IDENTIFIKASI GEN AROMA PADA PROGENI-PROGENI BACKCROSS
ANTARA VARIETAS CIHERANG DENGAN PANDAN WANGI
(IDENTIFICATION OF FRAGRANT GENE WITHIN BACKCROSS PROGENIES BETWEEN
CIHERANG AND PANDAN WANGI VARIETIES)
Djarot Sasongko Hami seno1,*), Akhmad Endang Zainal Hasan1), Tri Joko Santoso2), Bram Kusbiantoro3), Zainal Alim Mas’ud4)
ABSTRACT
Marker-assisted PCR has been considered as the most potential method for fragrant selection. RM223 is the only suitable marker to identify mutated badh2 gene of Pandan Wangi. This research applies RM223-assisted PCR in the introgression of fragrant gene (mutated badh2) of Pandan Wangi variety, to engineer non-transgenic fragrant variety with good agronomic traits as those of Ciherang. Gene introduction was carried out through site-directed crossing; Pandan Wangi was crossed and backcrossed to Ciherang until heterozygot BC5F1, followed by selfing to obtain homozygot BC5F2. RM223-assisted selection was conducted in each cross and
backcross generation. RM223 was able to identify native, mutated and heterozygot badh2 of Ciherang, Pandan Wangi, and their cross/backcross progenies, respectively. Therefore, the introgression of mutated badh2 within progenies were observed, as well as the statues of badh2 gene (native/mutated) and alleles (homozygot/heterozygot). Further backcross and selfing to obtain BC5F2 is in progress.
Keywords: Backcross, Bradbury, fragrant, Mentik Wangi, badh2, site-directed crossing.
ABSTRAK
PCR berbantuan marka spesifik merupakan metoda deteksi aroma padi yang pada saat ini dianggap paling potensial. RM223 merupakan satu-satunya marka yang dapat mengidentifikasi badh2 termutasi varietas Pandan Wangi. Penelitian ini mengaplikasikan PCR berbantuan marka RM223 pada introgresi gen aroma (badh2
termutasi) varietas Pandan Wangi, dalam rangka merekayasa varietas nontransgenik beraroma Pandan Wangi dengan karakter agronomi sebaik padi Ciherang. Introduksi dilakukan secara persilangan terarah (site-directed crossing), dimana Pandan Wangi disilang dan dibackcross dengan Ciherang hingga diperoleh BC5F1 heterozygot yang kemudian diselfing untuk mendapatkan BC5F2 homozygot (Ciherang aromatik). Pada setiap generasi persilangan/backcross dilakukan seleksi PCR berbantuan marka RM223. Didapatkan RM223 dapat mendeteksi
badh2 utuh pada Ciherang, termutasi pada Pandan Wangi serta heterozygot pada progeni persilangan hingga BC3F1. Oleh karena itu dapat teramati introgresi gen badh2 termutasi pada progeni hasil persilangan/backcross, dan status gen (native/termutasi) serta alel (homozygot/ heterozygot) badh2. Backcross dan selfing untuk mendapatkan BC5F2 sedang dalam proses.
Kata kunci: Backcross, Bradbury, Mentik Wangi, Ciherang, badh2, site-directed crossing.
PENDAHULUAN
Nilai komersial dan permintaan pasar (nasional maupun internasional) akan padi aromatik sangat tinggi dan cenderung meningkat terus, terutama
pada masyarakat dengan taraf ekonomi yang mapan (Qiu and Zhang, 2003, Shi et al., 2008, Bradbury et al., 2005a,b). Namun hanya sebagian kecil petani di Indonesia yang menanam padi aromatik karena kecuali aroma, karakter agronomi padi aromatik (ketahan penyakit dan stres, selektivitas geografi kultivasi, kemudahan penanaman/pemeliharaan, waktu tanam, dan produktivitas) tidak sebaik padi nonaromatik. Introduksi aroma pada padi nonaromatik dengan tanpa merusak kelebihan-kelebihan karakter agronomi lain dari tetua pemulih (host), merupakan hal yang prospektif dalam rangka
1) Dep. Biokimia, Fakultas Matematika dan IPA, Institut Pertanian Bogor.
2) Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian.
3) Balai Besar Penelitian Tanaman Padi. 4) LT. Institut Pertanian Bogor.
ketahanan pangan dan meningkatkan economic benefit kepada petani. Aroma varietas Pandan Wangi yang sangat popular di masyarakat merupakan donor aroma yang potensial. Pada introduksi aroma, baik secara rekayasa genetik, persilangan konventional (random crossing), maupun persilangan terarah (site-directed crossing), diperlukan marka spesifik aromatik yang dapat mengidentifikasi varietas Pandan Wangi dan progeni persilangannya dari sampel varietas nonaromatik. Analisis awal mendapatkan bahwa marka-marka aromatik berbasis badh2 (badh2-based) yang telah dipublikasikan oleh berbagai peneliti (Bradbury et al., 2005b, Shi et al., 2008, Sakthivel 2009), tidak dapat membedakan varietas aromatik kelompok 2, yang termasuk didalamnya varietas Pandan Wangi, dari varietas nonaromatik (Hami Seno et al., 2009). Studi pendahuluan mendapatkan marka terkait badh2 (badh2-related), RM223 dapat membedakan Pandan Wangi dari varietas nonaromatik. Oleh karena itu pada penelitian ini dianalisis kemampuan marka aromatik RM223 dalam mendeteksi keberadaan, introgresi, dan status gen aroma (badh2) pada progeny-progeni backcross antara varietas donor aromatik Pandan Wangi dengan varietas host Ciherang.
BAHAN DAN METODE
Benih tanaman padi yang digunakan diperoleh dari BB Biogen KemTan (Bogor), BB Padi KemTan (Sukamandi), dan LIPI (Cibinong). Persilangan dan backcross mengacu pada Soedyanto et al., (1978). Isolasi DNA dari daun muda sampel tanaman sesuai metoda Doyle and Doyle (1990). Konsentrasi dan kemurnian DNA ditentukan secara spektrofotometri pada 260 nm dan 260/280 nm (Sambrook et al., 1989). Campuran reaksi dan siklus suhu pada seleksi PCR sesuai Bradbury et al., (2005b) untuk marka Bradbury dan Lang and Buu (2008) untuk marka RM223. Produk PCR diseparasi pada elekforesis agarose (1-2%) dengan menyertakan standar DNA sizer, divisualisasi dengan ethidium bromida (10 mg/L) dan penyinaran UV, dilanjutkan dokumentasi dengan Biorad Chemidoc gel sistem (Sambrook et al., 1989, Bradbury et al., 2005b, Lang and Buu 2008).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Identifikasi gen aroma menggunakan PCR dengan marka Bradbury
DNA sampel tanaman padi varietas nonaromatik dan aromatik popular Indonesia diamplifikasi PCR dengan marka Bradbury et al., (2005b), yang dirancang untuk badh2.7 serta menghasilkan amplikon 355 bp dan 585 bp untuk varietas nonaromatik, serta 257 bp dan 585 bp untuk varietas aromatik. Hasil elektroforesis produk PCR (Gambar 1) menunjukkan hanya Mentik Wangi dan Gunung Perak yang menghasilkan amplikon (257 bp dan 585 bp) berbeda dari varietas nonaromatik (355 bp dan 585 bp). Sedangkan varietas aromatik lain, termasuk diantaranya Pandan Wangi, menghasilkan amplikon yang sama dengan varietas nonaromatik (257 bp dan 585 bp). Hasil ini