PEWARNAAN BAKTERI BAB I
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberap macam. Pada bentuk basil, pembagiannya meliputi basil tunggal, diplobasil, dan triptobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus ( satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (berbentuk mirip buah anggur).
Khusus pada spirilum hanya terbagi menjadi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah atau ungu. Bakteri gram negative ditandai dengan pewarnaan ungu, sedangkan yang positif berwarna merah. (Anonymous, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang yang bias diwarnai. Endospore adalah organism yang dibentuk dalam kondisi yang stress karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut dilingkungan sampai kondisi mnjadi baik (Nobi, 2008) teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahn identifikasi data apakah gram positif atau gram negative, sehingga diperlukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaanya.
1.2 Tujuan
· Memperoleh keterampilan pewaranaan bakteri secara gram
· Dapat menentukan sifat gram dari bakteri yang diperiksa.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Tryana, 2008)
Struktur dasr bakteri terbagi menjadi dua, yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi: dinding sel, membrane plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan.
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu), meliputi kapsul, flagellum, pilus, fimbria, klorosom, vakuola, gas, dan endospora.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangatlah sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengamati hal tersebut maka
dikembangkansuatu teknik pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitisn mikrobiologi. (Rizki, 2008)
Macam-macam pewwarnaa 1. Pewarnaan negative
Bakteri tidak diwarnai tapi mewarnai latar belakang
Ditujukan untuk bakteri yang sulit diwarna seperti spirochaeta 2. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru methilen atau air fukhsin) Bertujuan hanya untuk melihat bentuk sel.
3. Pewarnaan differensial
Menggunakan lebih dari satu macam zat wrna
Tujuan untuk membedakan antar baktericontoh pewrnaan gram, perwarnaan bakteri tahan asam.
4. Pewarnaan khusus
5. Untuk mewarnai struktur khusus / tertentu dari bakteri menjadi kapsul dan spora. Serta flagell.
Cara Pewarnaan Negative
Sediaan dihapus kemudian teteskan emrsi, kemudian lihat dimikroskop
Untuk mempelajari morfologi, struktur, sifat-sifat bakteri dalam membantu mengidentifikasi, kuman perlu diwarnai. Pewarnaan gram adalh suatu metode empiris untuk membebaskan spesies bakteri menjadi 2 kelompok besra, yakni gram positif, dan gram negative. Berdasrkan sifat kimia dan fisikanya dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark, Hant Cristian Gram (153-1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1984 untuk
membedakan antara pneomokokus dan bakteriislebsiella pneumonia (fizahazny, 2008)
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak dapat mempertahankan zat warna metal ungu pada metode pewarnaan gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metal ungu gelap.
Setelah dicuci dengan alkool, sementara bakteri gram negatifnya tidak. Pada uji pewarnaan gram, suatu pewarna menimbal di tambahkan setelah metal ungu yang membuat semua bakteri gram negative, menjadi berwrna merah, atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk
mengklasifikasikan kedua tip bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Fizahazny, 2008)
Pewarnaan sederhana
Adalah pewarnaan yang paling umum digunakan. Disebut demikian karena hanya digunakan satu jenis pewarnaan untuk mewarnai organism. Kebanyakan bakteri telah bereaksi dengan pewarnaan- pewarnaan sederhana, karena sitoplasma bersifat basofil (suka akan basa). Zat-zat warna yang akan digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromatofornya bersifat positif). Pewarnaan sederhana ini memungkinkan dibedakannya bakteri dengan bermacam- macam tipe morfologi (coccus, villario, basillus, dll), dan bahan-baha lainnya yang ada pada olesan yang diwarnai (hadiutomo, 1990)
Pewarnaan negative, metode ini bukan untuk mewarnai bakteri, tapi mewarnai latarbelakangnya menjadi hitam gelap. Pada pewarnaan ini mikroorganisme kelihatan transparan (tembus pandang).
Teknik ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel.
Cirri-ciri gram negative:
· Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10-45mm, berlapis tiga atau multi layer
· Dinding slnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapt dalam lapisan kaku,, sebelh dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam laktat.
· Kurag rentan terhadap senyawa penisilin.
· Tidak resisten terhadap gangguan fisik Ciri-ciri bakteri gram positif:
· Struktur dindingnya tebal
· Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal
· Bersifat lebih rentan terhadap senyawa penisilin
· Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu Kristal
· Komposisi yang dibutuhkan lebih rumit
· Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap. Yaitu
a. Pemberian cat warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu b. Pengintensifan cat warna dengan penambahan larutan mordan c. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alcohol asam
d. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Banyak seenyawa organic berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopis dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan gram untuk:
Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar Mengidentifikasi bagian-bagian structural sel mikroorganisme
Membantu mengidentifikasi atau membedakan organism yang serupa ( Suriawieia, 2002).
