)% lebih kecil dari Na diklofenak emulgel yang memiliki persentase penghambatan (76.47+13,16)% (p=0,002).
Namun penelitian tentang Efek Antiinflamasi Asetil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki yang Diinduksi oleh Formalin 0,5 % pada Mencit Jantan Galur Swiss belum pernah dilakukan.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat teoritis. Penelitian ini dapat menambah informasi dan pengetahuan tentang efek antiinflamasi asetil eugenol secara topikal terhadap edema yang diinduksi oleh formalin 0,5%.
b. Manfaat praktis. Penelitian ini dapat dijadikan sebagai acuan, yaitu berupa nilai EC50, untuk penggunaan asetil eugenol sebagai antiinflamasi topikal.
Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum
2. Tujuan khusus
a. Mengetahui ada tidaknya efek antiinflamasi secara topikal dari asetil eugenol terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur swiss.
b. Mengetahui % penghambatan inflamasi yang ditimbulkan oleh pemberian asetil eugenol secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5 % pada mencit jantan galur Swiss.
c. Mengetahui % daya antiinflamasi yang ditimbulkan oleh pemberian asetil eugenol secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5 % pada mencit jantan galur Swiss.
6
A. Inflamasi
Rhen dan Cidlowski (2005) mendefinisikan inflamasi sebagai respon reflektif tubuh terhadap infeksi, ikatan antibodi terhadap antigen di dalam tubuh, iritasi mekanik atau luka, dan kerusakan jaringan. Pengamatan yang lebih dekat pada daerah inflamasi menunjukkan terjadinya dilatasi pada pembuluh darah sehingga darah pada daerah tersebut lebih banyak, serta terjadi bendungan cairan lainnya yang menyebabkan daerah tersebut membengkak (Maffetone, 2002).
Gejala-gejala yang dapat dikenali dalam proses inflamasi adalah adanya rubor (kemerahan), edema (pembengkakan), kalor (panas), dolor (nyeri), dan
functiolaesa (hilangnya fungsi) (Kee dan Hayes, 1996).
Rubor atau kemerahan biasanya merupakan hal pertama yang terlihat di daerah yang megalami peradangan (Kee dan Hayes, 1996). Warna kemerahan ini akibat adanya dilatasi pembuluh darah kecil dalam daerah yang mengalami kerusakan (cit Setyarini, 2009). Dengan vasodilatasi maka aliran darah yang menuju ke daerah tersebut akan semakin banyak sehingga terlihat warna kemerahan dan panas yang dirasakan (Karch, 2003).
besar isi dari eksudat adalah cairan plasma, tetapi kemudian sel-sel darah putih akan meninggalkan aliran darah kemudian tertimbun sebagai bagian dari eksudat (Price dan Wilson, 1995).
Dolor atau rasa sakit dari reaksi peradangan dapat disebabkan oleh adanya perubahan pH lokal atau konsentrasi lokal ion-ion tertentu dapat merangsang ujung-ujung nosiseptor. Pengeluaran zat kimia tertentu seperti histamin (Price dan Wilson, 1995), prostaglandin, dan serotonin atau zat kimia bioaktif lainnya dapat merangsang nosiseptor. Selain itu, edema yang terjadi mengakibatkan peningkatan tekanan lokal yang menimbulkan rasa sakit (cit Setyarini, 2009).
Gangguan fungsi (functiolaesa), merupakan konsekuensi dari suatu proses radang. Gerakan yang terjadi pada daerah radang, baik dilakukan secara langsung atau reflek akan mengalami hambatan rasa sakit. Pembengkakan yang hebat secara fisik mengakibatkan kurangnya gerak jaringan (cit Setyarini, 2009).
Peristiwa utama yang terjadi pada proses inflamasi adalah adanya perubahan aliran vasa darah dan peningkatan permeabilitas sekuler. Pada perubahan aliran vasa darah terjadi vasokonstriksi sementara yang kemudian menjadi vasodilatasi yang berlebihan sehingga banyak aliran darah yang mengalir ke daerah tersebut. Proses ini membuat daerah yang mengalami inflamasi menjadi merah dan hangat. Vasodilatasi ini membuat sirkulasi darah menjadi melambat dan terjadi peningkatan permeabilitas vaskular sehingga terjadi stasis. Kemudian terjadi marginasi leukosit dan keluarnya cairan yang menyebabkan terjadinya edema. Peristiwa penting yang kedua adalah terjadinya peningkatan permeabilitas vaskular sehingga menyebabkan kebocoran endotel. Peristiwa ini akan meningkatkan tekanan hidrostatik dan penurunan tekanan koloid osmotik protein (Harijadi, 2009).
dalam penggumpalan darah, sensitivitas nyeri, dan reaksi alergi (Amasino, Deng, Huang, Lee, Lesi, Pu, et al., 1996).
B. Antiinflamasi
Obat Anti-Inflamasi Non Steroid (OAINS) populer dengan menghambat baik sistem enzim siklooksigenase maupun lipooksigenase intraseluler, yang nantinya akan berpengaruh pada respon inflamasi yang terjadi dan menurunkan produksi berbagai komponen prostaglandin (Babb, 1992). Dannhardt dan Laufer (2000) menyatakan bahwa senyawa yang termasuk dalam penghambat enzim COX-2 adalah senyawa yang bersifat lipofil dan asam. Berdasarkan strukturnya ada beberapa golongan inhibitor selektif COX-2, yaitu: (1) turunan karbosiklik dan heterosiklik yang terikat visinal dengan moieties aril, (2) turunan diaril- atau aril/heteroaril-eter dan –tioeter, (3) turunan cis-stilben, serta (4) keton diaril dan aril/heteroaril, (5) senyawa dengan gugus antioksidan.
C. Formalin
Formalin adalah larutan formaldehid sekitar 37% yang larut dalam air. Formaldehid seketika menghasilkan gugus hidroksimetil yang reaktif pada asam amino seperti lysine (K), arginine (R), tyrosine (Y), asparagine (N), histidine (H), glutamine (Q), and serine (S) (Sompuram, Vani, Messana, dan Bogen, 2004).
Asam-asam amino tersebut berikatan dengan protein dan molekul besar. Formaldehid memiliki nilai koefisien difusi sebesar 0,79. Kecepatan penetrasi jaringan oleh formaldehid relatif cepat, kurang lebih 1 mm/jam (Goldstein, Ferkowicz, Odish, Mani, dan Hastah, 2003). Kandungan unsur aldehida yang terdapat di dalam formalin akan mudah bereaksi dengan protein sehingga menyebabkan kematian sel (Hasyim, Hamam, dan Akil, 2006). Formalin ini menghasilkan inflamasi lokal dan nyeri (Banerjee, Sur, Mandal, Das, dan Sikdar, 2000). Menurut Tanko, Kamba, Saleh, Musa, dan Mohammed (2008), formalin menimbulkan fase nosiseptif sebagai fase awal dan fase inflamasi sebagai fase kedua. Selama fase kedua, formalin memicu terjadinya pelepasan serotonin, histamin, bradikinin, dan prostaglandin.
