commit to user BAB III
METODE PENELITIAN
A. Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik dengan rancangan post test only control group design menggunakan hewan uji tikus jantan strain Wistar sebanyak 25 tikus yang dibagi menjadi 5 kelompok secara acak.
B. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di bagian UPT - Laboratorium Universitas Setia Budi, Surakarta dan Universitas Sebelas Maret pada bulan April-Mei 2018.
C. Populasi dan Sampel
Penelitian dilakukan dengan menggunakan hewan uji tikus jantan wistar dengan sampel sebanyak 25 yang diperoleh dari bagian Animal House bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Gajah Mada dan telah mengalami proses adaptasi selama 7 hari. Jumlah sampel yang digunakan ditentukan jumlahnya melalui rumus Federer (Federer, 1963), yaitu sebagai berikut:
(n-1) (t-1) ≥ 15
n= Besarnya sampel tiap kelompok t= Banyaknya kelompok
Penelitian ini menggunakan nilai t= 5 kelompok perlakuan sehingga perhitungan sampel menjadi:
(n-1) (5-1) ≥ 15 (n-1) 4 ≥ 15 4n ≥ 19 n ≥ 4,75 5
Sehingga, sampel yang digunakan tiap kelompok adalah 5 ekor dengan jumlah kelompok perlakuan 5 kelompok, sehingga jumlah total hewan uji yang digunakan dalam penelitian ini sebanyak 25 ekor tikus jantan Strain Wistar.
commit to user
D. Kriteria Inklusi dan Eksklusi Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah sebagai berikut :
a. Tikus sehat strain Wistar (Gogoi et. al, 2014 dan Ramos et. al, 2008) b. Jenis kelamin jantan
c. Umur 10-12 minggu
d. Berat badan sebelum perlakuan 200-220 gram
e. Tikus di pelihara dalam kandang dengan kondisi pencahayaan 12 jam terang dan 12 jam gelap
f. Mendapatkan makanan ad libiditum
Komposisi makanan dari makanan standar yang biasa dipakai yaitu: BW 1 (pakan tikus), dengan kandungan sebagai berikut :
1) air maksimal 12%
2) protein kasar 20%-22%
3) lemak kasar minimal 5%
4) serat kasar maksimal 5%
5) abu maksimal 7,5%
6) kalsium 0,09-0,1%.
7) fosfor 0,6%
8) cocciodiosat (+) 9) antibiotika (+)
g. Ditempatkan dalam kondisi dan situasi yang sama Kriteria eksklusi pada penelitian ini:
1. Tikus sakit selama masa adaptasi (7 hari) 2. Tikus mati selama perlakuan berlangsung.
E. Definisi Operasional Variabel 1. Variabel Bebas
Salep ekstrak daun beluntas (Pluchea Indica Less) dengan berbagai variasi.
Definisi: Salep ekstrak daun beluntas (Pluchea Indica Less) yang diperoleh dari daun beluntas yang dicuci, lalu dipotong menjadi potongan-potongan kecil dan dikeringkan sehingga berbentuk powder. Powder lalu ditambahkan pelarut metanol dan didiamkan selama 72 jam dan dibiarkan hingga menguap dengan evaporator dan
commit to user
di buat salep dengan penambahan vaselin album sesuai dengan konsentrasi yang diinginkan yaitu 20%, 40% dan 80%.
Nilai variasi: salep ekstrak daun beluntas dengan konsentrasi 20%, 40% dan 80%.
Skala pengukuran: ordinal
2. Variabel Terikat Penyembuhan luka
Definisi : Proses penyembuhan luka, nilai VAS (visual analog scale) diukur dengan dengan metode digital analisis melalui fotografi dan Image J. Pemeriksaan yang dilakukan untuk menilai efek pemberian ekstrak daun beluntas menggunakan pengamatan perbaikan klinis melalui pengukuran perbaikan luas luka. Kemudian, data yang didapatkan didokumentasikan menggunakan kamera digital Canon 16 megapiksel serta pengolahan data dengan progam Image J.
Langkah-langkah pengukuran luka menggunakan Image J : 1. Buka aplikasi Image J
2. Pilih gambar yang ingin dihitung luasnya dengan memilih “file” lalu “open” pilih gambar lalu “ok”.
3. Apabila gambar miring atau terbalik anda bisa pilih “image” kemudian
“transform” pilih rotasi mana yang sesuai untuk meluruskan gambar. Setelah gambar lurus, potong sisi gambar yang berlebih dengan cara pilih “Rectangular”
lalu sesuaikan dengan gambar yang ingin dipotong sisinya, jika sudah pilih
“image” kemudian “crop”.
4. Setelah itu pilih “magnifying glass” klik kiri pada gambar untuk memperbesar gambar. Kemudian pilih “straight” untuk memberi skala pada gambar misal 1 cm”. Kemudian kecilkan lagi gambar dengan klik kanan.