mendukung penelitian sebelumnya (Hami Seno et al., 2009), serta memperkuat dugaan terdapatnya paling sedikit 2 kelompok tipe mutasi ekson7 gen badh2 (badh2.7) pada varietas aromatik Indonesia. Kelompok 1 meliputi Mentik Wangi dan Gilirang, sedang kelompok 2 meliputi Pandan Wangi, Pulu Mandoti, dan Pare Kembang. Marka Bradbury dapat mengidentifikasi varietas aromatik kelompok 1, tetapi kelompok 2 tidak. Tidak terdeteksinya sampel aromatik dari kelompok 2 menunjukkan ketidak cocokan marka Bradbury dengan varietas-varietas tersebut, yang diduga karena pola mutasi yang berbeda atau tidak mengandung delesi 8 bp pada badh2.7. Tidak ditemukannya tipe mutasi tersebut (delesi 8 bp badh2.7) juga telah dilaporkan pada genotip aromatik yang lain (Kuo et al., 2005; Navarro et al., 2007). Demikian juga beberapa varietas aromatik dari Cina juga ditemukan tidak mengandung tipe mutasi ini, namun mengalami mutasi 7 bp pada badh2.2 (Shi et al., 2008). Sementara beberapa varietas aromatik dari India (Tarunbhog, Ganjeikalli, Bishnubhog, Bansphool A dan Adamchini) dilaporkan tidak mengandung bai delesi 8 bp badh2.7 maupun delesi 7 bp badh2.2 (Sakthievel et al., 2009). Pandan Wangi, Kai Noi Leung (Laos) dan Paw Sam Hwe (Burma) juga telah telah dilaporkan tidak teridentifikasi dengan marka Bradbury (Fitzgerald et al., 2008, Kovach et al., 2009). Oleh karena itu, diduga pada varietas aromatik kelompok 1 mengalami delesi 8 bp pada badh2.7, sedang kelompok 2 tidak.
Identifikasi gen aroma varietas Ciherang, Pandan Wangi, dan F1 persilangannya menggunakan PCR dengan marka RM233
DNA varietas Ciherang dan Pandan Wangi diamplifikasi dengan marka RM223. Hasil elektroforesis produk PCR (Gambar 2) menunjukkan RM 223 marker dapat mengidentifikasi perbedaan amplikon Ciherang (160 bp) dan Pandan Wangi (140 bp), serta sesuai dengan publikasi sebelumnya (Lang and Buu 2008). Selain itu, heterozygot F1 juga dapat terlihat dengan jelas. Percobaan dan contoh hasil pembentukan serta seleksi F1 telah dipublikasikan sebelumnya (Hami Seno et al., 2010). Identifikasi introgresi gen aroma pada BC1F1 Ciherang-Pandan Wangi
F1 Ciherang-Pandan Wangi (hasil percobaan sebelumnya) dibackcross dengan Ciherang dan DNA BC1F1 dianalisis PCR dengan marka RM223. Outline percobaan dan contoh hasil disajikan pada Gambar 2. Hasil elektroforesis produk PCR (Gambar 4) menunjukkan sampel padi nonaromatik Ciherang, padi aromatik Pandan Wangi, maupun hasil backcross (BC1F1) keduanya dapat teridentifikasi dengan marka RM223, sesuai hasil publikasi sebelumnya (Hami Seno et al., 2010) serta publikasi peneliti terdahulu menggunakan varietas lain (Lang and Buu 2008). Selain itu, keberhasilan introgresi badh2 termutasi dari Pandan Wangi juga dapat teridentifikasi dengan marka RM223, terlihat dari pita heterozygot sampel BC1F1.
Gambar 3. Outline dan contoh hasil percobaan pada pembentukan dan seleksi BC1F1 Ciherang-Pandan wangi.