D. Virgin Coconut Oil (VCO) HealthyCo®
ini antara lain: asam kaproat, asam kaprilat, asam kaprat, asam laurat, asam miristat, asam palmitat, asam palmitoleat, asam stearat, asam oleat, asam linoleat, dan asam linolenat (The virgin coconut oil, 2010).
E. Eugenol
Eugenol memiliki titik didih 2530C dan titik lebur sebesar -90C. Senyawa yang berbau cengkeh ini mudah terbakar, memiliki kestabilan yang cukup tinggi tetapi akan mudah teroksidasi dengan adanya agen pengoksidasi yang kuat. Senyawa ini berbahaya bila ditelan dan memiliki LD50 sebesar 2680 mg/kg BB tikus. (MSDS, 2007). Gambar struktur eugenol:
Gambar 2. Struktur Eugenol (Bulan, 2004)
Eugenol (C10H12O2) merupakan isomer dari posisi betelfenol yang ditemukan di tanaman Myrtaceae dan Lauraceae. Eugenol berwarna kekuningan dan berbentuk cair. Senyawa ini sering digunakan sebagai wangi-wangian di bidang farmasi dan digunakan dalam pembuatan vanilin. Di dalam tumbuhan, eugenol terkadang ditemukan dalam bentuk glukosida yang dihasilkan dari proses hidrolisis, yaitu hasil fermentasi (Gildemeister, 2009).
Aibinu, Adenipekun, Coker, et al., 2008), dan antiinflamasi dengan menghambat pembentukan prostaglandin pada jalur COX-2 (Ozturk dan Ozbek, 2005).
F. Asetil Eugenol
Asetil eugenol (C12H14O3) merupakan senyawa turunan eugenol yang berwarna bening hingga kuning pucat dan memiliki konsistensi seperti minyak. Senyawa ini bersifat mudah terbakar dan dapat mengiritasi kulit serta toksik bila tertelan. Sinonim dari asetil eugenol adalah eugenol asetat, 1-asetoksi-2-metoksi-4-alilbenzena, 4-alil-2-metoksifenil asetat. Senyawa ini memiliki titik didih 281°C dan kerapatan 1,08 (Rdchemicals, 2006). Secara in vitro, asetil eugenol dapat menghambat agregasi dan metabolisme asam arakhidonat pada platelet manusia (Srivastava dan Maholtra, 1991). Menurut Hidalgo, et al. (2009), senyawa eugenol dan turunannya (termasuk di dalamnya adalah asetil eugenol) dapat menghambat peroksidasi lipid yang diinduksi oleh reaktif oksigen spesies serta dapat menghambat jalur COX-2 sehingga prostaglandin tidak terbentuk (Ozturk dan Ozbek, 2005).
Gambar 3. Struktur Asetil Eugenol (Rdchemicals, 2006)
G. Metode Pengujian Antiinflamasi
pengerat, uji edema pada kaki hewan pengerat, dan uji induksi artritis pada hewan pengerat (Evans dan Williamson, 1996).
Metode lain pengujian efek antiinflamasi dengan mengukur diameter edema pada kaki tikus yang diinduksi formalin 50µL 2,5% v/v setiap satu jam selama lima jam. Pengukuran diameter edema tersebut dilakukan menggunakan vernier caliper. Pengukuran dilakukan hingga jam ke-5 karena pada jam ke-5
tersebut terjadi penghambatan inflamasi yang signifikan setelah 5 jam dari pemberian ekstrak Newbouldia laevis (Tanko et al., 2008).
H. Landasan Teori
Inflamasi merupakan respon perlindungan tubuh terhadap kerusakan jaringan yang terjadi. Walaupun begitu, inflamasi sering menimbulkan rasa tidak nyaman bagi penderitanya. Formalin 0,5% sebanyak 0,025ml dilaporkan memiliki aktivitas inflamasi pada kaki mencit (Vogel, 2002), yang terbagi dalam dua fase, yaitu fase awal (0-5 menit) merupakan fase nosiseptif sedangkan fase kedua (20-30 menit) merupakan fase inflamasi (Lu et al., 2009). Penggunaan formalin lebih dipilih sebagai agen penginflamasi karena gejala-gejala inflamasi yang timbul lebih nyata bila dibandingkan dengan karagenin (Joseph, George, dan Nair, 2005). Hal ini dilihat dari edema yang timbul lebih besar dan lebih merah, sehingga akan lebih mempermudah dalam pengamatan.
β-caryophyllen dan eugenol sebagai komponen utama, α-humulen, eugenyl acetat,
dan α-copaen. Tiap-tiap komponen dalam minyak esensial tersebut saling mempengaruhi satu sama lain dalam menimbulkan efek antiinflamasi. Hidalgo et al. (2009) juga menyebutkan bahwa eugenol dan turunannya memiliki
kemampuan sebagai antioksidan yang dapat menghambat peroksidasi lipid yang diinduksi oleh reaktif oksigen spesies, sedangkan penelitian secara in vitro dari asetil eugenol terbukti dapat menghambat agregasi dan metabolisme asam arakhidonat dan mengganggu biosintesis prostaglandin yang merupakan senyawa penting dalam proses terjadinya inflamasi (Srivastava dan Maholtra, 1991).
Selain itu, bila dilihat dari strukturnya, asetil eugenol termasuk dalam kategori senyawa turunan diaril- atau aril/heteroaril-eter dan –tioeter yang bersifat lipofil dan asam serta memiliki struktur yang lebih besar dari induknya, sehingga berpotensi selektif COX-2 (Dannhardt dan Laufer, 2000). Dapat dikatakan bahwa asetil eugenol yang merupakan senyawa turunan dari eugenol ini berpotensi sebagai agen antiinflamasi topikal terhadap edema kaki mencit yang diinduksi oleh formalin 0,5 %.
I. Hipotesis
15
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian berjudul Efek Antiinflamasi Asetil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki yang Diinduksi Formalin 0,5% pada Mencit Jantan Galur Swiss ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak lengkap pola satu arah.
B. Variabel Penelitian 1. Variabel utama
Variabel utama dalam penelitian ini yaitu:
a. Variabel bebas : peringkat konsentrasi asetil eugenol b. Variabel tergantung : tebal edema pada kaki mencit 2. Variabel pengacau
a. Variabel pengacau terkendali:
1) Subyek uji : mencit jantan
2) Galur : Swiss
3) Umur subyek uji : 2-3 bulan 4) Berat badan subyek : 30-40 gram 5) Keadaan subyek : sehat
C. Definisi Operasional
1. Inflamasi adalah respon reflektif tubuh terhadap infeksi, ikatan antibodi terhadap antigen di dalam tubuh, iritasi mekanik, dan kerusakan jaringan. Gejala inflamasi ditandai dengan rubor, kalor, dolor, tumor, dan functiolaesa. Dalam hal ini yang diukur adalah edema (bengkak).