5. Pilih “analyze” lalu “set scale” lalu atur “known distance”: 1” dan unit of lenght : cm”.
6. kemudian pilih “image” dan ikuti tepi luka lalu pilih analyze dan measure (Sanchez J.A et. al, 2017).
Nilai variasi: terdapat perbaikan dan tidak tidak terdapat perbaikan.
Skala pengukuran: nominal
commit to user F. Tata Laksana Penelitian
1. Alat Penelitian
Peralatan yang diperlukan pada penelitian ini adalah:
a. Kandang tikus individual, satu kandang untuk satu tikus dengan ukuran standar (15 x 20 x 10 cm)
b. Alat timbang/neraca analitik c. Sarung tangan
d. Masker
e. Kertas milimeter f. Spidol waterproof g. Skalpel
h. Punch ukuran 1 cm i. Pinset
j. Benang Dermalon 4.0 k. Douderm ExtraThin®
l. Tabung untuk pemeriksaan histopatologi m. Spuit 1 cc
n. Marker/tinta cina
o. Kamera digital merk Canon 16 megapiksel 2. Bahan Penelitian.
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini:
a. Salep ekstrak daun beluntas (Pluchea indica Less.) b. Povidone iodine 10%
c. Formalin buffer 10%
d. Pakan tikus (BW 1) e. Aquabides
f. Alkohol 70%
g. Kassa steril
commit to user 3. Cara Penelitian
a. Pembuatan salep ekstrak daun beluntas
Pengumpulan dan keaslian materi daun beluntas Pluchea indica (L.) didapat dari PT. Kepurun Pawana Indonesia, industri tanaman dan agrobisnis, desa Kepurun Manisrenggo Klaten Jawa Tengah. Pembuatan ekstrak tanaman beluntas (Pluchea indica Less.) 20%, 40%, dan 80% dilakukan di UPT – Laboratorium Universitas Setia Budi, Surakarta.
Penanganan dan pengolahan bahan baku ekstrak daun beluntas dimulai dari pemetikan daun beluntas (Pluchea indica Less.). Pemetikan dilakukan saat belum terpapar matahari yaitu pagi hari sekitar pukul 06.00 wib, dipilih daun yang segar dan utuh. Dilakukan penyortiran dalam ruangan yang terlindung matahari, untuk mengurangi jumlah pengotor yang ikut terbawa dalam bahan. Hasil sortiran ditempatkan dalam wadah bersih. Tahap selanjutnya adalah perendaman bertingkat dalam 2 wadah dengan cairan steril (ringer laktat).
Daun beluntas yang sudah dicuci dengan direndam kemudian dikeringkan/ditiriskan dalam oven dengan suhu 40ᴼ-50ᴼ C lalu didiamkan.
Pembuatan ekstrak tanaman beluntas, yang berupa serbuk atau powder didapat dengan cara menggiling bahan baku dengan menggunakan mesin penepung (hummer mills). Untuk pembuatan powder digunakan ukuran 40-60 mesh.
Metode ekstraksi metabolit sekunder yang digunakan dalam penelitian ini adalah maserasi menggunakan pelarut metanol 1:10. Maserasi dilakukan sebanyak dua kali, pada maserasi pertama sebanyak 1 kg powder dicampur dengan pelarut matanol 7 liter lalu didiamkan selama 3 hari, hasil maserasi berupa ekstrak cair lalu ditampung dalam wadah. Proses maserasi kedua dilakukan dari hasil produk ampas maserasi pertama yang ditambahkan dengan metanol sebanyak 3 liter dan didamkan selama 12 jam. Hasil kedua ekstrak cair dari proses maserasi pertama dan kedua kemudian dicampur dan diaduk dengan alat ekstraktor selama minimal 2 jam. Setelah diaduk didiamkan 24 jam kemudian disaring sehingga dihasilkan ekstrak cair. Pelarut metanol diuapkan dengan rotary evaporator. Ekstrak yang diperoleh disimpan pada suhu 4oC sehingga hasil yang didapatkan konsistensinya
commit to user
semisolid dan ditambahkan vaselin album sesuai yang dibutuhkan untuk membuat konsentrasi salep 20%, 40%, dan 80%. (Yuliani et.al, 2015 dan Pramanik dan Chartterjee, 2008). Pemilihan sediaan dengan menggunakan salep dikarenakan efek oklusif yang dimilikinya sehingga dapat meningkatkan absorpsi dan menambah efektivitas dari zat aktif obat tersebut dan dengan menggunakan preparat semisolid ini dapat membentuk lapisan film pada kulit yang berfungsi sebagai pelindung (Garg Tarun et.al, 2014).
