PRINSIP DAN DASAR DASAR PENGUJIAN MIKROBIOLOGI

(1)

M-BRIO Training Proprietary – dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari PT. Embrio Biotekindo

PRINSIP DAN

DASAR

DASAR –

–

– DASAR

–

DASAR

PENGUJIAN

MIKROBIOLOGI

1

Pendahuluan

2

(2)

Sejarah Mikrobiologi

1. Penemuan jasad renik dan penemu

mikroskop oleh Antony van Leeuwenhoek

(1632-1723)

2. Teori abiogenesis oleh John Needham

(1713-1781)

3. Teori biogenesis oleh Lazaro Spallanzani

(1729-1799), John Tyndall (1870), Louis

Pasteur (1822-1895)

4. Penemuan proses fermentasi oleh Louis

Pasteur (1822-1895)

3

5. Teknik isolasi bakteri pada kasus penyakit

antraks oleh Robert Koch (1843-1910)

6. Koch dan rekan-rekannya mengembangakan

beberapa prosedur laboratorium seperti

mewarnai bakteri, membiakkan bakteri,

penggunaan media

(3)

Micros = kecil (renik); Bios = hidup; logos

= ilmu.

Mikrobiologi : ilmu tentang perikehidupan

organisme hidup yang sangat kecil yang

hanya dapat dilihat menggunakan

mikroskop.

Mikroorganisme

:

Bakteri, Protozoa, virus, algae, cendawan

5

Mikrobiologi

Morfologi sel bakteri

- Umumnya bakteri berukuran 0,5-1,0 x

2,0-5,0

μ

m.

- Bentuk bakteri : bola (kokus), batang

(basilus), spiral (vibrio).

- Penataan bakteri : berpasangan,

gerombol, rantai, atau filamen.

(4)

Morfologi Fungi

Ukuran khamir : lebar berkisar antara 1 –

5 μ

m, panjang 5 – 30

μ

m.

Bentuk khamir: bulat, elips, tidak

dilengkapi flagelum.

Khamir bersifat fakultatif

Kapang terdiri dari 2 bagian, yaitu

miselium (kumpulan beberapa filamen

>>hifa) dan spora.

Kapang bersifat fakultatif

7

(5)

MEDIA

Nutrisi yang dibutuhkan oleh mikroorganisme

untuk tumbuh.

-

Menghitung

-

Memperkaya

-

Identifikasi

-

koleksi mikroba

9

Syarat-syarat media :

Mengandung semua nutrisi yang digunakan oleh

mikroba.

Mempunyai tekanan osmosis.

Mempunyai pH yang sesuai dengan kebutuhan

mikroba.

Tidak mengandung zat yang dapat

menghambat pertumbuhan mikroba.

Harus dalam keadaan steril sebelum

digunakan.

(6)

Jenis-jenis media

1. Berdasarkan fisiknya :

a.

Media cair

b.

Media padat

c.

Media semi padat

11

1.Media Cair

Bentuk cair, tidak mengandung bahan

pemadat

Menumbuhkan/ membiakkan,

menyimpan kultur, uji kemampuan

fermentasi, pengayaan, dan pengujian

lain.

Nutrient broth, Brain Heart Broth, TS

Broth, Lactose broth, SC Broth, LE

Broth, dll.

(7)

2.

2. 2. Media

Media

Media Padat

Media

Padat

1,5 - 2 % Agar

Menumbuhkan mikroba, menyimpan kultur

untuk jangka waktu tidak terlalu lama,

mengisolasi dan menghitung mikroba.

Plate Count Agar, Potato Dextrose Agar,

Violet Red Bile Agar, Nutrient Agar, dll.