2. Asetil eugenol adalah senyawa hasil sintesis dari anhidrida asam asetat dengan eugenol (Riswanto, 2011).
3. Waktu pemberian senyawa antiinflamasi dilakukan secara topikal 1 jam setelah pemberian agen inflamasi (lampiran 5b).
4. Pengolesan secara topikal yaitu pengolesan senyawa secara merata ke seluruh permukaan udema kaki mencit selama ± 10 detik.
5. Tebal edema merupakan tebal telapak kaki mencit yang diukur menggunakan jangka sorong merk Mitutoyo.
(Ikawati, Supardjan, dan Asmara, 2007)
Keterangan:
(AUC0-6)positif : AUC0-6 rata-rata kelompok kontrol positif (cm.jam) (AUC0-6)negatif : AUC0-6 rata-rata kelompok kontrol negatif (cm.jam) (AUC0-6)perlakuan : AUC0-6 masing-masing mencit pada kelompok yang diberi senyawa uji (cm.jam)
D. Bahan atau Materi Penelitian 1. Bahan penelitian
a. Hewan uji
Hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit jantan galur Swiss berumur 2-3 bulan dengan berat 30-40 gram yang diperoleh dari Laboratorium Penelitian dan Pengujian Terpadu (LPPT), Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta dengan pembelian atas nama Paulina Maya Octasari (terlampir).
b. Formalin 0,5%
c. Eugenol
Eugenol murni merk Sigma Aldrich® didapatkan dari Laboratorium Kimia Organik Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan digunakan sebagai kontrol positif.
d. Asetil eugenol
Asetil eugenol yang digunakan sebagai senyawa uji didapatkan dari hasil sintesis Riswanto (2011) di Laboratorium Kimia Organik Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
e. VCO
VCO merk HealtyCo® dibeli di Apotek Sanata Dharma Yogyakarta dan digunakan sebagai pelarut eugenol dan asetil eugenol.
2. Alat penelitian
Alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini antara lain kotak kaca tempat pengamatan mencit, stopwatch merk Baby-G, timbangan merk Ohaus, alat-alat gelas, jangka sorong merk Mitutoyo.
E. Tata Cara Penelitian
1. Orientasi waktu pengolesan senyawa terhadap edema kaki mencit.
menggunakan paired T-test. Waktu yang menunjukkan nilai p<0,05 merupakan waktu optimum pengolesan.
2. Orientasi konsentrasi eugenol sebagai kontrol positif
Hewan uji dibagi menjadi 4 kelompok (masing-masing kelompok terdiri dari 3 ekor). Kelompok I sebagai kontrol edema (hanya diinjeksi formalin), kelompok II, III, dan IV masing-masing diinjeksi formalin 0,5% kemudian diolesi dengan eugenol 25% v/v, 50% v/v, dan 100% v/v. Hasil selisih edema diolah menjadi nilai AUC (Area Under Curve) total yang dihitung dari jam ke-0 sampai jam ke-6 dan kemudian dianalisis menggunakan One-Way ANOVA. Kelompok yang memiliki nilai p<0,05 akan digunakan sebagai kontrol positif.
3. Orientasi pelarut asetil eugenol
Mengambil 2 tetes asetil eugenol dan meneteskan tetes demi tetes pelarut menggunakan pipet tetes hingga asetil eugenol dapat bercampur homogen dengan pelarut.
4. Penentuan peringkat konsentrasi asetil eugenol
dengan VCO 1:1. Konsentrasi 25% v/v dibuat dari pencampuran asetil eugenol dengan VCO 1:3.
5. Pengelompokan hewan uji
Tiga puluh ekor mencit diukur ketebalan kaki kirinya menggunakan jangka sorong. Kemudian diinjeksikan formalin 0,5% secara subplantar pada kaki kiri yang sebelumnya telah diukur tebalnya.
Gambar 4. Skema Jalannya Penelitian Keterangan:
Kel. I : Kelompok Formalin 0,5%
Dari perlakuan tersebut hewan uji dibagi secara acak menjadi 6 kelompok besar, yaitu kelompok formalin 0,5%; kelompok kontrol negatif VCO; kelompok kontrol positif eugenol 50% v/v; kelompok asetil eugenol I, kelompok asetil eugenol II, dan kelompok asetil eugenol III. Setelah 1 jam dilakukan pengukuran ketebalan kaki mencit setiap kelompok. Kemudian segera setelah diukur, kelompok kontrol negatif kaki kiri mencit diolesi VCO, kelompok kontrol positif diolesi eugenol 50% v/v. Pada kelompok asetil eugenol I diberikan asetil eugenol 25% v/v, pada kelompok asetil eugenol II diberikan asetil eugenol konsentrasi 50% v/v, sedangkan pada kelompok asetil eugenol III diberikan asetil eugenol konsentrasi 100% v/v.
6. Pengamatan
Pengamatan dilakukan dengan cara mengukur ketebalan edema kaki kiri mencit setiap jam selama 6 jam menggunakan jangka sorong.
F. Tata Cara Analisis Hasil
1. Analisis hasil dilakukan dengan mengukur ketebalan edema kaki kiri mencit menggunakan jangka sorong.
2. Nilai selisih edema tiap jam diukur dan dihitung nilai AUC total masing-masing perlakuan.
3. Hasilnya dianalisis menggunakan uji Kolmorogorof-Smirnov, dilanjutkan analisis ANOVA satu arah taraf kepercayaan 95% dengan uji Scheffe.
22
Penelitian yang berjudul Efek Antiinflamasi Asetil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki yang Diinduksi oleh Formalin 0,5% pada Mencit Jantan Galur Swiss merupakan bagian dari suatu rangkaian penelitian besar yang bertujuan untuk mengetahui apakah dengan penambahan gugus asetil pada senyawa eugenol dapat memberikan efek antiinflamasi secara topikal. Asetil eugenol yang digunakan dalam penelitian ini merupakan hasil sintesis dari anhidrida asam asetat dengan eugenol dan senyawa hasil sintesis tersebut telah dibuktikan kebenarannya melalui elusidasi struktur oleh salah satu peneliti dari bagian sintesis, sehingga dapat dijamin bahwa senyawa yang peneliti gunakan benar merupakan asetil eugenol (Riswanto, 2011).
A. Orientasi Rentang Waktu Pengolesan Senyawa pada Edema Kaki Mencit, Orientasi Konsentrasi Eugenol sebagai Kontrol Positif, serta Orientasi
Pelarut dan Peringkat Konsentrasi Asetil Eugenol
1. Orientasi rentang waktu pengolesan senyawa pada edema kaki mencit Orientasi ini bertujuan untuk mengetahui kapankah waktu pengukuran kaki mencit yang tepat setelah injeksi formalin 0,5%. Dalam penelitian ini dipilih waktu pengolesan senyawa saat edema maksimal. Hal ini bertujuan untuk mengetahui dengan jelas efek penurunan edema kaki mencit setelah dioleskan senyawa uji. Bila senyawa uji dioleskan langsung setelah injeksi formalin 0,5%, masih dimungkinkan adanya peningkatan edema walaupun telah dioleskan senyawa antiinflamasi karena pada rentang waktu tersebut memang terjadi peningkatan edema.