b. Pembagian Kelompok Hewan Uji
Hewan uji tikus strain Wistar sebanyak 25 ekor dikelompokkan menjadi 5 kelompok secara acak dengan jumlah masing-masing kelompok adalah 5 ekor tikus. Kelompok-kelompok tersebut akan diberi perlakuan sebagai berikut:
kelompok A akan diberi salep ekstrak daun beluntas 20% pada luka, kelompok B diberi salep ekstrak daun beluntas 40% pada luka, kelompok C diberi salep ekstrak daun beluntas 80% pada luka, kelompok D diberi basis salep yaitu vaselin album dan kelompok E tanpa perlakuan.
c. Prosedur Pembuatan Luka
Tikus diberikan anestesi umum dengan ketamin intra muskular dengan dosis 10 mg/kgBB, setelah teranestesi area punggung yang akan dibuat luka dicukur dan dibersihkan dengan alkohol 70 % dan povidone iodine 10%. Kemudian dibuat luka full thickness dengan menggunakan biopsi plong berukuran 1 cm dengan ukuran dan kedalaman yang sama. Perdarahan dikontrol dengan cara menekan menggunakan kassa steril pada lesi.
d. Perlakuan Penelitian
Setelah luka dibuat pada punggung tikus dengan biopsi plong 1 cm, lalu pada punggung tikus dilakukan pamasangan fiksasi dengan menggunakan Duoderm Extrathin® yang dibentuk seperti donat lalu dijahitkan dengan kulit sekitar luka menggunakan Dermalon 4.0. Setelah itu dilakukan perlakuan sesuai kelompok:
kelompok A diberi salep ekstrak daun beluntas 20% pada luka, kelompok B diberi salep ekstrak daun beluntas 40% pada luka, kelompok C diberi salep ekstrak daun beluntas 80% pada luka, kelompok D diberi basis salep (vaselin album) dan kelompok E tanpa perlakuan. Perlakuan dioleskan satu kali sehari paska pembuatan luka dan luka dibiarkan terbuka (tidak ditutup).
commit to user e. Pengukuran Hasil Uji
Pada hari ke 0, 14, 21 dan 28. Pengukuran luka dilakukan menggunakan kertas milimeter dan didokumentasikan dengan kamera digital Canon 16 megapiksel dalam kondisi cahaya dan jarak pemotretan yang sama yaitu 30 cm (penggunaan penggaris). Hasil foto dokumentasi lalu dianalisa dengan program Image J. Dalam program tersebut luas luka dalam ukuran piksel diubah menjadi centimeter.
G. Kelaikan Etik Penelitian
Penelitian telah mendapatkan izin dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan RSUD Dr. Moewardi Surakarta dengan nomor 918/X/HREC/2017.
commit to user H. Alur Penelitian
Gambar 6. Alur Penelitian Tikus jantan 25 ekor (Wistar, BB 200 gram-220 gram)
Pada area punggung tikus dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70% dan povidine iodine 10% dan kassa steril lalu dilakukan pencukuran dan
Dibuat luka dengan biopsi plong ukuran 1 cm dan pemasangan donat pada punggung tikus.
Luka diukur dengan kertas milimeter dan didokumentasikan dengan kamera digital Canon 16 MP lalu diolah dengan program Image J (hari ke 0).
Kelompok B (n=5) Salep ekstrak daun
beluntas 40%
Kelompok A (n=5) Salep ekstrak daun
beluntas 20%
Kelompok C (n=5) Salep ekstrak daun
beluntas 80%
Kelompok E (n=5) Tanpa perlakuan
Pada hari ke 0, 14, 21 dan 28
Dilakukan pengukuran luas luka dengan kertas milimeter dan didokumentasikan dengan kamera digital Canon 16 MP, lalu data yang telah didokumentasikan diolah
dengan program Image J.
Analisis data dengan one way Anova
Kelompok D (n=5) Basis salep (Vaselin album)
Pengolesan dilakukan satu kali sehari sehari paska pembuatan luka
commit to user I. Analisa Hasil Penelitian
Uji statistika one way analysis of variance (ANOVA) adalah sebuah analisis statistik yang menguji perbedaan rerata antar kelompok dan sering digunakan pada penelitian eksperimen dimana terdapat beberapa perlakuan. Uji statistik ini dilakukan setelah sebelumnya dilakukan uji normalitas dan uji homogenitas yang bertujuan untuk mengetahui sebaran data apakah normal atau tidak normal secara analitik. Bila dari uji normalitas dan homogenitas didapatkan distribusi yang tidak normal dan tidak homogen maka akan digunakan uji non-parametrik Kruskal-Wallis. Bila terdapat perbedaan yang signifikan dilanjutkan dengan uji Mann Whitney.
J. Jadwal Penelitian
Oktober 2017 April 2018 Mei 2018
Minggu ke- 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Proposal penelitian
* *
Ethical clearance
* *
Pelaksanaan penelitian
* * * *
Pengolahan data
* *
Diskusi dan Pembahasan
*
Laporan *