Keterangan:
1–4 = contoh tanaman Ciherang, Pandan wangi, persilangan, dan malai. 5-9 = contoh biji/buah BC1F1, tanaman BC1F1 pada petri dis, bak, dan pot/ember pada awal penanaman, dan pada saat pengambilan sampel daun untuk isolasi DNA.10 = contoh gel agarosa hasil elektroforesis produk PCR; m = size marker, P = Pandan wangi, C = Ciherang, BC1F1 = BC1F1 Ciherang-Pandan wangi, dan w = air. Panah menunjukkan urutan langkah percobaan. * = menunjukkan F1 heterozygot, digunakan untuk menyeleksi tanaman F1 (11) yang akan di backcross
selanjutnya dengan Ciherang untuk mendapatkan BC2F1Ciherang-Pandan Wangi. Ukuran amplikon seperti pada Gambar 2.
Gambar 2. Profil RM233-PCR varietas Ciherang dan Pandan Wangi..
Keterangan:
1= size marker, 2 = Ciherang, 3 = Pandan Wangi, 4=F1 Ciherang-Pandan Wangi, dan w = air (kontrol negatif)
bp 200 100 1 2 3 4 w 160 bp 140 bp Gambar 1. Hasil analisis PCR varietas nonaromatik
dan aromatik dengan marka Bradbury.
Keterangan:
m=size marker. Sampel padi nonaromatik: N=Nipponbare,
C=Ciherang, Ir= IR64, F=Fatmawati, T=Taipei 309. Sampel padi aromatik : M=Mentik Wangi, P=Pandan Wangi, G=Gunung Perak, Pm=Pulu Mandoti, Pk= Pare Kembang. w=air (kontrol negatif). *=Varietas aromatik (Mentik Wangi dan Gunung Perak) yang dapat teridentifikasi dengan marka Bradbury (memberikan pola amplikon yang berbeda dengan varietas nonaromatik).
m N C Ir F T M P G Pm Pk w 257 bp 355 bp 585 bp * * bp 1000 500 100
Identifikasi introgresi gen aroma pada BC2F1 dan BC3F1 Ciherang-Pandan Wangi
Tahapan percobaan dilakukan seperti pada Gambar 5, tetapi F1 diganti dengan BC1F1 atau BC2F1 pada pembentukan dan seleksi BC2F1 atau BC3F1. Hasil elektroforesis produk PCR (Gambar 6) menunjukkan sampel padi nonaromatik Ciherang, padi aromatik Pandan Wangi, maupun hasil backcross (BC2F1 dan BC3F1) dapat teridentifikasi dengan marka RM223. Heterozygot BC2F1 dan BC3F1 juga dapat teridentifikasi, seperti pada F1 (Hami Seno et al., 2011), percobaan sebelumnya (BC1F1), dan publikasi Lang and Buu (2008).
Berdasarkan hasil-hasil percobaan yang telah diperoleh, perbedaan amplikon gen aroma pada sampel padi nonaromatik Ciherang, padi aromatik Pandan Wangi, maupun hasil persilangan (F1) atau backcross (BC1F1, BC2F1, dan BC3F1) dapat teridentifikasi dengan konsisten menggunakan PCR dengan marka RM223. Introgresi badh2 termutasi dari donor ke host, status gen (termutasi/utuh) serta alel (homozygot/heterozygot) badh2 varietas padi nonaromatik Ciherang, aromatik Pandan Wangi, dan hasil persilangan serta backcross kedua varietas tersebut juga dapat teridentifikasi. Oleh karena itu, marka RM223 cocok untuk digunakan sebagai marka seleksi pada pengembangan varietas padi aromatik baru berbasis Pandan Wangi. Selain itu, RM223 merupakan satu-satunya marka aromatik yang tersedia pada saat ini yang dapat mengidentifikasi Pandan Wangi dari varietas nonaromatik. Namun RM223 merupakan marka terkait badh2 (badh2-related), sehingga tidak seakurat marka berbasis badh2 (badh2-based).