Alasan penggunaan formalin dalam penelitian ini adalah karena formalin merupakan agen inflamasi yang bersifat bifasik (terdapat fase nosiseptif pada fase awal dan fase inflamasi pada fase berikutnya) dan cocok digunakan dalam pengujian antiinflamasi suatu senyawa (Tanko et al., 2008). Menurut Joseph, George, dan Nair (2005), formalin menimbulkan gejala-gejala inflamasi yang lebih nyata, terutama dalam hal edema yang lebih besar dan lebih merah bila dibandingkan dengan karagenin. Hal ini tentu saja menguntungkan dan akan mempermudah dalam pengamatan.
Coefficient of Varians (CV) ≤ 2%. Sebelum digunakan, jangka sorong diuji presisinya terlebih dahulu dengan cara mengukur tebal kaki mencit secara berulang sehingga didapatkan nilai CV berturut-turut 0,71%, 0,34% dan 0%. Dengan demikian jangka sorong yang digunakan dalam penelitian ini memenuhi syarat validitas alat ukur dan dapat dipertanggungjawabkan penggunaannya.
Tabel I. Hasil analisis paired T-test orientasi rentang waktu pengolesan setiap jam selama 5 jam pengamatan
Kelompok Tebal edema (cm)
X+SE I II III IV V
Kelompok I : Kelompok mencit yang diukur 1 jam setelah diinjeksi formalin 0,5%
Kelompok II : Kelompok mencit yang diukur pada jam kedua setelah diinjeksi formalin 0,5%
tb : Berbeda tidak bermakna
b : Berbeda bermakna
X : Rata-rata tebal edema
SE : Standar Error
Tabel II. Hasil analisis paired T-test orientasi rentang waktu pengolesan setiap 10 menit selama 1 jam pengamatan
Kelompok
tb : Berbeda tidak bermakna
b : Berbeda bermakna
X : Rata-rata tebal edema
SE : Standar Error
Hasil orientasi pada tabel III menunjukkan bahwa terjadi perbedaan yang bermakna pada menit ke-30 dan 40 serta menit ke-50 dan 60. Oleh karena itu dilakukan uji paired T-test lagi untuk menit ke-40 dan 60 sehingga didapatkan hasil bahwa terjadi perbedaan yang bermakna antara menit tersebut. Dari hasil tersebut, maka didapatkan waktu pengolesan senyawa pada edema mencit adalah 60 menit setelah injeksi formalin 0,5%.
menit ke-30 sampai menit ke-60 setelah injeksi formalin secara subplantar. Namun, peningkatan akan terus terjadi sampai menit ke-240 secara tidak signifikan.
2. Orientasi konsentrasi eugenol sebagai kontrol positif
Orientasi ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi berapakah dari eugenol yang paling efektif digunakan sebagai agen antiinflamasi topikal bagi edema kaki mencit pada penelitian ini. Penggunaan eugenol sebagai kontrol positif karena asetil eugenol merupakan turunan dari eugenol. Eugenol dilaporkan memiliki efek antiinflamasi yang berkaitan dengan penghambatan kerja enzim siklooksigenase-2 (Sadeghian et al., 2008). Namun belum ada data yang menyebutkan konsentrasi eugenol sebagai antiinflamasi topikal. Oleh karena itu, dilakukan orientasi konsentrasi eugenol sebagai kontrol positif. Peringkat konsentrasi eugenol yang diuji adalah eugenol 25% v/v, eugenol 50% v/v, dan eugenol 100% v/v.
Eugenol 100% v/v merupakan eugenol murni, sedangkan untuk membuat eugenol 50% v/v dan eugenol 25% v/v harus dilakukan pengenceran dengan pelarut yang cocok. Dalam penelitian ini digunakan pelarut VCO (Virgin Coconut Oil) merk HealthyCoR karena eugenol dan VCO memiliki sifat yang sama, yaitu sama-sama merupakan senyawa lipofil (minyak) sehingga memenuhi prinsip “like dissolve like”. Dari hasil orientasi pelarut ini, eugenol dapat bercampur dan larut
Tabel III. Hasil analisis AUC total ketiga peringkat konsentrasi eugenol menggunakan One-Way ANOVA taraf kepercayaan 95% dengan uji Scheffe Kelompok Tebal edema (cm)
X+SE I II III IV
Kelompok II : Kelompok mencit yang diolesi eugenol 25% v/v 1 jam setelah diinjeksi formalin 0,5%
Kelompok III : Kelompok mencit yang diolesi eugenol 50% v/v 1 jam setelah diinjeksi formalin 0,5%
Kelompok IV : Kelompok mencit yang diolesi eugenol 100% v/v 1 jam setelah diinjeksi formalin 0,5%
tb : Berbeda tidak bermakna
b : Berbeda bermakna
X : Rata-rata AUC total
SE : Standar Error
yang bermakna terhadap kelompok mencit yang diinjeksi formalin 0,5%. Hal ini berarti eugenol 50% v/v memiliki efek antiinflamasi karena terbukti secara statistik dapat menurunkan edema kaki mencit. Jadi, pada penelitian ini eugenol yang dapat digunakan sebagai kontrol positif adalah eugenol dengan konsentrasi 50% v/v.
3. Orientasi pelarut dan peringkat konsentrasi asetil eugenol
Orientasi ini bertujuan untuk mengetahui pelarut yang sesuai untuk asetil eugenol sehingga dapat diaplikasikan secara topikal. Asetil eugenol yang digunakan dalam penelitian ini merupakan hasil sintesis antara anhidrida asam asetat dengan eugenol. Asetil eugenol yang dihasilkan memiliki kemurnian 95,88%; berbentuk cair dan berwarna merah (Riswanto, 2011). Asetil eugenol merupakan senyawa turunan eugenol yang tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut non polar. Beberapa pelarut nonpolar yang dicoba untuk melarutkan asetil eugenol antara lain etanol 96% dan VCO.
kedua senyawa tersebut. Karena sifat dari etanol 96% yang mudah menguap dan terdapat kandungan air di dalam etanol 96% tersebut, maka etanol 96% tidak dipilih sebagai pelarut dari asetil eugenol.
Pelarut kedua yang diuji adalah VCO. Dari hasil percobaan, asetil eugenol dapat larut dengan baik dan homogen pada VCO. Hal ini disebabkan karena kedua senyawa tersebut memiliki kepolaran yang sama. Oleh karena itu, konsentrasi asetil eugenol tertinggi yang dapat dibuat adalah 100%. Dari konsentrasi tertinggi tersebut, dapat dibuat peringkat konsentrasi asetil eugenol yaitu 25% v/v, 50%v/v, dan 100% v/v. Faktor kelipatan yang digunakan antar konsentrasi eugenol adalah 2 kali.
