BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini menggunakan dua rancangan penelitian, yaitu : deskriptif eksploratif dan eksperimental. Penelitian deskriptif eksploratif meliputi isolasi dan identifikasi, sedangkan peneelitian eksperimental meliputi uji aktivitas antikanker.
Penelitian eksperimen bertujuan untuk menyelidiki hubungan sebab akibat (cause and effect relationship), dengan cara mengekspos satu atau lebih kelompok eksperimental dan satu atau lebih kondisi eksperimen. Hasilnya dibandingkan dengan satu atau lebih kelompok kontrol yang tidak dikenai perlakuan. Adapun tahapan dari penelitian ini yaitu : penyiapan bahan, isolasi minyak atsiri dengan destilasi uap, uji aktivitas antikanker, dan identifikasi senyawa antikanker dengan menggunakan GC- MS.
4.2 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pengembangan Sumberdaya Genetik Kelautan dan Rekayasa Genetik Universitas Udayana. Uji antikanker terhadap sel mieloma dilakukan di Laboratorium Virologi Kedokteran Hewan Universitas Udayana, sedangkan uji antikanker terhadap sel HeLa dilakukan di Laboratorium LPPT Universitas Gajah Mada Yogyakarta dan analisis GC-MS dilakukan di Laboratorium Kimia Organik FMIPA Universitas Gajah Mada Yogyakarta.
26
4.3 Bahan dan Peralatan Penelitian 4.3.1 Bahan objek penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah rimpang temu putih (Curcuma zedoaria (Berg.) Roscoe) yang diperoleh dari Puri Damai Ubud, Bali.
Penyiapan bahan meliputi determinasi tanaman yang dilakukan di UPT Balai Konversi Tumbuhan Kebun Raya Eka Karya Bali, pengumpulan bahan, pembersihan, dan pemotongan bahan. Bahan biologi sebagai uji toksisitas adalah larva udang (Artemia salina Leach), bahan untuk uji antikanker menggunakan sel mieloma mencit tipe P3UI, untuk sel HeLa menggunakan sel tumor serviks (human servical cell line), HeLa.
4.3.2. Bahan kimia
Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuades, dimetil sulfoksida (DMSO), kalsium klorida anhidrat (CaCl2), dan ragi. Media bubuk kultur RPMI 1640 mengandung HEPES, sel mieloma mencit tipe P3UI, sel HeLa, FBS serum, dan Trypan Blue.
4.3.3 Alat penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pisau, timbangan, seperangkat alat destilasi uap (destilasi stahl), botol tempat minyak atsiri, aluminium foil, neraca analitik, pipet mikro, pipet volume, pipet tetes, tabung reaksi, mikropipet, multiwell plate (24 well), culture flask (25 cm), culture flask (75 cm), pippetes tip (1 mL), pippetes tip (10 mL), dan filter paper, dan seperangkat alat GC-MS.
4.4 Metode Penelitian 4.4.1. Penyiapan bahan
Rimpang temu putih dikumpulkan dari pasar Badung dan dicuci sampai bersih untuk menghilangkan tanah yang menempel pada rimpangnya kemudian ditiriskan.
Setiap kali akan melakukan destilasi, rimpang tersebut dipotong menjadi bagian- bagian kecil.
4.4.2. Isolasi minyak atsiri dengan destilasi uap
Metode yang digunakan adalah destilasi uap (destilasi stahl). Rimpang temu putih sebanyak ± 20 kg didestilasi secara bertahap sebanyak 4 kali, dengan setiap kali destilasi menggunakan ± 5 kg rimpang temu putih. Rimpang temu putih dipotong kecil-kecil kemudian dimasukkan ke dalam dandang yang telah berisi air. Dandang yang digunakan dilengkapi dengan kondensor, kemudian dipanaskan dengan api kecil. Dengan menggunakan destilasi stahl, minyak dapat langsung terpisah dari air, namun minyak perlu dibebaskan lagi dari sisa-sisa air dengan menambahkan CaCl2
anhidrat untuk mengikat air. Minyak atsiri yang diperoleh dapat digunakan untuk uji toksisitas terhadap larva Artemia salina L, uji antikanker secara in vitro terhadap sel mieloma mencit dan sel HeLa, kemudian dianalisis menggunakan GC-MS.
