P E M E R I K S A A N
E L I S A ( E N Z Y M - L I N K E D I M M U N O S O R B E N T A SS AY )
Ratih Kartika Dewi, S.Si., M.Biomed.
Introduction
ELIS A
Enzym-Linked
Immunosorbent Assay
Kadar peptida Protein
Antibodi Hormon
Antigen
Antibody
Enzim
Immunoassay berasal dari kata
“immuno” (=secara imunologi) dan “assay” (=kemurnian suatu
substansi/jumlah konstituen dalam suatu campuran).
PROSEDUR UMUM ELISA
PENEMPELAN (COATING) ANTIGEN
BLOCKING (PENGEBLOKAN) ANTIGEN-ANTIBODI
ANTIBODI TERIKAT ENZIM
PENCUCIAN PLATE + SUBSTRATE
PENTING UNTUK DIPERHATIKAN !
1
2
Tahapan pencucian merupakan salah satu yang penting untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat dengan antigen
Pastikan agar tidak ada cairan pencuci yang tertinggal pada plate, karena akan mempengaruhi tahapan pemeriksaan selanjutnya
WARNA (NILAI OD) TERUKUR
Prinsip Dasar ELISA
1. Antigen/sampel ditambahkan ke plate
2. Blocking buffer ditambahkan untuk menghalangi tempat pengikatan protein
3. Tambahkan antibodi primer yang sesuai
4. Tambahkan konjugat antibodi sekunder-enzim yang sesuai yang mengenali dan berikatan dengan antibodi primer
5. Tambahkan substrat TMB yang akan dikonversi oleh enzim
menjadi bentuk yang terdeteksi
Komponen Penting dalam Imunoassay
Antibodi (antiserum) Antigen
Labeling material
Antibodi (antiserum)
Antibodi: protein yg diproduksi oleh sistem imun untuk melawan antigen
Suatu protein yang akan mengikat antigen. apabila kita
akan menilai kadar IL-12 dengan menggunakan ELISA
dari sampel serum,
selanjutnya akan ditambahkan antibody, maka antibody tersebut suatu protein yang
akan mengikat IL-12 atau dikenal dengan istilah anti-il-12
Antigen
Antigen: molekul yang menginduksi produksi antibodi ketika dikenali oleh tubuh
Apapun yang asing bagi sistem imun, misal: bakteri, virus, dll
Suatu protein yang akan dinilai kadarnya, yang berasal dari
sampel yang akan diuji.
Apabila kita akan menilai kadar IL-12 dengan menggunakan
ELISA dari sampel serum, maka IL-12 yang terdapat pada
serum kita istilahkan sebagai antigen
Labeling Material
Diperlukan adanya marker untuk mengetahui ikatan antigen-antibodi Marker tidak boleh mengganggu ikatan
Suatu protein yang akan dinilai kadarnya, yang diketahui kadarnya.
Apabila kita akan menilai kadar IL-12 dengan menggunakan ELISA dari sampel serum, maka standard ialah protein IL-12 yang telah diketahui kadarnya, misalnya kadar standard IL-12 ialah 100pg/ml. Umumnya standard ini akan dibuat menjadi beberapa konsentrasi, sehingga akan didapatkan grafik yang menggambarkan kadar standard VS nilai OD dari standard. Grafik tersebut akan digunakan untuk menghitung kadar pada sampel
Standard ELISA
Nilai OD (Optical density) → suatu nilai yang menggambarkan intensitas perubahan warna pada ELISA.
Komponen kit
Pre-coated, stabilized 96-well microtiter
Plate
Sample diluent Standard and controls
Conjugated detection antibody 10x wash solution
Substrate Stop solution
Keuntungan ELISA
Reagen, waktu simpan lama
Spesifitas dan sensitivitas ELISA tinggi
Mudah dilihat hasilnya dan prosedur cepat
ELISA dapat digunakan untuk berbagai infeksi
Kekurangan ELISA
Pengukuran aktivitas enzim jauh lebih kompleks dibandingkan pengukuran aktivitas dengan menggunakan radioisotop
Aktivitas enzim dapat terpengaruh oleh konstituen plasma
Kit tersedia secara komersial, tapi tidak murah
Sangat spesifik untuk antigen tertentu. Tidak akan mengenali antigen lain
Bisa terjadi positif/negatif palsu, terutama dengan antigen yang termutasi.
Prosedur
ELISA
Tahapan ELISA
1) Inkubasi dengan sampel uji
100 μL sampel uji atau standar dalam buffer ditambahkan ke tiap well.
Tutup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 2 jam.
2. Cuci
3. Lapisi well dengan antibodi
100 μL antibodi yang terlarut dalam buffer ditambahkan ke tiap well.
Tutup plate dan inkubasi pada 4 °C semalaman.
4. Cuci
Tahapan ELISA
5) Inkubasi dengan enzim-antibodi terkonjugasi
100 μL enzim-antibodi terkonjugasi dalam buffer ditambahkan ke tiap well.
Tutup plate dan inkubasi pada suhu ruang selama 1 jam.
Enzim-antibodi terkonjugasi akan berikatan dengan antigen.
Antibodi terkonjugasi bersifat spesifik untuk antigen yang diinginkan
6)Cuci
7)Pembentukan warna
100 μL substrat kromogenik ditambahkan pada tiap well.
Tutup plate dan inkubasi 15 menit, hingga terbentuk warna yang sesuai.
Plate sebaiknya dihindarkan dari cahaya selama inkubasi. 8)Penghentian pembentukan warna
Penghentian reaksi dengan menambahkan 100 μL 0.5M H2SO4 pada tiap well.
9. Membaca hasil
Baca hasil secara langsung melalui bagian bawah plate menggunakan fotometer (ELISA
reader) otomatis atau semi-otomatis. Panjang gelombang yang direkomendasikan antara 620- 650 nm.
Fluoresensi dalam ELISA
Saat cahaya dengan panjang gelombang tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks
antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi dengan menggunakan
spektrofotometer.
Spektrofotometer
Spektrofotometer : sebuah alat yang dapat mengukur jumlah dari cahaya yang menembus sumuran dari microplate.
Kompleks antigen-antibodi yang kita buat pada well microplate akan memberikan perubahan warna pada cairan tersebut, sehingga akan memberikan optical density yang berbeda.
Optical density dapat dinyatakan meningkat atau menurun berdasarkan pengenceran material standart, sehingga akan menghasilkan kurva dose- response yang nantinya akan digunakan untuk mengestimasi kadar protein tersebut.