B. Hasil Uji Efek Antiinflamasi Asetil Eugenol secara Topikal terhadap Edema Kaki Mencit yang Diinduksi oleh Formalin 0,5%
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui ada atau tidaknya efek antiinflamasi dari asetil eugenol dan untuk mengetahui berapakah besarnya penghambatan inflamasi dan daya antiinflamasi asetil eugenol yang dihasilkan. Besarnya daya antiinflamasi dari asetil eugenol dilihat dari besarnya kemampuan asetil eugenol untuk menurunkan edema kaki mencit yang dapat dilihat dari % daya antiinflamasi.
kesalahan pengukuran. Jangka sorong merk Mitutoyo ini memiliki rentang pengukuran 0-150 mm. Penyimpangan alat ini maksimal sebesar + 2µm sedangkan alat ini memiliki penyimpangan pengukuran + 1µm. Maka dapat dikatakan alat yang digunakan dapat dipertanggungjawabkan.
Dalam penelitian ini, tebal edema diukur tiap jam selama 6 jam. Setelah itu dihitung nilai AUC tiap jamnya kemudian dirata-rata, maka didapatkan profil seperti gambar 5.
Gambar 5. Grafik rata-rata tebal edema kaki mencit yang diinduksi formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan
negatif formalin dan VCO. Hal ini menunjukkan bahwa asetil eugenol 25% v/v memiliki aktivitas antiinflamasi yang hampir sama dengan kontrol positif eugenol 50% v/v dalam menurunkan tebal edema kaki mencit yang diinduksi oleh formalin 0,5%; sedangkan asetil eugenol 50% v/v dan asetil eugenol 100% v/v memiliki profil kemiripan dengan kontrol negatif yang berarti kedua konsentrasi asetil eugenol tersebut tidak memiliki aktivitas antiinflamasi. Hal ini dapat dilihat dari luas area dibawah kurvanya yang hampir sama dengan grafik formalin dan kontrol negatif VCO. Hal ini semakin diperkuat lagi dengan melihat hasil perhitungan statistiknya di tabel IV.
Tabel IV. Hasil analisis rata-rata nilai AUC total tebal edema kaki mencit yang diinduksi formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan menggunakan one way
ANOVA taraf kepercayaan 95% dengan uji Scheffe
Kel.
Kelompok I : Kelompok mencit yang diinjeksi formalin 0,5%
Kelompok II : Kelompok mencit yang diolesi VCO (Virgin Coconut Oil) setelah 1 jam diinjeksi formalin 0,5%
Kelompok III : Kelompok mencit yang diolesi eugenol 50% v/v setelah 1 jam diinjeksi formalin 0,5%
Kelompok IV : Kelompok mencit yang diolesi asetil eugenol 25% v/v setelah 1 jam diinjeksi formalin 0,5%
Kelompok V : Kelompok mencit yang diolesi asetil eugenol 50% v/v setelah 1 jam diinjeksi formalin 0,5%
Kelompok VI : Kelompok mencit yang diolesi asetil eugenol 100% v/v setelah 1 jam diinjeksi formalin 0,5%
tb : Berbeda tidak bermakna
b : Berbeda bermakna
X : Rata-rata AUC total
Tabel V. Nilai hasil uji Scheffe % penghambatan inflamasi yang diinduksi formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan
Kelompok kemudian setelah 1 jam diolesi eugenol 50% v/v
Kelompok II : Kelompok mencit yang diinduksi oleh formalin 0,5% kemudian setelah 1 jam diolesi asetil eugenol 25% v/v Kelompok III : Kelompok mencit yang diinduksi oleh formalin 0,5%
kemudian setelah 1 jam diolesi asetil eugenol 50% v/v Kelompok IV : Kelompok mencit yang diinduksi oleh formalin 0,5%
kemudian setelah 1 jam diolesi asetil eugenol 100% v/v tb : Berbeda tidak bermakna
b : Berbeda bermakna
X : Rata-rata persentase penghambatan edema kaki SE : Standar Error
Bila dilihat dari % penghambatan inflamasi masing-masing senyawa yang paling tinggi adalah asetil eugenol 25% v/v, yaitu sebesar 41,52%. Nilai % penghambatan inflamasi ini lebih tinggi daripada nilai % penghambatan inflamasi kontrol positif eugenol 50% v/v. Hal ini berarti asetil eugenol 25% v/v memiliki aktivitas antiinflamasi yang lebih bagus daripada kontrol positif eugenol 50% v/v.
eugenol 100% v/v tidak memiliki daya antiinflamasi, sedangkan asetil eugenol 25% v/v memiliki daya antiinflamasi walaupun kecil.
Tabel VI. Nilai hasil uji Scheffe % daya antiinflamasi yang diinduksi formalin 0,5% selama 6 jam pengamatan
Kelompok Rata-rata % daya antiinflamasi kemudian setelah 1 jam diolesi asetil eugenol 25% v/v Kelompok II : Kelompok mencit yang diinduksi oleh formalin 0,5%
kemudian setelah 1 jam diolesi asetil eugenol 50% v/v Kelompok III : Kelompok mencit yang diinduksi oleh formalin 0,5%
kemudian setelah 1 jam diolesi asetil eugenol 100% v/v tb : Berbeda tidak bermakna
b : Berbeda bermakna
X : Rata-rata persentase penghambatan edema kaki SE : Standar Error
Beberapa mekanisme penghambatan inflamasi yang dimiliki eugenol antara lain: menekan ekspresi COX-2 (Magalhaes et al., 2010) pada makrofag RAW 264,7 (Otzurk dan Obezk, 2005) dan menghambat kemotaksis leukosit yang dimiliki oleh setiap senyawa fenolik (Azuma, Ozasa, Ueda dan Takagi, 1986).
protein siklooksigenase kemudian menduduki sisi aktif enzim sehingga mencegah pelepasan mediator kimia inflamasi seperti prostaglandin (Amasino et al., 1996).
Gambar 7. Turunan diaril- atau aril/heteroaril-eter dan –tioeter (Dannhardt dan Laufer, 2000)
Gambar 8. Struktur Asetil Eugenol (Rdchemicals, 2006)
H2N O
OH
O O
O
asetil eugenol
valin
interaksi hidrofobik
Gambar 9. Interaksi antara asetil eugenol dengan valin
Menurut Evan (2008), dalam proses inflamasi juga terjadi pembentukkan oksigen reaktif akibat proses oksidasi asam arakhidonat. Senyawa fenol yang tersubstitusi akan membentuk radikal fenol dan berpotensi sebagai penangkap radikal bebas (Dannhardt dan Laufer, 2000). Asetil eugenol merupakan senyawa turunan eugenol dan merupakan senyawa fenol tersubstitusi. Asetil eugenol dapat berperan sebagai penangkap radikal bebas sehingga dapat menetralkan oksigen reaktif yang terbentuk selama proses inflamasi.
Menurut Hidalgo, et al. (2009) ada 2 macam bentuk radikal bebas yang dihasilkan oleh eugenol dan turunannya, yaitu radikal fenol dan radikal alil. Gugus fenol pada eugenol akan diubah menjadi radikal fenol. Radikal fenol lebih stabil karena adanya resonansi elektron yang terjadi pada ikatan rangkap yang terdapat pada cincin aromatis, sehingga menyebabkan terbentuknya radikal pada 2 posisi, yaitu: posisi ortho (o) atau posisi para (p) dari gugus fenol yang menempel pada cincin aromatis.
