ISOLASI DAN ELEKTROFORESIS PROTEIN LAPORAN PRAKTIKUM
Untuk Memenuhi Tugas Matakuliah Teknik Analisis Biologi Molekuler Yang Dibimbing oleh Dra. Umie Lestari M.Si dan Prof. Dr. Agr. Moh. Amin
Oleh Kelompok 1
Anang Januardi (130342603494) Khilyatun Nafis (130342603476) Rizki Amalia N. K. (130342615332)
UNIVERSITAS NEGERI MALANG
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN BIOLOGI
BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Dalam perkembangan ilmu yang semakin maju dan berkembang saat ini kajian ilmu semakian lama semakin berkembang. Salah satunya dalam bidang ilmu biomolekuler yang disebabkan oleh teknologi – teknologi modern telah semakin modern. Salah satunya adalah isolasi pada protein menggunakan sampel dari protein spermamembran protozoa sapi.
Isolasi protein merupakan salah satu cabang ilmu genetika yang dapat dilakukan dengan cara dan bahan sederhana, hingga dengan teknologi modern. Pada dasarnya isolasi protein dapat dilakukan dari berbagai sumber, antara lain organ manusia, darah, daun, daging buah, kalus, akar batang, daging dan sisik ikan.
Elektroforesis merupakan sebuah proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
Elektroforesis dapat berlangsung dalam beberapa tipe berdasarkan medianya yaitu media gel dan media paper. Elektroforesis ini juga berguna dalam kehidupan manusia, misalnya : penentuan kadar kemurnian suatu protein, menganalisis protein plasma dan lain-lain. Elektroforesis juga dapat digunakan untuk memperkirakan berat molekul protein yang belum di ketahui.
Berdasarkan latar belakang tersebut maka dilakukan praktikum isolasi dan elektroforesis protein dengan tujuan untuk meningkatan dan mengembangkan ilmu pengetahuan terutama dalam kajian molekuler.
1.2 Tujuan
1.2.1 Untuk mengetahui mekanisme isolasi protein pada sperma sapi
1.2.2 Untuk mengetahui mekanisme elektroforesis protein pada sperma sapi 1.3 Manfaat
Hasil dari praktikum diharapkan dapat memberikan manfaat sebagai berikut: 1. Bagi Peneliti
a. menambah pengetahuan dan wawasan mengenai mekanisme isolasi protein dan elektroforesis pada sperma sapi
b. menambah ketrampilan dalam teknik pipeting dan cara kerja alat-alat yang digunakan pada isolasi protein dan elektroforesis pada sperma sapi
2. Bagi mahasiswa
a. menambah pengetahuan dan wawasan mahasiswa dalam ilmu genetika khususnya mengenai isolasi dan elektroforesis protein
BAB II
KAJIAN PUSTAKA 2.1 PROTEIN
Zahn et al. (2006) menyatakan bahwa komposisi protein plasma semen dan membran sperma bervariasi antar individu dan berhubungan dengan ketahanan sperma terhadap pembekuan. Selain itu protein plasma semen seperti osteopontin dan lipocalin-rumpun prostaglandin D synthase bervariasi antara pejantan. Komposisi
plasma semen tidak homeostatis dan bervariasi tidak hanya antar spesies, tetapi juga di antara individu dan antar ejakulasi dari hewan yang sama (Garner & Hafez 2000). Fungsi protein yang terdapat pada membran plasma spermatozoa antara lain adalah sebagai reseptor, antigen, signal transduksi dan stabilisasi ikatan kovalen penyusun protein membran plasma.
Protein membran spesifik spermatozoa digunakan sebagai dasar dalam estimasi hubungan kekerabatan, protein-protein tersebut diantaranya protein membran spermatozoa yang terekspresi di testis selama spermatogenesis, bukan protein-rotein yang terbentuk ketika spermatozoa berada pada saluran reproduksi jantan (epididimis, vesikula seminalis, kelenjar prostat, dan kelenjar cowper) (Johnson and Everitt, 2007). Pengamatan protein spesifik didasarkan pada karakter spermatozoa yang DNA stabil akibat ikatan disulfida yang kuat DNA dengan protamin sehingga spermatozoa tidak akan mengalami sintesis protein hingga spermatozoa membuahi sel telur. Oleh karena itu, susunan protein struktural membran spermatozoa tidak mengalami perubahan hingga spermatozoa membuahi ovum (Yu, 2008).
