Lampiran 1 Proses Dehidrasi Jaringan
Dehidrasi jaringan dilakukan untuk mengikat seluruh cairan dalam jaringan, baik cairan interstisial maupun cairan intrasel sebelum dilakukan penanaman jaringan. Adapun proses dehidrasi adalah sebagai berikut:
1. Preparat yang telah disimpan di dalam basket direndam dalam alkohol 100% I, II, III, dan alkohol 95% masing-masing selama 24 jam.
2. Proses perendaman dilanjutkan dengan alkohol 90%, 80%, dan 70% masing-masing selama 12 jam.
3. Setelah proses dehidrasi, dilakukan clearing, yaitu perendaman jaringan di dalam larutan xylol I, II, dan III. Perendaman jaringan dalam larutan xylol I dan II dilakukan masing-masing selama 12 jam, sedangkan perendaman dalam larutan xylol III dilakukan selama 6 jam, dengan 2 jam berada di inkubator suhu 62 ºC.
4. Infiltrasi dilakukan dalam parafin cair di dalam inkubator suhu 62 ºC sebanyak tiga kali ulangan sebelum dilakukan penanaman jaringan.
Lampiran 2 Prosedur Pewarnaan Hematoksilin Eosin
Pewarnaan Haematoksilin Eosin merupakan pewarnaan standar untuk mengetahui struktur umum sel maupun jaringan dalam suatu organ. Tahapan pewarnaan Haematoksilin Eosin adalah sebagai berikut:
1. Proses deparafinisasi dengan menggunakan larutan xylol I, II, dan III masing-masing selama 3-5 menit.
2. Proses rehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat konsentrasi 100% (III, II, dan I), 96%, 90%, 80%, dan 70% masing-masing selama 3-5 menit.
3. Preparat direndam dalam air keran selama 10 menit kemudian dibersihkan dengan cara direndam dalam aquadest selama 5 menit. 4. Preparat diwarnai dengan haematoksilin selama 30-45 detik kemudian
direndam di dalam air keran selama beberapa saat.
5. Warna yang dihasilkan dikrontrol di bawah mikroskop. Jika warna ungu yang dihasilkan kurang kontras, maka preparat dicelupkan kembali ke dalam pewarna haematoksilin selama 3-5 detik. Namun jika warnanya terlalu ungu maka preparat dapat dicelupkan dalam pemucat haematoksilin 1-2 kali (0.5% HCl dalam 70% alkohol). 6. Preparat kembali direndam di dalam air keran selama 10 menit lalu
direndam di dalam aquadest selama 5 menit.
7. Preparat diwarnai dengan eosin selama 30-45 detik.
8. Preparat di dehidrasi dengan alkohol bertingkat dimulai dengan konsentrasi 70%, 80%, 90%, 96%, dan 100% (I, II, dan III) masing-masing 2-4 kali celup.
9. Preparat dijernihkan dengan larutan xylol I, II, dan III masing-masing
selama 5 menit.
10. Proses mounting dilakukan dengan penutupan preparat dengan cover glass menggunakan entelan®.
Hasil : inti berwarna biru hingga ungu, sitoplasma, kolagen, keratin dan eritrosit berwarna merah.
Lampiran 3 Prosedur Pewarnaan Masson’s Trichome
Pewarnaan Masson’s trichome merupakan pewarnaan yang digunakan untuk melihat struktur jaringan ikat dalam suatu organ. Tahapan pewarnaan Masson’s trichome adalah sebagai berikut:
1. Proses deparafinisasi dengan menggunakan larutan xylol I, II, dan III masing-masing selama 3-5 menit.
2. Proses rehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat konsentrasi 100% (III, II, dan I), 96%, 90%, 80%, dan 70% masing-masing selama 3-5 menit.
3. Preparat direndam dalam air keran selama 10 menit kemudian dibersihkan dengan cara direndam dalam aquadest selama 5 menit. 4. Preparat yang difiksasi dengan larutan selain larutan Bouin, harus
melalui proses perendaman dalam larutan Bouin (campuran asam pikrat : formalin : asam asetat glasial = 15 : 5 : 1) selama satu jam dalam suhu 37 ºC. Kemudian dibilas dengan air keran dan aquades masing-masing selama 15 menit dengan tiga kali pengulangan.