Radikal alil terbentuk akibat adanya gugus metoksi, gugus asetat, ataupun gugus nitro yang menempel pada cincin aromatis. Asetil eugenol memiliki gugus asetil dan gugus metoksi. Gugus metoksi merupakan donor elektron dan akan terstabilisasi akibat adanya resonansi pada cincin aromatis. Pada asetil eugenol, radikalnya terbentuk pada bagian alil. Hal ini disebabkan karena atom H pada alil tidak terikat kuat sehingga mudah lepas dan membentuk radikal. Radikal alil yang terbentuk kurang stabil bila dibandingkan dengan radikal fenol. Namun demikian, radikal alil ini masih dapat meredam radikal bebas yang terbentuk selama proses inflamasi.
eugenol mampu menjadi agen antiinflamasi topikal pada edema yang diinduksi formalin 0,5%.
C. Hasil Uji Hubungan Linearitas Konsentrasi Asetil Eugenol terhadap Daya Antiinflamasi yang Ditimbulkan
Gambar 11. Grafik hubungan linieritas log konsentrasi asetil eugenol 100% v/v, 50% v/v, dan 25% v/v dengan % penghambatan inflamasi dari masing-masing
perlakuan tersebut
42
A. Kesimpulan
1. Asetil eugenol konsentrasi 25% v/v, 50% v/v, dan 100% v/v memiliki efek antiinflamasi secara topikal terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
2. Asetil eugenol konsentrasi 25% v/v, 50% v/v, dan 100% v/v memiliki % efek antiinflamasi berturut-turut sebesar 41,52%; 16,96%; dan 9,04% terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
3. Asetil eugenol konsentrasi 25% v/v, 50% v/v, dan 100% v/v memiliki % daya antiinflamasi berturut-turut sebesar 8,23%; -30,32%; dan -42,74% terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss.
4. Konsentrasi efektif (EC50) asetil eugenol sebagai agen antiinflamasi topikal terhadap edema kaki yang diinduksi oleh formalin 0,5% pada mencit jantan galur Swiss adalah sebesar 15,45%
B. Saran
DAFTAR PUSTAKA
Amasino, A., Yuting Deng, Samuel Huang, Iris Lee, Adeyinka Lesi, Yaoli Pu, et al., 1996, COX-1 And COX-2 Enzymes Synthesize Prostaglandins and Are Inhibited by NSAIDS (Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs), Laporan Penelitian, University of Wisconsin-Madison.
Ayoola, G. A., F. M. Lawore, T. Adelowotan, I. E. Aibinu, E. Adenipekun, H. A. B. Coker, et. al., 2008, Chemical analysis and antimicrobial activity of the essential oil of Syzigium aromaticum (clove), African Journal of Microbiology Research, Vol.(2) pp, 162-166.
Azuma, Y., Ozasa, N., Ueda, Y., dan Takagi, N., 1986, Pharmacological Studies on the Anti-inflammatory Action of Phenolic Compounds, J. Dent. Res., 65: 53.
Babb, R. R., 1992, Gastrointestinal Complications of Nonsteroidal Anti-Inlammatory Drugs, West J. Med., 157, 444-447.
Banerjee, S., Sur, T. K., Mandal, S., Das, P. C., dan Sikdar, S., 2000, Assessment of The Anti-Inflammatory Effects of Swertia Chirata in Acute and Chronic Experimental Models in Male Albino Rats, Indian Journal of Pharmacology, 32: 21-24.
Bulan, R., 2004, Reaksi Asetilasi Eugenol dan Oksidasi Metil Iso Eugenol,
http://library.usu.ac.id/download/fmipa/kimia-rumondang.pdf, diakses
tanggal 21 November 2010.
Canon, K. E., Leurs, R., dan Hough, L. B., 2007, Activation of Peripheral and Spinal Histamine H3 Receptors Inhibits Formalin-Induced Inflammation and Nociception, Respectively, Pharmacol. Biochem. Behav., 88(1): 122–129.
Dannhardt, G., dan Laufer, S., 2000, Structural Approaches to Explain the Selectivity of COX-2 Inhibitors: Is There a Common Pharmacophore?, Current Medicinal Chemistry, 7, 1101-1112.
Evan, S. P., 2008, Antioksidan Alami di Sekitar Kita, http://www.chem-is-try.org/artikel_kimia/kimia_pangan/antioksidan-alami-di-sekitar-kita/, diakses tanggal 20 November 2010.
Evans, F. J., and Williamson, E. M., 1996, Selection, Preparation, and
Pharmacologicaly Evaluation of Plant Material, John Willey, New
Giersel, J. K., McDonald, J. J., Hauser, S. D., Rangwala, S. H., Koboldt, C. M., Seibert, K., 1996, A Single Amino Acid Difference between Cyclooxygenase-1 (COX-1) and -2 (COX-2) Reverses the Selectivity of COX-2 Specific Inhibitors, The Journal of Biological Chemistry, 271(26), 15810-15814.
Gildemeister, F., 2009, The Volatile Oil,
http://chestofbooks.com/health/aromatherapy/The-Volatile-Oils-Vol1/Eugenol.html, diakses tanggal 8 November 2010.
Goldstein, N. S., Ferkowicz, M., Odish, E., Mani, A., dan Hastah, F., 2003, Minimum Formalin Fixation Time for Consistent Estrogen Receptor
Immunohistochemical Staining of Invasive Breast Carcinoma, Am. J.
Clin. Pathol., 120:86-92.
Gunani, S. B., 2009, Uji Daya Antiinflamasi Krim Tipe A/M Ekstrak Etanolik Jahe 10% (Zingiber officinale Roscoe) yang Diberikan Topikal Terhadap Udem Kaki Tikus yang Diinduksi Karagenin, Laporan Penelitian, Surakarta.
Harijadi, 2009, Radang/Inflamasi, http://medicine.uii.ac.id/, diakses tanggal 12 Juli 2010.
Hasyim, M., Hamam, dan Akil, S., 2006, Formalin Bukan Formalitas, CP-Buletin, Nomor 73/Tahun VII.
Hidalgo, M. E., Rosa, C. D. L., Carrasco, H., Cardona, W., Gallardo, C., Espinoza, L., 2009, Antioxidant Capacity of Eugenol Derivatives, Quím. Nova, Vol. 32 No. 6.
Ikawati, Z., Supardjan, A. M., Asmara, L. S., 2007, Pengaruh Senyawa Heksagamavunon-1 (HGV-1) terhadap Inflamasi Akut Akibat Reaksi Anafilaksis Kutaneus Aktif pada Tikus Wistar Jantan Terinduksi
Ovalbumin, Laporan Penelitian, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah
Mada.
Joseph S. M, George M. C, dan Nair J. R, 2005, Effect of feeding cuttlefish liver oil on immune function, inflammatory response and platelet aggregation in rats. Current Sci., 88(3) :507-510.
Kee. J. L., dan Hayes. E. R, 1996 Farmakologi Pendekatan Proses Keperawatan, edisi 5, diterjemahkan Peter. A., Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 310-317.