Tidak larut sempurna dalam air

Pencairan & Pemadatan terus menerus

menurunkan kekuatan agar

13

Bahan Pemadat

Agar

Rumput laut

-

Galaktan : polimer dari molekul galaktosa

(tidak dapat dipecah oleh MO)

Tidak digunakan sbg bahan makanan MO

Tidak berpengaruh thd karakteristik MO

Mix dengan medium broth sebelum sterilisasi

Mencair setelah pemanasan 90-100

0 _C

Memadat 40

0 _C

Digunakan pada suhu 45

0 _C

Jika lebih mikroba mati

(8)

Bahan Pemadat

Gelatin

- Polimer asam amino dari kolagen

-

12-15 %

-

Jarang digunakan

-

Mencair pada T di atas suhu ruang tidak

dapat diinkubasi pada T tinggi

-

Dapat dihidrolisis oleh sebagian bakteri

15

3.

3. 3. Media Semi

Media Semi

Media Semi Padat

Padat

0,5 % agar

Menyimpan kultur mikroba

Pertumbuhan MO menyebar ke seluruh

media tapi tidak mengalami pencampuran

sempurna.

Mencegah/menekan difusi oksigen

kondisi anaerob atau sedikit oksigen

Thioglycolate medium

(9)

Jenis-jenis media

2. Berdasarkan komposisi :

a.

Media alami : media yang tersusun

dari bahan-bahan alami, seperti

kentang, daging, telur, air kelapa, dll.

b.

Media semi sintesis : media yang

tersusun dari bahan-bahan alami dan

bahan-bahan sintesis, contohnya :

17

Pepton

10 gr

Ekstrak daging

10 gr

NaCl

5 gr

Aquadest

1000 ml

c. Media sintesis : media yang disusun dari

senyawa kimia, contohnya :

K2HPO4

0.5 gr

KH2PO4

0.5 gr

MgSO4. 7H2O

0.1 gr

NaCl

0.1 gr

FeSO4. 7H2O

0.01 gr

MnSO4. 7H2O

0.01 gr

18

(10)

3. Berdasarkan sifatnya :

a.

Media umum : media yang digunakan untuk

pertumbuhan satu atau lebih mikroba,

contohnya PCA, PDA, dll.

b.

Media pengayaan (enrichment) : media yang

berfungsi untuk mempercepat suatu bakteri,

contohnya RVS, TBB, Frasher, dll.

c.

Media selektif : media yang berfungsi

menumbuhkan bakteri tertentu dan

menghambat bakteri tertentu, contohnya Mc

Conkey, EMB, XLD, dll.

19

d.

Media diferensial : media yang digunakan

untuk pertumbuhan mikroba yang bertujuan

mengetahui sifat dari mikroba tersebut,

contohnya Mc Conkey Agar, BPA, dll.

e.

Media identifikasi : media yang digunakan

untuk mempelajari/membuktikan satu atau

lebih funsi metabolik khas dari mikroba yang

diperlukan untuk identifikasi, contohnya TSI

Agar.

(11)

Larutan Pengencer

Mengencerkan contoh yang akan dianalisa

atau mikroba yang akan ditumbuhkan (dilusi).

Mengandung buffer: mempertahankan

keseimbangan fisiologis mikroba.

PH netral = Larutan garam fisiologis 0.85%,

buffer fosfat (KH

2 PO

4 ), Buffered Peptone

Water.

PH basa = Alkaline Peptone Water

21

Bahan Tambahan Media

Indikator Asam-Basa

- Phenol Red

-

Neutral Red

Antibiotik

- Menghambat pertumbuhan mikroba

non-target/kontaminan

(12)

TEKNIK ASEPTIK

23

Teknik Aseptik

Suatu teknik yang dilakukan di laboratorium

mikrobiologi yang bertujuan untuk meminimalisasi

terjadi kontaminasi, yaitu dengan cara :

1. Menggunakan APD

2. Membersihkan meja kerja sebelum dan

sesudah dengan menggunakan desinfektan

3. Menggunakan Laminar Air Flow/Biosafety

Cabinet

(13)

Sterilisasi

Suatu proses untuk membunuh mikoba, baik sel

vegetatif maupun spora.