Marka RM223 merupakan salah satu marka
aromatik yang menggunakan sistem duplek (2 primer). Selain marka dengan sistem duplek,
marka aromatik dengan sistem multiplek (4 primer) juga telah dipublikasikan (Bradbury et al., 2005b), namun selain tidak sesuai/kompatibel dengan Pandan Wangi, sistem multiplek mempunyai kelemahan karena lebih kompleks, memerlukan lebih banyak primer, amplifikasi lebih lemah, inkonsistensi akibat kompetetisi pengikatan primer dengan DNA templat, dan amplifikasi nonspesifik akibat sedikit perbedaan konsentrasi primer (Sakithvel et al., 2009). Sebaliknya, pada marka duplek, perbedaan ukuran amplikon nonaromatik dan aromatik pada (Lang and Buu 2008, Shi et al., 2008, Shakitel et al., 2009) relatif kecil karena hanya bergantung pada perbedaan basa akibat delesi (InDel) gen badh2 (8 bp pada ekson 7 dan 7 bp pada ekson 2). Hal ini menyulitkan pengamatan sampel heterozygot dan
untuk menanggulangi masalah ini harus menggunakan gel poliakrilamida (Shi et al., 2008), sehingga kurang praktis pada seleksi tanaman dalam jumlah banyak. Perbedaan ukuran amplikon dari RM223 merupakan yang paling besar dibandingkan marka aromatik duplek yang lain (Shi et al., 2008, Shakitelet al., 2009). Oleh karena itu relatif paling mudah/praktis digunakan, serta tidak perlu menggunakan gel poliakrilamida untuk mendapatkan visualisasi perbedaan amplikon yang jelas, terutama pada sampel heterozygot.
KESIMPULAN
Keberadaan dan status gen badh2 (utuh/termutasi) serta alel (homozygot/heterozygot) badh2 pada sampel varietas padi nonaromatik Ciherang, aromatik Pandan Wangi, dan hasil persilangan/backcross kedua varietas tersebut (F1, BC1F1, BC2F1, BC3F1) dapat teridentifikasi menggunakan PCR dengan marka RM223. Introgresi gen aroma (badh2 termutasi) dari donor (Pandan Wangi) ke host (Ciherang) dapat teridentifikasi menggunakan PCR dengan marka RM223. Keberhasilan introgresi atau pembentukan progeni persilangan (F1) dan backcross (BC1F1,BC2F1, dan BC3F1) terlihat dari munculnya pita heterozygot pada sampel progeni persilangan atau backcross. Marka RM223 cocok untuk digunakan sebagai marka seleksi pada pengembangan varietas aromatik baru berbasis Pandan Wangi.
Gambar 4. Contoh hasil elektroforesis seleksi PCR BC2F1 dan BC3F1 Ciherang-Pandan Wangi. dengan marka RM223.
Keterangan :
C = Ciherang, P = Pandan Wangi, w = air, * = progeni BC2F1 atau BC3F1 heterozygot Ciherang-Pandan Wangi. Ukuran amplikon seperti pada Gambar 2.
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * CP BC2 w CP BC3 w
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis beserta tim peneliti mengucapkan terima kasih kepada Sekretariat Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Kementrian Pertanian, atas dana yang telah diberikan sehinga penelitian ini dapat berlangsung. Selain itu juga kepada LPPM IPB, FMIPA IPB, Departemen Biokimia IPB, LT IPB, BB Biogen, dan LIPI atas kerjasama, pengelolaan administrasi, dukungan serta fasilitas SDM dan laboratorium. Juga kepada para pembantu peneliti/teknisi (Bambang Padmadi SSi, Dewi Praptiwi Ssi, Sugihartati SSi, Taufiq, Muhammad Taufan Fatahajudin, Helmy Ramadhan Al Anshary) atas kerja sama dan kerja keras yang dilakukan selama penelitian berlangsung.
DAFTAR PUSTAKA
Ahn SN, Bollisch CN, Tanksley SD (1992) RFLP tagging of a gene for aroma in rice. Theor Appl Genet 84:825–828.