BAB III METODELOGI 3.1 Cara Kerja
3.1.1 alat 3.1.2 Bahan
· Mikroskop aquades sterl
· Kaca benda biakan murni bakteri
· Mangkuk pewarna Alkohol 70%
· Kawat penyangga Larutan iodin
· Pipet Kristal violet
· Pinset Larutan Safranin
· Lampu spirtus Alkohol 95%
· Botol penyemprot 3.2 Cara Kerja
a. Menyediakan kaca benda yang bersih, lalu lewtkan diatas nyala api lampu spirtus b. Meneteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut
c. Secara aseptic ambillah inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu letakkan diatas tekanan aquades itu. Kemudian ratakan perlahan-lahan.
d. Mengambil kaca benda lain yang bersih, lalu meletakkan diatas kaca benda sediaan sehingga membentuk sudut 450
e. Menggeserkan kaca benda yang tegak ini, sehingga sediaan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering.
f. melakukan fiksasi dengan cara melewatkan sediaan tersebut diatas nyala api lampu spirtus dengan cepat.
g. Meletakkan sediaan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu meneteskan Kristal violet diatas sediaan tersebut. Menunggu sampai 1 menit.
h. Mmembuang kelebihan zat warna tersebut kedalam mangkuk dan bilaslah sediaan dengan air kran
i. Meneteskan larutan iodine diats sediaan itu, lalu menunggu selama 2 menitdengan air kran.
k. Membuang alcohol 95% diatas sediaan, lalu membiarkan selama 1 menit.
l. Membuang sisa alcohol kedalam mangkuk dan membilas sedian dengan air kran.
m. Meneteskan larutan safranin diatas sediaan , lalu membiarkannya selama 30 detik.
n. Membuang kelebihan larutan safranin kedalam mangkuk, lalu bilas dengan air kran.
o. Mengeringkan sediaan itu secara hati-hati dengan kertas penghisap lalu periksalah dibawah mikroskop. Bila teknik pewarnaannya berhasil dengan baik, maka sel-selnya bakteri yang bersifat gram positif akan berwarna ungu, sedangkan sel-sel bakteri yang bersifat gram negative akan berwarna merah dan merah muda.
BAB IV
PEMBAHASAN
Pewarnaan bakteri untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar belakang, sehingga dapat mempertajam bentuk sel-sel mikroba itu sendiri, dengan car mewarnai sel- sel mikroba dengan zat warna khususnya, yaitu warna Kristal violet pada pengecatan digunakan bakteri Bacillus aereus dan Salmonella typii. Setelah pengecatan diperoleh bakteri tersebut berwarna ungu, yamg berarti bakteri tersebut menyerap zat warna cat tersebut sehingga Nampak pada mikroskop. Zat wwarna yang umumnya digunakan adalah bersifat alkalin (Anonymous. 2008) Pengamatn gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan bakteri garam positif atau bakteri gggram negate. Pada pengecatan ini digunakan 3 jenis bakteri, yaitu: Bacillus aerus, salmonella typii, dan Eschercia colli. Pengecatan ini menggumakan 4 jenis larutan, yaitu: Kristal violet sebagai catwarna, larutan iodin sebagi pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai zat penetup. Berdasarkan percobaan dapat Baccilus aerus, dan Salmonella typii bersifat gram positif yang berartibakteri dapat mengikat dengan kuat cat warna ungu dari Kristal violet. Pada saat gram positif ditambahkan dengan kristel violet, maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel. Dengan pemberian larutan iodin mak Kristal violet akan masuk sampai ke inti sel. Pemberian alcohol menyebabkan pori-pori di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Pada praktikum yang telah dilakukan dapat juga
diidentifikasi bahwa bakteri berbentuk basil dan memiliki bidang pandang mikroskopis. Bakteri ini ditemukan pada perbesaran 40x10 (Anonymous, 2010)
KESIMPULAN
· Pewarnaan bakteri digunakan untuk memperlihatkan atau mempelajari kontras antar sel dan latar belakangnya sehingga dapat mempertsjsm bentuk sel-sel mikroba.
· Pengecatan gram termasuk pengecatan differensial yang digunakan untuk membedakan gram positif dan gram negative.
· Pada pengecatan, digunakan 4 larutan, yaitu: Kristal violet, iodine, alcohol. Dan safranin
· Bakteri yang bersifat gram positif dapat mengikat dengan kuat ungu dari krostal violet, sedangkan bakteri yang bersifat gram negative tidak dapat mengikat warna ungu dari Kristal violet biasa akan berwarna merah atau merah muda setelah diamati pad mikoskop.
DAFTAR PUSTAKA
Hadiutomo. 1990. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta: Erlangga
Suriawiria. 200 Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT. Garaemedia Tryana, S.T. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Malang: Djambatan
Rizky.2008.http://ngecat bakteri makulrizki.blogspot.com/2008/02/materi kuliah html. Diakses tanggal 24 Nopember 2010
Fizahazny. 2008.http// wordpress.com/ Pengantar Temtamg Bakterihtml. Diakses tanggal 25 Nopember 2010
Anonymous. 2008.http//.id Wikipedia. Org/wiki.pewarnaan, gram.
Anonymous: // makalh dan skripsi. Blogspot.com/2010/26 pewarnaan. Html pewarnann
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans
Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram- negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin).
BAB I
PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus (bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah melengkung dan tidak melengkung.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah. Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.
1.2 Perumusan Masalah
Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari ketiga spesimen, serta bagaimana teknik pengecatan
1.3 Tujuan
Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari bentuk- bentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur
pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884. Dengan metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp. (Tryana, S.T, 2008).
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula penyimpanan 2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora
Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif (Edukasi, 2008).
Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan
menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke dalam aliran darah (Kenneath, 2008).
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set kromosom. DNAnya berukuran BP A
zX005A4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).
Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang
mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi.
(Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).
BAB III
METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora” dilaksanakan pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya, Malang.
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Pewarnaan Bakteri
Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B selama 1 menit, dicuci dengan
air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri
3.2.2 Pewarnaan Endospora
Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10 menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pewarnaan Bakteri an Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8 kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk sterilisasi agar tidak
kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan gram A selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik. Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1 menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target, dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage, 2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara
