6
III.
MATERI DAN METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 1. Materi Penelitian
1.1 Bahan
Bahan yang digunakan antara lain daun salak [Salacca zalacca (Gaertn.) Voss]
kultivar ‘Kedung Paruk’, ‘Kalisube’, dan ‘Candinegara’. Kemikalia yang digunakan antara lain larutan fiksatf FAA, safranin 1%, alkohol (70%, 80%, 96%, 100%), cutex bening, akuades, parafin padat, xilol, gliserin 10%, entelan (Lampiran 1).
1.2 Alat
Alat yang digunakan antara lain gelas ukur, silet, botol flakon, pinset, pipet tetes, kaca objek dan kaca penutup, mikrometer okuler dan objektif, mikrometer square, kertas label, oven, kuas no. 2, staining jar, kertas tisu, kamera, alat tulis,
mikrotom rotary, mikroskop cahaya, skalpel, batang pengaduk, dan thermostat (Lampiran 1).
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Pengambilan sampel daun salak dilaksanakan di Kabupaten Banyumas di tiga lokasi antara lain Desa Kedung Paruk, Desa Kalisube, dan Desa Candinegara. Kabupaten Banyumas merupakan salah satu bagian wilayah Propinsi Jawa Tengah terletak diantara 108o39'17"- 109o27'15" Bujur Timur dan 7o15'05"-7o37'10" Lintang Selatan. Ketinggian wilayah di Kabupaten Banyumas sebagian besar berada pada kisaran 25-100 m dpl yaitu seluas 42.310,3 Ha dan 100-500 m dpl yaitu seluas 40.385,3 Ha. Berdasarkan letak geografis dan topologi tersebut, tanaman salak dapat dibudidayakan dan dikembangkan (BPS Kabupaten Banyumas, 2014). (Lampiran 2).
Pengamatan karakteristik anatomi daun dilaksanakan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman pada bulan Juni-September 2014.
7 3. Diagram Alir Penelitan
Pembuatan irisan daun membujur (segar)
Pembuatan melintang anatomi daun (metode parafin)
Analisis secara deskriptif
Karakteristik anatomi daun tiga kultivar salak
Kedung Paruk Kalisube Candinegara
Pembuatan preparat anatomi daun
Pengambilan sampel daun salak di Banyumas
Ukuran stomata Jumlah stomata Jumlah trikoma
Pengamatan karakter anatomi
Ketebalan kutikula Ketebalan epidermis Ketebalan mesofil
8 B. Metode Penelitian
1. Teknik pengambilan sampel
Metode yang digunakan pada penelitian ini adalah metode survai dengan teknik pengambilan sampel secara acak terpilih (purposive random sampling), daun yang dipetik adalah daun ke-5 dari pucuk. Sedangkan untuk pembuatan preparat anatomi dengan metode parafin (Sass, 1958) yang telah dimodifikasi. 2. Variabel penelitian
Variabel yang diamati berupa karakter anatomi daun dari ketiga kultivar salak lokal.
3. Parameter penelitian
Parameter yang diukur meliputi ketebalan kutikula, ketebalan epidermis, ketebalan mesofil, ukuran stomata, jumlah stomata per 1 mm2 luas epidermis daun, dan jumlah trikoma per 1 mm2 luas epidermis daun.
4. Cara kerja
a. Pengambilan Sampel Daun
Sampel daun dipilih yang masih muda dan segar, diambil anak daun kelima dari pucuk pada masing-masing kultivar dari tiga lokasi sebanyak 5 helai.
b. Pembuatan preparat anatomi daun
b.1. Pembuatan irisan daun membujur (segar)
Sampel daun salak dibuat preparat irisan membujur menurut Haryanti (2010) sebagai berikut:
Permukaan daun bagian bawahnya dibersihkan dengan tisu untuk menghilangkan debu/kotoran. Diolesi dengan kutek, dibiarkan selama 10 menit, supaya kering. Olesan yang sudah kering dikelupas atau diambil pelan-pelan, lalu ditempelkan pada gelas benda dengan media air. Diberi label pada sebelah kiri dengan keterangan jenis tanamannya.
b.2. Pembuatan Preparat irisan melintang dengan metode parafin Pembuatan preparat anatomi daun salak dilakukan dengan menggunakan metode parafin yang telah dimodifikasi menurut Sass (1958) adalah sebagai berikut:
b.2.1 Daun dipotong ± 1 cm menggunakan silet yang tajam. b.2.2 Fiksasi
9
Potongan daun tersebut kemudian di fiksasi kedalam botol flakon yang berisi larutan FAA (formalin 40% : alkohol 70% : asam asetat glasial = 0,5 : 9 : 0,5) selama 48 jam.
b.2.3 Dehidrasi
Setelah 48 jam larutan FAA dibuang lalu diganti alkohol dengan konsentrasi bertingkat atau semakin tinggi, yaitu alkohol 70%, alkohol 80 %, alkohol 90%, alkohol 96%, dan ethanol (dua kali) masing-masing selama 30 menit.
b.2.4 Dealkoholisasi
Irisan daun lalu dimasukan kedalam campuran ethanol:xylol = 3: 1, ethanol:xylol = 1:1, ethanol:xylol = 1: 3, xylol murni I, dan xylol murni II masing-masing selama 30 menit.