Lu, T. C. Jung, C. L., Tai, H. H., Ying, C. L., Chia, Y. L., Yung, J. C., et al., Analgesic and Anti-Inflammatory Activities of the Methanol Extract from
Pogostemon cablin, eCAM,
http://ecam.oxfordjournals.org/cgi/reprint/nep183v1, diakses tanggal 21 Agustus 2010.
Maffetone, P., 2002, The ABCs of Chronic Inflammation, In Fitness and In
Healthy, pp. 1-10.
Magalhaes, C. B., Riva, D. R., DePaula, L. J., Brando-Lima, A., Koatz, V. L., Leal-Cardoso, J. H., Zin, W. A., dan Faffe, D. S., 2010, In vivo anti-inflammatory action of eugenol on lipopolysaccharide-induced lung injury, J. Appl. Physiol., 108: 845-851.
Moore, R. A., 2004, Topical Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs Are Effective in Osteoarthritis of the Knee, The Journal of Rheumatology, 1893-1895.
MSDS, 2007, Kemanan Data untuk Eugenol, http://msds.chem.ox.ac.uk/keamana data untuk eugenol.html, diakses tanggal 26 November 2010.
MSDS, 2002, Material Safety Data Sheet Ethanol 96%, http://www.ncpalcohols.com/MSDS/MSDS%20Light%20Spirit.pdf, diakses tanggal 16 November 2010.
Mulja, M. dan Hanwar, D., 2003, Prinsip – Prinsip Cara Berlaboratorium yang Baik (Good Laboratory Practice), Majalah Farmasi Airlangga, vol. III No. 2, Agustus 2003, halaman 71-76.
Ozturk, A., and Ozbek, H., 2005, Caryophyllata Essential Oil: An Animal Model
of Anti-inflammatory Activity, Department of Pharmacology, Van
Turkey.
Price, S.A. dan Wilson, L.M., 1995, Clinical Concept of Disease Processes, 4th edition, diterjemahkan oleh Anugerah, P., Penerbit Buku Kedokteran EGC, Jakarta, pp. 37.
Rang, H. P., Dale, M. M., Ritter, J. M., and Moore, P. K., 2003, Pharmacology,
5th edition, Bath Press, USA, pp. 231-237, 244-250.
Rdchemicals, 2006, Acetyl Eugenol,
Rhen, T. dan Cidlowski, J. A., 2005, Antiinflammatory Action of Glucocorticoids,
New Mechanisms for Old Drugs, The New England Journal of
Medicine, 353, 1711-23.
Riswanto, F. D. O., 2011, Sintesis Asetil Eugenol dari Eugenol dan Anhidrida Asam Asetat dengan Katalis Natrium Hidroksida, Skripsi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Sadeghian, H., Seyedi, S. M., Saberi, M. R., Arghiani, Z., dan Riazi, M., 2008, Design and Synthesis of Eugenol Derivatives as A Potent 15-Lipoxygenase Inhibitors, Bioorganic and Medicines Chemistry, 16: 890-901.
Schror, K. and Meyer-Kirchrath, J., 2000, Cyclooxygenase-2 Inhibition and Side-effects of Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs in the Gastrointestinal Tract, Curr. Med. Chem., 7, 1121-1129.
Setyarini, H., 2009, Uji Daya Antiinflamasi Gel Ekstrak Etanol Jahe 10% (Zingiber officinale Roscoe) yang diberikan Topikal terhadap Udem Kaki Tikus yang diinduksi Karagenin, 13-15, Skripsi, UMS, Surakarta.
Sompuram, S. R, Vani, K., Messana, E., and Bogen, S. A., 2004, A Molecular Mechanism of Formalin Fixation and Antigen Retrieval, Am. J. Clin. Pathol., 121:190-199.
Srivastava, K. C., Malhotra, N., 1991, Acetyl Eugenol, a Component of Oil of Cloves (Syzygium aromaticum L.) Inhibits Aggregation and Alters
Arachidonic Acid Metabolism in Human Blood Platelets, NCBI, 42(1),
73-81.
Tanko, Y., Kamba, B., Saleh, M. I. A., Musa, K. Y., Mohammed, A., 2008, Anti-nociceptive and anti-inflammatory activities of ethanolic flower extract of Newbouldia laevis in mice and rats, Healthy Synergies Publications, Vol. 1(3), pp. 13-19.
The virgin coconut oil, 2010, What is Virgin Coconut Oil?,
http://www.thevirgincoconutoil.com/articleitem.php?articleid=155, diakses tanggal 20 November 2010.
Vogel, 2002, Drug Discovery and Evaluation: Pharmacological Assays, 2nd
Lampiran 2.
b. Tabel hasil pengukuran presisi jangka sorong merk Mitutoyo
Kelompok
Tebal Kaki
Rata-rata SD CV(%) Rep I Rep II Rep III
I 0,282 0,284 0,28 0,282 0,002 0,71 II 0,292 0,29 0,29 0,291 0,001 0,34
III 0,286 0,286 0,286 0,286 0 0
Lampiran 3. Skema orientasi peringkat konsentrasi kontrol positif eugenol
Keterangan:
Kelompok I : Kelompok Kontrol Negatif Formalin 0,5%
Kelompok II : Kelompok mencit yang diinjeksi formalin 0,5% kemudian 1 jam sesudahnya diolesi eugenol 100%
Kelompok III : Kelompok mencit yang diinjeksi formalin 0,5% kemudian 1 jam sesudahnya diolesi eugenol 50%
Lampiran 5.
9 .03000 .03512 .02082 .02082 Most Extreme a. Test distribution is Normal.
Paired Samples Test
b. Orientasi rentang waktu pengolesan edema kaki yang diinduksi formalin 0,5% dengan pengukuran setiap 10 menit selama 1 jam
a. The correlation and t cannot be computed because the standard error of the difference is 0.
Paired Samples Statistics
a. Perhitungan Peringkat Konsentrasi Eugenol sebagai Kontrol Positif
Faktor pengali = = 2
Konsentrasi kedua= 2 x 25% = 50% v/v
b. Hasil Analisa Rata-rata AUC total Eugenol 25% v/v, 50% v/v, dan 100% v/v untuk Kontrol Positif menggunakan Metode Analisis One-Way ANOVA Tingkat Kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe.
Descriptive Statistics
N Mean
Std.
Deviation Minimum
Maximu m
AUCtota
l 12 .79042 .169551 .545 1.005
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
AUCtota l
N 12
Normal Parametersa Mean .79042
Std. Deviation .169551 Most Extreme
Differences
Absolute .193
Positive .193
Negatif -.160
Kolmogorov-Smirnov Z .668
Asymp. Sig. (2-tailed) .764
Multiple Comparisons
eugenol100 eugenol50 .225000 .087170 .163 -.07945 .52945
eugenol25 .101667 .087170 .722 -.20279 .40612
kontrol -.148333 .087170 .455 -.45279 .15612 eugenol50 eugenol100 -.225000 .087170 .163 -.52945 .07945
eugenol25 -.123333 .087170 .595 -.42779 .18112 kontrol -.373333* .087170 .018 -.67779 -.06888 eugenol25 eugenol100 -.101667 .087170 .722 -.40612 .20279
eugenol50 .123333 .087170 .595 -.18112 .42779 kontrol -.250000 .087170 .113 -.55445 .05445 kontrol eugenol100 .148333 .087170 .455 -.15612 .45279
eugenol50 .373333* .087170 .018 .06888 .67779 eugenol25 .250000 .087170 .113 -.05445 .55445 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.