4.4.3 Uji toksisitas dengan bioindikator larva Artemia salina Leach
Minyak atsiri rimpang temu putih diuji toksisitasnya dengan menggunakan larva Artemia salina Leach. Uji toksisitasnya dilakukan dengan menempatkan sejumlah air laut dalam akuarium yang tersekat menjadi dua bagian yaitu satu bagian dibuat gelap yang ditutup dengan kertas hitam dan bagian yang lain dibiarkan terbuka. Telur udang diletakkan secukupnya pada bagian yang gelap dan disimpan
pada tempat yang memiliki penerangan yang cukup selama 48 jam sehingga telur menetas dan siap digunakan untuk pengujian.
Pengujian dilakukan dengan mengambil sebanyak 20 mg minyak atsiri rimpang temu putih kemudian dilarutkan dengan etanol sehingga volumenya menjadi 2 mL. Dari larutan ini diambil 500 µL, 50 µL, dan 5 µL, kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing tabung reaksi dan pelarutnya diuapkan selama 24 jam. Ke dalam masing-masing tabung reaksi dimasukkan sedikit air laut, 50 µL dimetilsulfoksida (DMSO), setetes ragi, 10 ekor larva udang, kemudian ditambahkan air laut sampai volumenya 5 mL sehingga diperoleh konsentrasi 1000, 100, dan 10 ppm. Sebagai media kontrol, dilakukan hal yang sama tetapi tanpa penambahan ekstrak. Pengulangan tersebut dilakukan sebanyak 3 kali. Setelah 24 jam, dilakukan pencatatan terhadap jumlah larva udang yang mati, kemudian ditentukan nilai LC50
dari minyak atsiri rimpang temu putih.
4.4.4 Uji Antikanker secara in vitro terhadap sel mieloma A. Penyiapan larutan uji
Pembuatan larutan uji dilakukan dengan cara ditimbang 50 mg minyak atsiri (60 µL) dan dimasukkan ke dalam gelas ukur. Ditambahkan 1 mL larutan DMSO 10
% steril sampai larut. Kemudian ditambahkan aquadest sampai 10 mL dicampur hingga homogen dan dimasukkan ke dalam tabung bertutup steril sehingga diperoleh konsentrasi larutan induk 5000 ppm. Disiapkan tabung bertutup steril empat buah.
Diambil 1 mL larutan induk 5000 ppm dimasukkan dalam tabung 1, ditambahkan 4 mL akuades dan dicampur sampai homogen sehingga diperoleh konsentrasi 1000
ppm. Tabung 2 larutan uji 100 ppm diperoleh dengan cara mengambil 1 mL larutan 1000 ppm, ditambahkan 9 mL akuades dan dicampur sampai homogen. Hal yang sama dilakukan pada tabung 3 dan 4 sehingga diperoleh larutan uji konsentrasi 10 ppm dan larutan uji konsentrasi 1 ppm.
Kontrol negatif hanya diberi 1 mL media DMSO 10% ditambahkan 9 mL akuades, dicampur hingga homogen kemudian diambil 1 mL dan ditambahkan 9 mL akuades dicampur hingga homogen, kemudian dilakukan hal yang sama sebanyak 2 kali lalu dimasukkan ke dalam tabung bertutup steril. Hal ini bertujuan untuk memastikan bahwa bila terjadi efek sitotoksik maka efek ini tidak disebabkan oleh medianya.
B. Penyiapan kultur sel mieloma mencit
Disiapkan sel mieloma mencit tipe P3UI, FBS serum, media RPMI yang mengandung HEPES dan NaHCO3. Proses selanjutnya dikerjakan dengan teknik aseptik di bawah laminair air flow cabinet (LAFC).
C. Proses thawing sel mieloma mencit
Thawing dilakukan dengan cara masing-masing sel mieloma dalam media Rosewell Park Memorial Institut (RPMI) disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit pada suhu 4oC. Supernatan dipisahkan dari endapan kemudian sel ditanam dalam media menggunakan campuran FBS 10% pada botol kultur. Pada pembuatan media ditambahkan antibiotik ampisilin 100 pg/mL untuk mencegah kontaminasi, selanjutnya kultur disimpan dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC selama 24 jam.
D. Inisiasi kultur sel mieloma mencit
Disiapkan mikroplat 24 sumuran steril 3 buah. Masing-masing sel mieloma hasil thawing dihomogenkan dan dituang ke masing-masing sumuran sebanyak 2 mL.