b.2.5 Infiltrasi
Potongan daun dimasukkan ke dalam campuran xylol/parafin 1:9 selama 24 jam di dalam oven dengan temperatur 60oC. Setelah 24 jam, campuran xylol/parafin 1:9 diganti dengan parafin murni selama 2 jam di dalam oven dengan temperatur 60oC.
b.2.6 Embedding
Proses embedding atau penyelubungan dilakukan dengan cara memasukan irisan daun ke dalam kotak kertas yang berisi parafin cair dengan posisi organ berada di tengah, dibiarkan sampai dingin dan membeku.
b.2.7 Sectioning/pengirisan
Blok parafin yang berisi irisan daun dilepaskan dari kotak kertas, dipotong lalu ditempel pada pegangan/holder menurut arah sayatan. Pasangkan pada mikrotom, pengirisan dilakukan dengan ketebalan
±10 μm.
b.2.8 Affixing/penempelan
Pita parafin diletakkan di atas gelas benda yang telah diolesi dengan campuran gliserin:albumin = 1:1, kemudian ditetesi akuades agar jaringan membentang setelah itu dikeringkan di atas thermostat dengan temperatur 450C.
10 b.2.9 Pewarnaan
Sebelum pewarnaan dilakukan deparafinisasi dengan cara object glass berisi pita parafin dimasukkan kedalam staining jar kemudian secaraberturut-turut dimasukan kedalam larutan xylol murni I, xylol murni II, campuran ethanol:xylol 1:3, ethanol:xylol 1:1, dan ethanol:xylol 3:1, kemudian dimasukan kedalam ethanol, alkohol 90%, alkohol 80%, dan alkohol 70% masing-masing selama 30 menit. Setelah itu object glass dimasukan ke dalam zat warna safranin 1% dalam alkohol 70% selama 1-2 jam, dicuci dengan alkohol 70%, kemudian object glass tadi berturut-turut dimasukan kembali ke dalam alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, ethanol, ethanol:xylol 3:1, ethanol:xylol 1:1, ethanol:xylol 1:3, xylol murni I, dan xylol murni II masing-masing selama 30 menit.
b.2.10 Mounting
Irisan daun pada object glass ditetesi dengan entelan dan ditutup dengan cover glass, kemudian diletakkan di atas thermostat pada suhu 450C sampai kering.
b.2.11 Pemberian label
Preparat diberi keterangan/identitas meliputi arah potongan melintang atau membujur, nama organ atau jaringan dan nama spesies.
b.2.12 Preparat diamati dibawah mikroskop. b.3 Kalibrasi
Mencari nilai skala mikrometer okuler menurut Sass (1951) adalah sebagai berikut:
b.3.1 Mikrometer okuler dipasang pada lensa okuler mikroskop, diatur hingga terlihat bayangan skala mikrometer okuler dengan jelas.
b.3.2 Mikrometer objektif dipasang pada meja objektif mikroskop, diatur hingga terlihat bayangan skala mikrometer objektif dengan jelas. b.3.3 Bayangan skala mikrometer okuler dan objektif kemudian dihimpitkan.
b.3.4 Jumlah skala mikrometer okuler dan objektif yang berhimpit tersebut kemudian dihitung 3-5 kali ulangan.
11
b.3.5 Jarak sesungguhnya antara kedua garis skala mikrometer dikalibrasi dengan rumus: X Sob = Y Sok
��� ��� = ��� = x ���
��� = x ��
Keterangan: Sob = skala mikrometer objektif Sok = skala mikrometer okuler
b.4 Pengukuran tebal epidermis, kutikula, dan tebal mesofil
Pengukuran dilakukan dengan meletakkan preparat pada meja preparat mikroskop kemudian dicari fokus bayangan preparat. Pengukuran tebal epidermis, kutikula dan mesofil, diukur dengan menggunakan mikrometer okuler yang diletakkan pada tabung lensa okuler pada mikroskop perbesaran 400x, diulang sebanyak 5x.
b.5 Pengukuran Stomata
Pengukuran dilakukan dengan meletakkan preparat pada meja preparat mikroskop kemudian dicari fokus bayangan preparat. Pengukuran stomata dilakukan dengan menggunakan mikrometer okuler yang diletakkan pada tabung lensa okuler pada mikroskop perbesaran 400x, diulang sebanyak 5x. b.6 Penghitungan jumlah stomata dan trikoma
Perhitungan dilakukan menurut Arisanti et al., (2010) yang telah dimodifikasi dengan menghitung jumlah stomata dan trikoma pada setiap epidermis bawah dengan memasang mikrometer square pada tabung lensa okuler. Preparat diletakkan di bawah lensa obyektif lalu dihitung jumlah stomata dan trikomata per 1 mm2 luas daun. Penghitungan dilakukan pada perbesaran 400x, diulang sebanyak 5x.
C. Analisis Data
Data yang diperoleh dianalisis secara deskrptif untuk menginterpretasi karakter anatomi daun ketiga kultivar salak lokal di Kabupaten Banyumas. (Lampiran 3).