AUCtotal
Lampiran 7. Perhitungan Peringkat Konsentrasi Asetil Eugenol Menggunakan Pelarut VCO
Faktor pengali = = 2
Konsentrasi kedua= 2 x 25% = 50% v/v
sehingga didapatkan ketiga peringkat konsentrasi asetil eugenol berturut-turut adalah 25% v/v, 50% v/v, dan 100% v/v.
Lampiran 8. Hasil Analisa Tebal Edema Kaki Mencit yang diinduksi Formalin 0,5% menggunakan General Linear Model tingkat kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe
Multivariate Testsc
b. The statistic is an upper bound on F that yields a lower bound on the significance level.
c. Design: Intercept + VAR00001 Within Subjects Design: tebal
Mauchly's Test of Sphericityb Measure:MEASURE_1
Tests the null hypothesis that the error covariance matrix of the orthonormalized transformed dependent variables is proportional to an identity matrix.
a. May be used to adjust the degrees of freedom for the averaged tests of significance. Corrected tests are displayed in the Tests of Within-Subjects Effects table.
b. Design: Intercept + VAR00001
Tests of Within-Subjects Effects
Error(tebal) Sphericity Assumed .065 120 .001
Greenhouse-Geisser .065 84.467 .001
Huynh-Feldt .065 120.000 .001
Lower-bound .065 24.000 .003
Tests of Within-Subjects Contrasts
(I) VAR00001 (J) VAR00001
ASETIL100% .01133 .014397 .986 -.04078 .06345
VCO FORMALIN .00133 .014397 1.000 -.05078 .05345
EUGENOL50% .06100* .014397 .014 .00888 .11312
ASETIL25% .07000* .014397 .004 .01788 .12212
ASETIL50% .02733 .014397 .614 -.02478 .07945
ASETIL100% .01267 .014397 .977 -.03945 .06478
EUGENOL50% FORMALIN -.05967* .014397 .018 -.11178 -.00755
VCO -.06100* .014397 .014 -.11312 -.00888
ASETIL25% .00900 .014397 .995 -.04312 .06112
ASETIL50% -.03367 .014397 .389 -.08578 .01845
ASETIL100% -.04833 .014397 .082 -.10045 .00378
ASETIL25% FORMALIN -.06867* .014397 .005 -.12078 -.01655
VCO -.07000* .014397 .004 -.12212 -.01788
EUGENOL50% -.00900 .014397 .995 -.06112 .04312
ASETIL50% -.04267 .014397 .160 -.09478 .00945
ASETIL100% -.05733* .014397 .024 -.10945 -.00522
ASETIL50% FORMALIN -.02600 .014397 .663 -.07812 .02612
VCO -.02733 .014397 .614 -.07945 .02478
EUGENOL50% .03367 .014397 .389 -.01845 .08578
ASETIL25% .04267 .014397 .160 -.00945 .09478
ASETIL100% -.01467 .014397 .956 -.06678 .03745
ASETIL100% FORMALIN -.01133 .014397 .986 -.06345 .04078
VCO -.01267 .014397 .977 -.06478 .03945
EUGENOL50% .04833 .014397 .082 -.00378 .10045
ASETIL25% .05733* .014397 .024 .00522 .10945
ASETIL50% .01467 .014397 .956 -.03745 .06678
Based on observed means.
MEASURE_1 Scheffe
VAR00001 N
Subset
1 2 3
ASETIL25% 5 .10400
EUGENOL50% 5 .11300 .11300
ASETIL50% 5 .14667 .14667 .14667
ASETIL100% 5 .16133 .16133
FORMALIN 5 .17267
VCO 5 .17400
Sig. .160 .082 .614
Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Based on observed means.
The error term is Mean Square(Error) = .001.
Lampiran 9. Hasil Analisa nilai AUC total masing-masing perlakuan menggunakan one way ANOVA tingkat kepercayaan 95% kemudian dilanjutkan dengan uji Scheffe
Descriptive Statistics
N Mean
Std.
Deviation Minimum
Maximu m
perlakuan 30 3.50000 1.737021 1.000 6.000
One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test
Std. Deviation 1.737021 .194899 Most Extreme
Differences
Absolute .139 .119
Positive .139 .077
Negatif -.139 -.119
Kolmogorov-Smirnov Z .764 .652
Asymp. Sig. (2-tailed) .604 .789
a. Test distribution is Normal.
ANOVA
(I) perlakuan (J) perlakuan
Mean
ASETIL100% FORMALIN -.072000 .077842 .971 -.35377 .20977
EUGENOL50% .265000 .077842 .075 -.01677 .54677
ASETIL50% .077000 .077842 .961 -.20477 .35877
ASETIL25% .316000* .077842 .021 .03423 .59777
ASETIL50% FORMALIN -.149000 .077842 .606 -.43077 .13277
VCO -.165000 .077842 .498 -.44677 .11677
EUGENOL50% .188000 .077842 .354 -.09377 .46977
ASETIL100% -.077000 .077842 .961 -.35877 .20477
ASETIL25% .239000 .077842 .134 -.04277 .52077
ASETIL25% FORMALIN -.388000* .077842 .003 -.66977 -.10623
VCO -.404000* .077842 .002 -.68577 -.12223
EUGENOL50% -.051000 .077842 .994 -.33277 .23077
ASETIL100% -.316000* .077842 .021 -.59777 -.03423
ASETIL50% -.239000 .077842 .134 -.52077 .04277 *. The mean difference is significant at the 0.05 level.
AUCtotal Scheffe
perlakuan N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3
ASETIL25% 5 .56900
EUGENOL50% 5 .62000 .62000
ASETIL50% 5 .80800 .80800 .80800
ASETIL100% 5 .88500 .88500
FORMALIN 5 .95700
VCO 5 .97300
Sig. .134 .075 .498
X 100%
X 100% Lampiran 10. Perhitungan nilai % penghambatan inflamasi pada kelompok kontrol eugenol 50% v/v; asetil eugenol 100% v/v, 50% v/v, dan 25% v/v
Salah satu contoh perhitungan nilai % daya antiinflamasi pada kelompok kontrol eugenol 50%
penghambatan inflamasi eugenol 50% I (%) = 0,973 – 0,520 0,973 = 46,56 %
penghambatan inflamasi asetil eugenol 100% I (%) = 0,907 – 0,720 0,907 = 26 %
Keterangan:
Kelompok I : Kelompok kontrol positif eugenol 50% v/v
Kelompok II : Kelompok kontrol positif asetil eugenol 100% b/v Kelompok III : Kelompok kontrol positif asetil eugenol 50% b/v Kelompok IV : Kelompok kontrol positif asetil eugenol 25% b/v
Kelompok Perlakuan
Persentase penghambatan inflamasi (%)