Beberapa teknik sterilisasi :

A. Mekanik/Filtrasi

-

0,22-0,45 µ

-

Bahan yang mudah rusak dengan pemanasan

25

B. Fisik

-

Pemanasan

• Pemijaran : ose, pinset,dll

• Panas Kering (oven,160-180

0 _{C selama 2 jam) : alat}

gelas

• Uap air panas bertekanan : autoklaf (121

0 _{C, 15 psi, 15 ‘)}

: medium

-Penyinaran

• UV, X, gamma, dll

• UV : membunuh mikroba pada permukaan LAF

C. Kimiawi

* Desinfektan : alkohol, formalin, khlor, dll

(14)

KULTUR MIKROBA

27

Prosedur

SR 02

Kelompok Resiko MO

Kultur Mikroba

Mengetahui sifat dari mikroba, harus

dipisahkan satu dengan yang lain dari

kutur campuran

Kultur Campuran : Biakan yang terdiri dari

lebih dari satu species

Kultur murni : biakan yang hanya terdiri

dari satu spesies tunggal.

(15)

Kultur Mikroba

Peremajaan kultur murni dengan memindahkan

ke medium baru Sub Kultur

Piaraan Kultur yang disimpan Stock Kultur

Kultur mikroba disimpan dalam L.Es pada T 4

0 _C

Dorman : tidak dapat tumbuh & berkembang

biak tetapi tidak mati

Bagaimana penanganan & pemeliharaan MO ?

29

Kultur Mikroba & Cara Isolasi

Kultur mikroba dapat dibekukan dengan cara

Liofilisasi

Isolasi mikroba adalah tehnik pemisahan/

pemurnian mikroba, dapat dilakukan dengan cara :

1. Isolasi pada medium agar dalam cawan

2. Isolasi pada agar tegak/ agar miring

3. Isolasi pada medium cair

(16)

Kultur Murni

Pelet (Lypo – disk)

Stik (kwik – stick)

Cultiloop

31

Berbeda cara penanganan

dan persiapannya

Faktor-Faktor yang Mempengaruhi

Pertumbuhan Mikroba

(17)

Sumber Nutrisi

Carbon

Nitrogen

Oksigen

Fosfor

Sulfur

Air

Hidrogen

Fe, Ca, Na, Mg, K

dll

T

E

R

G

A

N

T

U

N

G

Sifat MO

33

Waktu Reproduksi

Lag phase

_{Log phase}

Decline phase

Stationary phase

Fase Pertumbuhan Mikroba

(18)

Fase Pertumbuhan Mikroba

Lag

phase

Belum ada pertumbuhan populasi karena sel mulai

beradaptasi

dengan

medium

sehingga

siap

untuk

membelah diri.

Logaritma phase

Sel membelah diri dengan laju yang cepat & konstan.

Stationary phase

-Terjadinya penumpukan racun akibat metabolisme sel

- kandungan nutrien mulai habis

Decline phase

-Sel menjadi mati akibat penumpukan racun

- nutrisi habis, mengalami penurunan jumlah sel secara

eksponensial.

35

Aerob

Mutlak ada O

₂

Anaerob

Mutlak tidak ada O

₂

Mikroaerofil

Sedikit O

₂

Fakultatif

Ada/tidak O

₂

Kebutuhan

O

₂

Kebutuhan

O

₂

(19)

Aktivitas

Suhu

Psikrofil

0 – 30

0 _C

Mesofil

25 - 40

0 _C

Termofil

50 atau lebih 0

_C

37

Penggolongan Mikroorganisme

Suhu

Suhu dapat mempengaruhi mikroba dalam dua cara yang

berlawanan :

1)

Apabila suhu naik maka kecepatan metabolisme naik dan

pertumbuhan dipercepat dan Sebaliknya.