2.2 PRINSIP KERJA ISOLASI PROTEIN
Isolasi protein membran spermatozoa sapi. Isolasi merupakan suatu cara yang dilakukan untuk mengoleksi protein spermatozoa sapi dalam bentuk straw dengan bahan Semen sapi dalam straw, Larutan PBS (Phosphate Buffer Saline), BO Cafein, Larutan PBS-T (Phosphate Buffer Saline – Tween), dan RSB (Reducing Sample Buffer). Larutan PBS-T sebagai detergen yang digunakan untuk memisahkan ikatan protein dan fosfolipid pada membran spermatozoa. Hasil dari isolasi protein membran spermatozoa sapi ini berupa isolat protein. Selanjutnya melakukan perhitungan konsentrasi isolat protein dengan menggunakan nanodrop, kemudian melakukan elektroforesis SDS PAGE isolat protein membrane spermatozoa dengan bahan Protein marker Spectra TM Multicolor Broad Range Protein Ladder #SM1841, Akrilamid-Bis, Tris 1M pH 8,8, Tris 1M pH 6,8, SDS (Sodium Dedocyl Sulphate) 10
%, APS (Amonium Per Sulphate) 10 %. RSB (Reducing Sample Buffer), temed (N, N, N’, N’, -tetramethyl-ethylenediamine), Larutan RSB Non-reducing, larutan staining, larutan de-staining.
2.3 PRINSIP KERJA ELEKTROFORESIS PROTEIN
Elektroforesis adalah teknik pemisahan dari DNA, RNA, dan protein menggunakan arus listrik pada matrik gel. Dalam proses elektroforesis memerlukan gel atau agar yang digunakan sebagai medium. Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan dengan konsentrasi separating gel 12,5% dan stacking gel 3% menurut Lestari (2008). Metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa campuran protein secara kualitatif adalah SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis). Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untk memonitor pemurnian protein. Penggunaan SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai deterjen yang mengakibat ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu juga mercaptoetanol.
Prinsip elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel Reaction) teknik pemisahan protein darah dengan migrasi komponen acrilamida berdasarkan perbedaan berat molekul. SDS –PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamid gel electroforesis) adalah tehnik elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein laboratorium. Sampel protein denaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan SDS (yang merupakan detergen yang anionik) dengan akibat kompleks protein –detergen itu bermuatan negative dan protein yang lebih besar mempunyai muatan negative yang lebih besar. Kompleks protein detergen itu akan dibawa oleh medan listrik kearah kutub positif (Anoda). Gel akrilamid berfungsi sebagai dasar atau atau alas atas gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamid menentukan protein SDS.
Protein-protein dapat dipisahkan berdasarkan berat molekul. SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate – polyacrilamide gel electrophoresis) adalah teknik
elektroforesis yang sering digunakan dalam analisis protein di laboratorium. Sempel protein denaturasi (dipanaskan) dan dicampur dengan SDS (yang merupakan detergen yang anionik) dengan akibat kompleks protein-detergen itu bermuatan negatif dan protein yang lebih besar menpunyai muatan negatif yang lebih besar. Kompleks protein-detergen itu akan dibawa oleh medan listrik ke arah kutub positif (anoda). Gel akrilamide berfungsi sebagai dasar atau alas atas gerakan sampel protein. Konsentrasi akrilamide menentukan ukuran pori-pori gel dan ukuran pori-pori gel menentukan jarak yang ditempuh oleh kompleks protein-SDS. Jadi berapa faktor harus ditentukan untuk memaksimalkan pemisahan protein-protein melalui teknik SDS-PAGE (antara lain: kadar SDS, konsentrasi gel akrilamide dan ukuran gelnya, kemurnian sampel protein dan jumlah sampel yang diletakkan pada gel; voltage yang digunakan pada alat elektroforesis dan selama medan listrik dihidupkan).