5. Preparat diwarnai dengan haematoksilin selama 30-45 detik kemudian direndam di dalam air keran selama beberapa saat.
6. Warna yang dihasilkan dikrontrol di bawah mikroskop. Jika warna ungu yang dihasilkan kurang kontras, maka preparat dicelupkan kembali ke dalam pewarna haematoksilin selama 3-5 detik. Namun jika warnanya terlalu ungu maka preparat dapat dicelupkan dalam pemucat haematoksilin 1-2 kali (0.5% HCl dalam 70% alkohol). 7. Preparat kembali direndam di dalam air keran selama 10 menit lalu
direndam di dalam aquadest selama 5 menit.
8. Pewarnaan dilanjutkan dengan menggunakan larutan acid Fuchsin dan ponceau 2R selama 10-15 menit. Kemudian preparat direndam di dalam acetic acid 1% selama beberapa detik. Kontrol warna dengan mikroskop.
9. Pewarnaan selanjutnya adalah menggunakan orange G dan phospotungstic selama 5 menit. Preparat kembali direndam dalam acetic acid 1% dan dikontrol dengan mikroskop.
10. Pewarna terakhir yang digunakan adalah light green selama beberapa detik hingga hitungan menit. Setelah itu preparat direndam dalam acetic acid 1%.
11. Proses dehidrasi dilakukan dengan menggunakan alkohol 100% (absolut I dan II) masing-masing selama lima menit.
12. Preparat dijernihkan dengan larutan xylol I, II, dan III masing-masing selama 5 menit.
13. Proses mounting dilakukan dengan penutupan preparat dengan cover glass menggunakan entelan®.
Lampiran 4 Prosedur Pewarnaan Alcian Blue (AB) pH 2.5
Pewarna AB bertujuan untuk mendeteksi adanya karbohidrat asam pada jaringan. Pewarna AB dengan pH 2.5 dapat mewarnai mukosubstan sulfat dan nonsulfat (Hamny 2006). Menurut Kiernan (1990) prosedur pewarnaan AB adalah sebagai berikut:
1. Proses deparafinisasi dengan menggunakan larutan xylol I, II, dan III masing-masing selama 3-5 menit.
2. Proses rehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat konsentrasi 100% (III, II, dan I), 96%, 90%, 80%, dan 70% masing-masing selama 3-5 menit.
3. Preparat direndam dalam air keran selama 10 menit kemudian dibersihkan dengan cara direndam dalam aquadest selama 5 menit. 4. Penurunan pH dengan merendamkan preparat ke dalam larutan asam
asetat 3% pada suhu kamar selama 5 menit.
5. Preparat diwarnai dengan alcian blue pH 2.5 selama 30 menit.
6. Preparat dicuci dengan asam asetat 3% pada suhu kamar selama 3x @ 5 menit, lalu dibilas dengan aquadest selama 3x @ 5 menit.
7. Preparat dicelupkan dalam counterstain (nuclear fast red). Intensitas warna dikontrol di bawah mikroskop.
8. Preparat dicuci dengan aquadest pada suhu kamar selama 3x @ 5 menit.
9. Preparat didehidrasi dan clearing pada rak khusus pewarnaan AB-PAS serta mounting sesuai dengan prosedur biasa.
Hasil : Positif AB = mukopolisakarida asam berwarna biru kehijauan dan inti berwarna merah hingga merah kebiruan.
Lampiran 5 Prosedur Pewarnaan Periodic Acid Schiff (PAS)
Pewarnaan PAS diguanakan untuk mendeteksi karbohidrat netral, gula heksosa, dan asam sialit. Prosedur pewarnaan PAS adalah sebagai berikut:
1. Proses deparafinisasi dengan menggunakan larutan xylol I, II, dan III masing-masing selama 3-5 menit.
2. Proses rehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat konsentrasi 100% (III, II, dan I), 96%, 90%, 80%, dan 70% masing-masing selama 3-5 menit.
3. Preparat direndam dalam air keran selama 10 menit kemudian dibersihkan dengan cara direndam dalam aquadest selama 5 menit. 4. Preparat dioksidasi di dalam larutan 0.5-1 periodic acid selama 5 menit
pada suhu kamar. Kemudian dibilas dengan aquadest selama 5 menit dan aquabidest selama 2x @ 5 menit.
5. Preparat direndam di dalam Schiff’s reagen selama 15-30 menit.
6. Preparat direndam dalam air sulfit selama 3x @ 5 menit dan kemudian dibilas dengan aquadest selama 3x @ 5 menit.
7. Preparat dicelupkan dalam counterstain (mayer hematoksilin). Intensitas warna dikontrol di bawah mikroskop.
8. Preparat dicuci dengan air mengalir selama 10-60 menit lalu dibilas dengan aquadest selama 2x @ menit.
9. Preparat didehidrasi dan clearing pada rak khusus pewarnaan AB-PAS serta mounting sesuai dengan prosedur biasa.
Hasil : Glikogen, selulosa, mucin, koloid thyroid, matriks kartilago, kitin, retikula, fibrin dan kolagen berwarna merah magenta.
Lampiran 6 Jumlah Folikel pada Setiap Tipe
Perkembangan folikel diamati dari 4 buah (2 pasang) ovarium. Berikut adalah data jumlah folikel pada setiap tahap perkembangan yang ditemukan pada masing-masing ovarium.
Kode sampel : Ovaki MJ-1 Kode Preparat Tipe Folikel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 27 19 1 1 0 0 0 1 0 0 2 22 11 0 0 0 0 0 1 0 0 3 27 16 0 2 0 0 0 1 0 1 4 39 16 1 2 1 0 0 0 0 0 5 35 9 2 5 0 0 0 0 0 0 6 30 8 1 0 0 0 0 0 0 0 7 34 8 0 0 0 0 0 0 0 0 8 27 20 1 0 0 0 0 0 0 0 9 33 14 0 1 0 0 0 0 0 0 10 31 7 2 2 0 0 0 0 0 0 11 40 22 1 2 1 0 0 0 0 0 12 31 13 0 4 1 1 0 1 0 0 13 41 22 1 1 0 0 0 1 0 0 14 28 12 1 1 1 1 0 0 0 0 15 30 16 2 1 1 1 0 1 0 0 16 37 16 1 1 0 0 0 1 0 0 17 42 16 0 2 0 0 0 1 0 0 18 60 18 0 2 1 0 0 1 0 0 19 51 27 2 1 0 0 0 1 0 0 20 25 14 2 1 0 0 0 1 0 0 21 46 23 2 0 2 0 0 0 0 0 22 25 16 0 2 1 0 0 0 0 0 23 27 17 2 0 0 0 0 0 0 0 24 23 19 1 1 0 1 0 1 0 0 25 43 18 0 2 0 1 0 0 0 0 Jumlah 854 397 23 34 9 5 0 12 0 1 Jumlah folikel pada preparat kelipatan lima 191 83 9 12 1 2 0 2 0 0
Kode sampel : Ovaka MJ-1 Kode Preparat Tipe Folikel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 39 18 4 1 0 0 0 0 0 0 5 47 24 3 0 0 0 0 1 0 0 10 42 20 1 1 0 0 0 0 1 0 15 46 13 0 2 0 0 1 0 0 0 20 34 18 2 0 0 0 0 0 0 0 25 43 16 2 1 0 0 0 0 1 0 Jumlah 251 109 12 5 0 0 1 1 2 0
Kode sampel : Ovaki MJ-2 Kode Preparat Tipe Folikel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 200 102 1 1 0 0 0 1 0 0 5 210 95 2 1 0 0 0 0 0 0 10 258 65 2 0 1 1 0 0 0 0 15 209 79 7 0 0 0 0 0 0 0 20 236 58 9 0 0 0 0 1 0 0 25 251 34 1 0 0 0 0 0 0 0 Jumlah 1364 433 16 2 1 1 0 2 0 0
Kode sampel : Ovaka MJ-2 Kode Preparat Tipe Folikel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 156 138 2 0 0 0 0 0 0 0 5 191 100 1 0 0 0 0 0 0 1 10 168 79 4 0 0 0 0 0 0 0 15 179 71 3 0 0 0 0 0 0 0 20 125 51 0 0 0 0 0 0 0 0 25 156 51 0 0 0 0 0 0 0 1 Jumlah 975 490 10 0 0 0 0 0 0 2 Keterangan:
Ovaka : Ovarium kanan Ovaki : Ovarium kiri
MJ-1 : Sampel trenggiling 1 MJ-2 : Sampel trenggiling 2