2)

Apabila suhu naik atau turun secara drastis, tingkat

pertumbuhan akan terhenti, komponen sel menjadi tidak aktif dan

rusak, sehingga sel-sel menjadi mati.

suhu yang berkaitan dengan pertumbuhan mikroorganisme

digolongkan menjadi tiga, yaitu :

1)

Suhu minimum : suhu yang apabila berada di bawahnya maka

pertumbuhan terhenti.

2)

Suhu optimum : pertumbuhan berlangsung paling cepat dan

optimum. (Disebut juga suhu inkubasi)

3)

Suhu maksimum : suhu yang apabila berada di atasnya maka

pertumbuhan tidak terjadi.

(20)

• Bakteri

:

6,5-7,5

• Y&M

: 3-4

PH

• Jumlah air yang

terikat dalam bahan

pangan

• Aw bakteri : 0,9

• Aw Y&M : 0,7

Aw

39

Kondisi lembab dan kadar air yang tinggi sangat menguntungkan untuk

pertumbuhan mikroba,,

Jumlah dan Jenis Mikroorganisme

dalam suatu produk tergantung pada

Jumlah dan Jenis Mikroorganisme

dalam suatu produk tergantung pada

Kondisi lingkungan (substrat, kadar air, pH,

dll).

Kualitas mikrobiologi tempat penanganan &

pengolahan (ruangan, personil, alat)

Kondisi pengemasan, penanganan,

(21)

TOTAL MIKROBA

BERDASARKAN KELOMPOK

Total mikroba

- Prinsip hitungan cawan menggunakan

Plate Count Agar (PCA) sebagai media

pemupukan.

- Semua bakteri, kapang, khamir dapat

tumbuh.

41

TOTAL MIKROBA

BERDASARKAN KELOMPOK

Total bakteri

- Perhitungan menggunakan Nutrient

Agar (NA), media yang mengandung

nitrogen, tetapi tidak mengandung

karbohidrat.

- Baik untuk pertumbuhan bakteri,

tetapi kapang dan khamir tidak dapat

tumbuh.

(22)

TOTAL MIKROBA

BERDASARKAN KELOMPOK

Total spora bakteri

- Perhitungan jumlah spora bakteri, suspensi

contoh dipanaskan terlebih dahulu untuk

membunuh sel vegetatif bakteri, kapang,

dan khamir maupun spora kapang dan khamir

- Jumlah spora dihitung menggunakan metode

hitungan cawan setelah contoh dipanaskan

pada suhu tertentu.

43

TOTAL MIKROBA

BERDASARKAN KELOMPOK

Total kapang dan khamir

-

Perhitungan jumlah kapang dan khamir dengan

metode hitungan cawan menggunakan media PDA

-

PDA merupakan suatu medium yang mengandung

sumber karbohidrat dalam jumlah cukup sehingga baik

untuk pertumbuhan kapang dan khamir, tetapi kurang

baik untuk pertumbuhan bakteri. Dengan menurunkan

pH PDA menjadi sekitar 3,5 pertumbuhan bakteri

terhambat disebut Acidified Potato Dextrose Agar

(APDA).

(23)

Keselamatan kerja di

Lab. mikrobiologi

45

46

Asumsi Dasar

Perlakukan semua MO sebagai yang memiliki potensi membahayakan

kesehatan manusia.

Yang Harus Dilakukan :

1. Cuci tangan terlebih dahulu dengan sabun sebelum bekerja

laboratorium.

2. Selalu menggunakan jas laboratorium yang bersih dan APD lainnya

selama berada di laboratorium.

3. Tidak makan, minum dan merokok di dalam laboratorium.

4. Sebelum mulai kerja, semprot tangan dengan alkohol 70 %.

5. Meja kerja dibersihkan dengan alkohol 70 % sebelum dan sesudah

bekerja.