2.4 GEL POLYAKRILAMIDE
Elektroforesis menggunakan gel poliakrilamida dilakukan pada medan gerak vertikal. Pembuatan gel poliakrilamida lebih sulit daripada gel agarosa karena gel poliakrilamida memiliki resolusi tinggi, membutuhkan biaya yang mahal, preparasinya lama, laju pemisahan fragmen lebih lambat serta bersifat toksik. Penggunaan poliakrilamida mempunyai keunggulan dibandingkan dengan gel lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matriks dengan sampel, sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang memungkinkan pemisahan protein secara sempurna. Selain itu, gel poliakrilamida ini mempunyai daya pemisahan yang cukup tinggi.
Dalam melakukan elektroforesis, sampel molekul yang akan dianalisis dimasukan ke dalam sumur (well) pada gel dan dimasukkan kedalam larutan penyangga misalnya TBE 1× atau TAE 1× kemudian dialirkan listrik dan molekul sampel akan bergerak menuju salah satu kutub listrik sesuai dengan muatannya. Misalkan asam nukleat, maka arah pergerakannya akan menuju elektoda positif karena muatan negatif pada rangka gula fosfat yang dimilikinya. Setelah proses
elektroforesis selesai maka selanjutnya dilakukan proses staining supaya molekul sampel yang sudah terpisah dapat dilihat
Terbentuknya gel ini tidak dilakukan dengan pemanasan, tetapi dengan mencampurkan larutan akrilamid dengan ammonium persulfat dan TEMED (N,N,N’,N’-tetramethyl ethylenediamine). Pencampuran ini akan mengakibatkan monomer akrilamid mengalami polimerisasi menjadi rantai panjang. Dengan penambahan senyawa lain N,N’-methylene bisacrylamide di dalam proses polimerisasi, terbentuk cross linked antar rantai panjang sehingga terbentuk gel yang tingkat porositasnya ditentukan oleh panjang rantai dan derajat penyilangan antar rantai (cross link).
Panjang rantai polimer akrilamid ditentukan oleh konsentrasi akrilamid di dalam reaksi polimerisasi (antara 3,5% dan 20%). Senyawa bisacrylamide yang berfungsi sebagai cross linker ditambahkan dengan perbandingan 1:29 terhadap akrilamid. Efektifitas pemisahan DNA di dalam gel poliakrilamid tergantung dari konsentrasi akrilamid. Gel poliakrilamid dapat disiapkan untuk elektroforesis sepanjang 10 cm sampai 100 cm, yang bergantung dari pemisahan DNA yang diinginkan dan elektroforesis dilakukan pada posisi vertikal (tidak horizontal seperti pada gel agarosa). Dibanding gel agarosa, gel poliakrilamid memiliki beberapa keuntungan, yaitu:
1. Resolusi dalam memisahkan DNA lebih tinggi sehingga panjang molekul DNA yang berbeda hanya satu nukleotida dapat dideteksi.
2. Gel poliakrilamid dapat menampung jumlah DNA yang labih besar daripada gel agarosa.
3. DNA yang diekstrak dari gel poliakrilamid bersifat sangat murni dan dapat digunakan untuk analisis lebih lanjut.
1. Gel poliakrilamid non-denaturasi untuk separasi dan purifikasi molekul DNA untai ganda (double stranded DNA). Gel ini digunakan untuk elektroforesis dalam larutan TBE (penyangga) dengan voltase rendah (1-8 V/cm) untuk mencegah terjadinya denaturasi (pembelahan) molekul DNA akibat panas yang ditimbulkan aliran listrik. Kecepatan migrasi molekul DNA untai ganda di dalam gel ini kira-kira berbanding terbalik dengan log10 ukuran molekul DNA. Kecepatan migrasi ini juga dipengaruhi oleh komposisi basa dan sekuen DNA. Jadi, dua molekul DNA yang berukuran persis sama mengalami migrasi dengan kecepatan yang berbeda sekitar 10%. Karena karakter yang demikian, gel ini tidak dapat digunakan untuk menentukan ukuran panjang molekul DNA untai ganda.