Amarawathi Y, Singh R, Singh AK, Singh VP, Mohapatra T, Sharma TR, Singh NK (2008) Mapping of quantitative traitloci for basmati quality traits in rice (Oryza sativa L.). Mol. Breed 21:49–65. doi:10.1007/s11032-007-9108-8 Bourgis, F, R. Guyot, H. Gherbi, E. Tailliez, I.
Amabile, J. Salse, M. Lorieux, M. Delseny, and A. Ghesquière (2008) Characterization of the major fragance gene from an aromatic japonica rice and analysis of its diversity in Asian cultivated rice. Theor Appl Genet. 117(3): 353–368.
Bradbury LM, Fitgerald TL, Henry RJ, Jin Q, Waters DLE (2005a) The gene for fragrance in rice. Plant Biotech J 3:363–370.
Bradbury LMT, Henry RJ, Jin Q, Reinke RF, Waters DLE (2005b) A perfect marka for fragrance genotyping in rice. Mol Breed 16:279–283. Buttery RG, Ling LC, Juliano BO, Turnbaugh JG
(1983) Cooked rice aroma and 2-acetyl–1-pyroline in rice. J Agric Food Chem 31:823– 826.
Cordeiro GM, Christopher MJ, Henry RJ and Reinke RF (2002) Identification of microsatellite markas for fragrance in nrice by analysis of the rice genome sequence. Mol. Breed. 9: 245– 250.
Doyle J J and Doyle J L (1990) A rapid total DNA preparation procedure for fresh plant tissue. Focus 12:13-15.
Fitzgerald M A, Hamilton N R S, Calingacion M N, Verhoeven H A, and Butardo, V M (2008) Is there a second fragrance gene in rice. Plant Biotech. J. 6:416-423.
Hami Seno DS, Santoso TJ, Tri Jatmiko KR, Padmadi B, Praptiwi D (2009) Konstruksi padi nonaromatik yang beraroma wangi menggunakan PCR berbantuan marka gen badh2. Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelitian IPB 2009, 678-688. ISBN : 978-602-8853-03-3, 978-602-8853-08-8.
Hami Seno DS, Santoso TJ, Mas’ud ZA (2010) Introgresi aroma padi mentik wangi berbatuan marka bradbury. Prosiding Seminar Hasil-Hasil Penelitian IPB 2010, in press.
Kovach M J, Calingacion M N, Fitzgerald M A, and McCouch S R (2009) The orign and evolution of fragrance in rice (Oriza sativa L.). PNAS 106:14444-14449.
IRRI (2004) Varietas unggul padi sawah yang dilepas sejak 1943-2004. http:\\www.knowledgebank. irri.org\regionalSites\indonesia\docs\padiSawa h. pdf
Kuo SM, Chou SY, Wang AZ, Tseng TH, Chueh FS, Yen HE, Wang CS (2005) The betaine aldehyde dehydrogenase (BAD2) gene is not responsible for aroma trait of AS0420 rice mutant derived by sodium azide mutagenesis. In: Proceedings of the 5th international rice genetics symposium, IRRI, Philippines, p 166
Lang NT dan Bu BC (2008) Development of pcr-based markas for aroma (fgr) gene in rice (Oryza sativaI L.). Omonrice 16: 16-23
Lorieux M, Petrov M, Huang N, Guiderdoni E, Ghesquière A (1996) Aroma in rice: genetic analysis of a quantitative trait. Theor App Genet 93:1145–1151.
Mackill DJ, Septiningsih E, Pamploma AM, Sanches D, Iftekhar A, Masudussaman AS, Collard B, Neeraja C, Vergara G, Maghirang-Rodriquez, R, Heuer S, Ismail AM (2007) Marker assisted selection for submergence tolerance in rice. Mol. Plant Breeding 5: 207-208.