6. Beri label pada kultur atau media (nama kultur/media, tanggal dibuat).

7. Sterilisasikan peralatan bekas kultur dan media yang sudah tercemar.

8. Jangan memipet dengan mulut.

9. Jika kultur atau media tumpah, segera dilap dengan alkohol 70 %.

10.Setelah selesai bekerja, semprot kembali tangan dengan alkohol 70 %

(24)

Teknik dasar

analisis

mikrobologi

47

1. Teknik Dilusi

• Sangat penting di dalam analisa mikrobiologi.

Hampir semua metode perhitungan jumlah

mikroba

mempergunakan

teknik

ini.

• _{1 : 10, 1 : 100, 1 : 1000, dst.}

• Kelebihan teknik ini adalah digunakan untuk

mendeteksi jumlah populasi mikroba yang

tinggi dengan pengenceran bertingkat.

(25)

49

2. Teknik Pour Plate

• Suatu teknik menumbuhkan mikroorganisme

pada media agar dengan cara mencampurkan

media agar yang masih cair dengan sample.

• Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC,

Y&M, Enterobacteriaceae, Coliform, dll.

• Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme

yang tumbuh dapat tersebar merata pada

media agar.

50

3. Teknik Spread Plate

• Suatu teknik menumbuhkan mikroorganisme pada media

agar dengan cara menuangkan sample di atas media agar

yang telah memadat dan diratakan menggunakan hockey

stick.

• Bedanya dengan pour plate adalah pencampuran sample

dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour

plate kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum

memadat).

• Teknik ini biasa digunakan pada uji S.aureus, B.cereus,

dll.

• Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh

dapat tersebar merata pada bagian permukaan media

agar.

(26)

51

4. Teknik Streak Plate

• Suatu teknik menumbuhkan mikroorganisme pada media

agar dengan cara menstreak (menggores) permukaan agar

yang

telah

memadat

dengan

jarum

ose

yang

telah

diinokulasikan dengan sample.

• Dengan teknik ini mikroorganisme yang tumbuh akan

tampak dalam goresan-goresan inokulum bekas dari streak

jarum ose.

• Teknik

ini

biasa

digunakan

pada

uji

Salmonella,

L.monocytogenes

, Vibrio, dll.

dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari

M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo

5. Teknik Transfer Aseptik

• Suatu teknik memindahkan atau mentransfer

sample dari satu medium ke medium lain secara

aseptik agar tidak terjadi kontaminasi.

• Teknik transfer aseptis, yaitu :

1)

Inoculating

(inokulasi) dengan jarum ose

2)

Pipetting

(mentransfer dengan pipet)

(27)

53

1)

Inoculating (inokulasi) dengan jarum ose

a) Bakar jarum ose dari bagian pangkal dalam

terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai

berpijar merah.

b) Biarkan selama beberapa detik sampai pijar

menghilang, kemudian segera ambil tabung

reaksi/cawan yang berisi MO.

c) Segera masukkan jarum ose ke dalam tabung

reaksi/cawan, lalu segera keluarkan dan lakukan

di dekat pembakar bunsen.

d) Jarum ose dibakar kembali untuk membunuh

bakteri yang sudah diinokulasikan.

54

2)

Pipetting (mentransfer dengan pipet)

a)

Gunakan pipet steril

b) Usahakan ketika memasukkan pipet yang berisi

sample ke dalam tabung/cawan petri jangan

sampai menyentuh dinding tabung/cawan dan

lakukan di dekat pembakar bunsen.

c) Ganti dengan pipet baru dalam melakukan dilusi

yang berbeda.

(28)

Pengambilan contoh

dalam

dalam uji mikrobologi

55

PENGAMBILAN CONTOH

DALAM UJI MIKROBIOLOGI

Prosedur Pengambilan Contoh

REPRESENTATIF

Peralatan Steril

Teknik Aseptik

o

Bahaya terhadap kesehatan

Organisme berbahaya sample semakin

banyak

(29)

Penetapan Penerimaan Produk

Sampel

defektif

:

Mengandung mikroorganisme berbahaya

Mengandung mikroorganisme dalam

jumlah lebih tinggi dari yang ditetapkan

57

The N