2. Gel poliakrilamid denaturasi untuk separasi dan purifikasi molekul DNA untai tunggal (single stranded DNA). Gel ini dibuat dengan mencampurkan senyawa kimia (urea atau dapat juga formamide) yang mencegah terjadinya penempelan antar nukleotida yang saling berkomplemen (base pairing). Alkali tidak dapat digunakan karena dapat mendeaminasi akrilamid sedangkan methylmercuric hydroxide juga tidak dapat digunakan karena dapat menghambat proses polimerisasi akrilamid. Migrasi molekul DNA untai tunggal di dalam gel ini sama sekali tidak terpengaruh oleh komposisi basa dan sekuen DNA. Sampai saat ini, gel jenis ini sering digunakan untuk isolasi DNA berlabel, analisis DNA hasil digesti enzim nuklease atau yang paling sering untuk mensekuen DNA (DNA Sequensing).
BAB III METODE 3.1 Alat dan Bahan
a. Alat
Tube
Mikropipet Incubator Freezer Nanodrop spektofotometer Komputer Heater
Tray elektroforesis horizontal
Uv transluminator
Vortex maxi mix II
Sonikasi Refrigerator Tabung falcon Plate elektroforesis Chamber elektroforesis Tabung ependrof Running elektroforesis Rotary shaker b. Bahan: Isolasi protein ml semen sapi PBS PBS-T Etanol absolut Tris cl Elektroforesis SDS-PAGE Akrilamid Bis 30% Tris 1,5 M pH 8,8 dH2O SDS 10% APS 10% Temed Aquades Tisu Tris 0,5 M pH 6,8 Running buffer Isolate protein Larutan RSB Larutan staining
3.2 Prosedur Kerja isolasi kritis
Isolasi Protein
divortex selama 10 menit Semen sapi diambil 2 mL
Ditambah dengan PBS dengan perbandingan volume semen : PBS yaitu 1 : 3
Divortex
Disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit
Supernatan dibuang, yang diambil hanya pellet jasa
Ditambah PBS-T yang mengandung 4 mM PMSF (1:5)
Divortex selama 10 menit
Disonifikasi 2 x 10 menit
Disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm. Selama 10 menit (2x) pada suhu 4o C
Elektroforesis Protein
1. Pembuatan separating gel 12,5 %
Dibuang pelletnya yang diambil substratnya
Ditambahkan dengan absolut dengan perbandingan 1:1
Dimasukkan dalam refrigenator selama 24 jam
Dimasukkan dalam refrigenator selama 24 jam
Disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm. Selama 10 menit (2x) pada suhu 4o C
Etanol absolut dibuang kemudian ekstrak dikeringkan selama overnight
Disimpan dalam suhu -20%
Disonifikasi 2 x 10 menit
Dilihat isolat proteinnya pada nanodrop
Bahan separating gel dicampurkan ke dalam tabung falcon dengan menggunakan mikropipet
2. Pembuatan separating gel 3 %
Larutan separating gel dimasukkan ke dalam rangkaian plate elektroforesis yang akan digunakan
Aquades diberikan di atas gel separating agar membentuk permukaan gel yang rata
Gel ditunggu sampai mengeras
Gel ditunggu sampai mengeras
Aquades dikeluarkan dengan menggundakan tisu
Aquades dikeluarkan dengan menggunakan tisu
Bahan separating gel dicampurkan ke dalam tabung falcon dengan menggunakan mikropipet
Larutan stacking gel dimasukkan ke dalam rangkaian plate elektroforesis yang akan digunakan
Sisir elektroforesis dipasang untuk membentuk sumuran sebagai tempat memasukkan isolat protein
3. Running Elektroforesis
Sisir elektroforesis dilepaskan dari gel.
Gel yang telah mengeras diletakkan ke dalam chamber elektroforesis.
Larutan running buffer dituang ke dalam chamber elektroforesis
Isolat protein dan larutan RSB dimasukkan ke dalam tabung eppendrof
Isolat yang sudah dipanaskan dimasukkan ke dalam sumuran gel
Running elektroforresis adalah voltage 130 V, kamir 100% kuat arus 60 mA
Rangkaian elektroforesis dilepas dan hasilnya dimasukkan ke dalam plastik
Larutan staining dimasukkan juga sampai roting
Larutan staining dibuang dan dimasukkan ke dalam destaining dan dishaking overnight
BAB IV PEMBAHASAN 4.1 Kesulitan atau Hal yang perlu diperhatikan a. Teknik pipeting
Karena masih pemula jadi belum begitu terampil dalam teknik pipetung sehingga dalam pengambilan larutan masih berbusa jadi ukuran larutan yang diambil kurang akurat. Selain itu pada tahap elektrosesis saat memasukkan pada sumuran juga masih sulit sehingga cairan ada yang keluar dari sumuran.
b. Ketelitian Praktikan
Dalam hal menaruh sampel yang berisi isolate protein lebih diperhatikan dengan hati-hati lagi agar isolate tidak rusak sehingga saat proses elektroforesis DNA dapat berhasil menghasilkan pita –pita DNA.
4.2 Fungsi Alat dan Bahan No
.
Nama Alat Fungsi
1. Lemari es / feezer Menyimpan sampel, bahan
isolasi dan bahan PCR
3. Vertical elektroforesis Elektroforsis hasil PCR
4. Kaca akrilamida Mencetak gel poliakrilamida
5. Magnetic stirer Menghomogenkan larutan
6. Gloves Mengurangi kontaminasi dari
tangan
7. Botol Duran Menyimpan larutan
8. Mikrosentrifuge Memisahkan molekul menurut
berat jenis
9. Vortex Menghomogenkan larutan
No. Nama Bahan Fungsi
1. SDS berfungsi untuk mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai deterjen yang mengakibat ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi dalam gel begitu juga mercaptoetanol.
2. Ammonium persulfate berfungsi sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan molekul akrilamida yang lainnya membentuk rantai polimer yang panjang.
3. TEMED berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerisasi
akrilamid menjadi gel poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein.
4. Bis‐akrilamida berfungsi sebagai cross‐linking agen yang membentuk kisi‐kisi bersama polimer akrilamida
5. Protein marker digunakan untuk mengidentifikasi berat molekul dari
campuran polypeptida (Hames dan Rickwood, 1990). Marker protein yang digunakan memiliki rentang beratmolekul 15 kDa - 250 kDa.
6. Brom Fenol Blue Berfungsi sebagai pewarna untuk memantau kecepatan molekul DNA pada gel.
7. Aquades Melepaskan gel poliakrilamid 8. Air deion Pelarut yang tidak mengandung ion 9. Gel polikarilamid Media untuk mengelektroforesis
10. Sodium Dedocyl
Sulfate (SDS) 10%
Memberikan ikatan negative pada protein sehingga menjadikannya berbentuk linear
presipitasi protein
12. EDTA berfungsi sebagai penghancur sel dengan cara mengikat ion magnesium yang diperlukan oleh sel untuk menjaga keutuhan selubung sel secara keseluruhan.
13. NaCl berfungsi sebagai bahan penetral pada gula fosfat DNA 14. Larutan PBS-T sebagai detergen yang digunakan untuk memisahkan ikatan
protein dan fosfolipid pada membran spermatozoa. 15. Tris Cl Sebagai larutaan penyangga (buffer)
16. PBS Larutan pencuci, garam fisiologis
17. PMSF Untuk menjamin agar sel protein yang diperoleh tidak dihirolisis oleh enzim proteolitik.
18. Separating gel Menghasilkan profil protein dengan berat molekul pada kisaran 6-200 kDa
19. Stacking gel Untuk mengelompokkan protein dengan berat molekul berbeda 20. RSB (Reducing Sample
Buffer)
Membantu memecah ikatan-ikatan protein 21. Gliserol 25 % Sebagai pemberat
22. β-mecaptoethanol Memotong ikatan
23. Larutan staining buffer Pemberiwarna pada pita-pita protein
24. Larutan destaining Sebagai pelarut warna yang berlebihan dari larutan staining buffer
4.3 Pembacaan Hasil
Berdasarkan isolasi protein yang telah dilakukan oleh kelompok 3 hari Rabu didapatkan hasil bahwa membran spermatozoa sapi sebanyak 1899 mg/mL.
Pada Elektroforesis protein terjadi pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul yang bermuatan negatif. Jika makromolekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui satu medium kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang bermuatan berlawanan maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif. Secara umum elektroforesis protein digunakan untuk memisahkan fragmen protein. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap massanya (Johnson, 2007).
BAB V PENUTUP
5.1 Kesimpulan
1. Isolasi protein dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan protein dari bahan lain seperti lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi protein ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan protein dari bahan padat seperti selulosa, serta pemurnian protein.
2. Elektroforesis protein merupakan suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Arif, Muhamad. 2012. PROFIL SDS-PAGE OUTER MEMBRANE PROTEIN Porphyromonas gingivalis (Penelitian Observasional Analitik in vitro). Skripsi. Bagian Periodonsia Fakultas Kedokteran Gigi. Universitas Jember. Bangun, Seri Rayani, & Lubis, Ichwan Alamsyah. Laporan Praktikum Isolasi Dna
Dari Darah Dan Ephitel,Pcr,Elektroforesis Agarose Dan Sds-Page.
Dewi, Dian Puspita, Handayani, Nursasi, Lestari, Umie. Analisis Protein Membran Spermatozoa Sapi Madura, Sapi Simental Dan Sapi Limousin Sebagai Pendekatan Hubungan Kekerabatan Sapi. Universitas Negeri Malang.
Garner DLE, Hafez SE. 2000. Sperm and Seminal Plasma. In: B Hafez & ESE Hafez. Reproduction in farm animal. 7th ed. Lippincott Williams & Wilkins. USA. hlm. 96-109.
Johnson, M. H. and Everitt, B. J. 2007. Essential Reproduction. Sixth Edition. Garshington Road UK: Blackwell Publishing.
Lestari, Umie. 2008. Karakterisasi Dan Spesifikasi Protein Membran Spermatozoa Manusia Dan Antibodi Hasil Induksinya Untuk Pengembangan Kandidat Bahan Imunokontrasepsi. Disertasi Tidak Diterbitkan. Malang: Pasca Sarjana Universitas Brawijaya Malang.
Lubis, Nita Andriani dan Gurusinga, Fery Prawira. 2013. Laporan Praktikum Isolasi DNA Manusia (Epitelial Mulut dan Darah) Dan Teknik PCR dan Isolasi Protein dari Darah, Elektroforesis Agarose dan SDS-PAGE.
Marques, V. A., Goulart, L.R. and Silva, A. E. D. F. 2000. Variation of Protein Profiles and Calcium and Phospholipase A2 Concentration in Thawed Bovine Semen and Their Relation to Acrosome Reaction. Genetics and Molecular Biology 23(4): 825-829
Nadgas, S.K., Buchanan, T. and MCCashill, S., Mackey, J., Alvarez, G. E. and Raychoudhury, S. 2013. Isolation of a Calcium Binding Protein of Acrosomal Membrane of Bovine Spermatozoa. Int J Biochem Cell Biol 45(4): 876-884 Rondena, M., Ceciliani, F., Comazzi, S., Pocacqua, V., Bazocchi, C., Luvoni, C.,
Chigioni, S. and Paltrinieri, S. 2006. Identification of Bovine Doppel Protein in Testis, Ovary and Ejaculated Spermatozoa. Theriogenology (63): 1195-1206 Yu, Yang. 2008. The Identification and Characterization of an Inner Acrosomal
Binding During Fertilization. Thesis tidak diterbitkan. Canada: Queen’s University Press.
Zahn FS, Papa FO, Melo CM. 2006. Blood Serum. Seminal plasma and sperm membrane protein profiles in stallions; are they corelated to semen freezability?. Anim Reprod Sci. 94:64-66.