Navarro M, Butardo V, Bounphanousay C, Reano R, Hamilton RS, Verhoeven H, Fitzgerald M (2007) The good, the BAD and the
fragrant-understanding fragrance in rice. In: Proceedings of international network on quality rices-clearing old hurdles with new science: improving rice grain quality’’, IRRI, Philippines, Apr 17–19, pp 16–17
Paule CM, Powers JJ (1989) Sensory and chemical examination of aromatic and non aromatic rices. J Food Sci 54:343–346.
Petrov M, Danzart M, Giampaoli P, Faure J, Richard H (1996) Rice aroma analysis Discrimination between a scented and a non scented rice. Sci Aliments 16:347–360.
Reinke RF, Welsh LA, Reece JE, Lewin LG and Blakeney AB (1991) Procedures for quality selection of aromatic rice varieties. Int. Rice Res. Newslett. 16: 10–11.
Sakthivel K, Rani NS, Pandey MK, Sivaranjani AKP, Neeraja CN, Balachandran SM, Madhav MS, Viraktamath BC, Prasad SV, and Sundaram RM (2009) Development of a simple functional marka for fragrance in rice and its validation in Indian Basmati and non-Basmati fragrant rice varieties. Mol. Breeding DOI 10.1007/s11032-009-9283-x
Sambrook J, Fritsch E F, and Maniatis T (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed., Books:1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA.
Shi W, Yang Y, Chen S, Xu M (2008) Discovery of a new fragrance allele and the development of functional markas for the breeding of fragrant rice varieties. Mol. Breeding 22: 185-192. Shure, M, S. Wessler, and N. Fedorrof (1983)
Molecular identification and isolation of the Waxy locus in maize. Cell 35: 225-233.
Soedyanto R, Sianipar R, Susani A, dan Harjanto (1978) Bercocok Tanam Jilid II. Jakarta: CV Yasaguna.
Sood BC and Sidiq EA (1978) A rapid technique for scent determination in rice. Indian J. Genetic Plant Breed. 38: 268–271.
Srivong P, Wangsomnuk P and Pongdontri P (2008) Characterization of a fragrant gene and enzymatic activity of betaine aldehyde dehydrogenase in aromatic and nonaromatic thai rice cultivars. KKU Sci. J. 36(4): 290-301. Sun SH, Gao FY, Lu XJ, Wu XJ, Wang XD, Ren GJ,
Luo H (2008) Genetic analysis and gene fine mapping of aroma in rice (Oryza sativa L.
Cyperales, Poaceae). Genet Mol Biol 31:532– 538. doi:10.1590/S1415-47572008000300021 Tanchotikul U and Hsieh TCY (1991) An improved
method for quantification of 2-acetyl-1-pyrroline, a "popcorn`-like aroma, in aromatic
rice by high-resolution gas
chromatography/mass spectrophotometry/ selective ion monitoring. J. Agric. Food Chem. 39: 944-947.
Vanavichit A, Tragoonrung S, Toojinda T, Wanchana S, and Kamolsukyunyong W (2008) Transgenic rice plants with reduced expression of Os2AP and elevated levels of 2-acetyl-1-pyrroline. USA patent 7,319,181
Wanchana S, Kamolsukyunyong W, Ruengphayak S, Toojinda T, Tragoonrung S, Vanavichit A (2004) Enhancing 2-acetyl-1-pyrroline synthesis in rice leaves by RNAi-mediated suppression of Os2AP converts non-aromatic to aromatic rice (Oryza sativa L.) Proceedings of the 1.sup.st International Conference on Rice for the Future, p. 105.
Widjaja R, Craske JD. and Wootton M (1996) Comparative studies on volatile components of non-fragrant and fragrant rices. J. Sci. Food Agric. 70: 151–161. (355 bp dan 585 bp Yoshihashi T, Huong NTT, and Inatomi H (2002)
Precursors of 2-acetyl-1-pyrroline, a potent flavour compound of an aromatic rice variety. J Agric Food Chem 50:2001–2004.