Sel tersebut selanjutnya diinkubasi dalam inkubator yang mengandung 5 % CO2 pada suhu 37 oC selama 24 jam. Jumlah sel/mL ≥ 104 sel/mL dihitung.
E. Uji hambatan pertumbuhan sel mieloma mencit
Jika jumlah sel dianggap telah mencukupi, maka tiap sumuran microwell plate datar 24 lubang dapat diisi 0,2 mL larutan uji dan 0,8 mL sel mieloma, selanjutnya kultur disimpan dalam inkubator CO2 5% pada suhu 37oC selama 24 jam. Kultur sel dipanen dengan merontokkan sel dari dinding tiap sumuran perlakuan kemudian diperiksa di bawah mikroskop. Setiap perlakuan dimasukkan ke dalam vial kemudian diambil 1mL, ditambahkan dengan pewarna tripan blue 0,4% sebanyak 1 mL.
Dengan menggunakan teknik penghitungan cara Thoma dibawah mikroskop dihitung persentase viabilitas selnya yaitu jumlah sel yang hidup dibagi dengan jumlah sel keseluruhan (sel hidup dan sel mati) dikali 100% (Meyer and Harvey, 2003). Jarak antara pewarnaan dengan penghitungan sel dilakukan tidak kurang dari 3 menit dan maximum selama 10 menit hal ini untuk menghindari hasil positif palsu (Freshney, 1987).
Dihitung jumlah sel hidup (tidak terwarnai) dan jumlah sel yang mati (terwarnai) yang terlihat di daerah hitung hemositometer. Hemositometer memiliki 9 kotak hitung untuk setiap sisinya. Ada dua aturan untuk menghitung sel tersebut, jika sel yang menyentuh garis kiri dan atas dari setiap daerah hitung tersebut dimasukkan
daerah hitung maka sel yang menyingung garis kanan dan bawah daerah hitung tidak dimasukkan dalam hitungan. (Meyer and Harvey, 2003).
Media yang mengandung sel mieloma terlebih dahulu diencerkan dengan pewarnaan triptan blue 0,4%. Sebelum memasukkan sel yang akan dihitung, hemositometer ditutup dengan cover glass terlebih dahulu dan pengisian sel harus memenuhi tempat yang disediakan. Penghitungan dilakukan dengan perbesaran 100x.
4.4.5 Uji Antikanker secara in vitro terhadap sel HeLa
Sel kanker mulut rahim HeLa dikultur pada media RPMI 1640 dan dihitung jumlah sel awal di bawah mikroskop. Kemudian sel dipanen dengan penambahan tripsin. Selanjutnya sampel disentrifugasi hingga terbentuk dua lapisan yaitu endapan dan supernatan. Supernatannya dibuang, sedangkan endapan dibentuk pelet dan ditambahkan media komplit 1 mL. Selanjutnya sel dihitung di bilik hitung.
Setelahh sel mencukupi, sel ditanam pada multi-well plate 96 sumuran. Tiap sumuran berisi 2 x 104 sel dalam 100 mL sel komplit. Inkubasi sel selama 1-2 jam hingga sel melekat. Selanjutnya ditambahkan sampel dengan berbagai konsentrasi pada setiap well sebanyak 100 µL. Jadi total setiap well berisi 200 µL. Inkubasi dalam inkubator selama 24 jam pada suhu 37°C CO2 5%. Setelah 24 jam dilihat selnya di bawah mikroskop. Tambahkan MTT 5 mg/1 mL PBS sebanyak 10 µL pada tiap-tiap well. Inkubasi kembali selama 4 jam. Tambahkan stop solution pada tiap- tiap well dan diinkubasi semalaman. Esoknya dibaca absorbansinya menggunakan ELISA reader pada panjang gelombang 550 nm.
4.4.5. Identifikasi senyawa pada minyak atsiri dengan Kromatografi Gas- Spektoskopi Massa (GC-MS).
Minyak atsiri yang diperoleh kemudian dianalisis dengan GC–MS untuk mengetahui komponen kimia penyusun minyak atsiri rimpang temu putih. Spektrum massa yang diperoleh dibandingkan dengan spektrum senyawa standar yang telah diketahui dalam database yang telah terprogram pada alat GC –MS.
