38
Lampiran 2. Prosedur pembuatan sediaan histologis sirip dengan metode paraffin
Tahapan pembuatan sediaan histologi sirip ikan hasil regenerasi sebagai
berikut :
1. Fiksasi
Proses fiksasi dilakukan dengan cara sampel dimasukan ke dalam larutan
Normal Buffered Formalin(NBF) selama 24 jam. 2. Washing
Proses Pencucian atau washing dilakukan dengan mengganti larutan
Normal Buffered Formalin (NBF) dengan larutan alkohol 70% I (24 jam) dan larutan alkohol 70% II (30 menit).
3. Dehidrasi
Proses dehidrasi dilakukan dengan merendam sampel ke dalam alkohol
bertingkat berfungsi untuk menghilangkan atau menarik kandungan air di dalam
jaringan. Proses ini dilakukan secara bergantian dari alkohol 80%, 90%, absolut I
dan II masing-masing selam 45 menit.
4. Clearing
Proses clearing dilakukan untuk menarik alkohol dari dalam jaringan
(dealkoholisasi), Clearing dilakukan dengan cara memasukan sampel secara
bertahap ke dalam alkohol :xylol= 3:1, alkohol :xylol= 1:1, alkohol :xylol= 1:3,
xylolmurni I danxylolmurni II masing-masing selama 40 menit. 5. Infiltrasi
Proses infiltrasi dilakukan dengan cara sampel dimasukan ke dalam xylol : parafin = 3:1, xylol : parafin = 1:1, xylol : parafin = 1:3, parafin murni I dan parafin murni II masing-masing 40 menit. Proses ini dilakukan di dalam inkubator
dengan suhu 60oC, titik leleh parafin yang digunakan adalah 56-58oC.
6. Embedding
Proses embedding atau penanaman organ pada parafin dilakukan dengan
cara organ dimasukan ke dalam cetakan yang sudah berisi parafin dengan posisi
organ diatur sesuai posisi pengirisan, kemudian diberi tanda posisi penanaman
organ dan salah satu sisi blok parafin dipasang kayu pemegang (holder). Setelah blok parafin memadat kemudian disimpan pada suhu yang rendah.
39 7. Sectioning
Proses sectioning dilakukan dengan cara holder dipasang pada rotary microtomekemudian diatur ketebalan irisan 4 µm, setelahholderterpasang proses pengirisan dapat dilakukan dengan memutar tuas pada mikrotom.
8. Affixing
Proses affixing dilakukan dengan cara pita irisan dimasukan ke dalam air hangat, kemudian ditempelkan pada object glass yang sudah dilapisi gelatin 1%. Pita yang sudah menempel kemudian dikering anginkan.
9. Staining
Proses staining untuk struktur seluler, proses ini diawali dengan
deparafinisasi (penghilangan parafin yang terdapat dalam jaringan) dengan cara
preparat hasil affixing dicelupkan ke dalam xylol sebanyak 2 kali masing-masing selama 5 menit. Proses selanjutnya adalah rehidrasi, dilakukan dalam larutan
alkohol bertingkat terdiri dari alkohol absolute I dan II, alkohol 90%, alkohol
80%, alkohol 70% dan akuades masing-masing 30 celupan. Selanjutnya preparat
dimasukan ke dalam larutan hematoxylin selama 5 menit kemudian dicuci menggunakan akuades. Preparat kemudian dimasukan ke dalam larutan eosin
selam 2 menit kemudian dicuci dengan akuades. Setelah dicuci menggunakan
akuades, preparat didehidrasi dalam larutan alkohol bertingkat dari alkohol 70%,
alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol absoluteI dan II masing-masing sebanyak 30 celupan. Selanjutnya dijernihkan dalam larutan xylol sebanyak 2 kali masing-masing 3 menit dan ditutup menggunakan cover glass dengan perekat enthelan new. Proses staining untuk melihat proses kalsifikasi dilakukan dengan deparafinisasi dicelupkan ke dalam xylol selama 3 menit, lalu rehidrasi dalam larutan alkohol bertingkat terdiri dari alkohol absolute I dan II, alkohol 90%,
alkohol 80%, alkohol 70% masing-masing sebanyak 30 celupan. Kemudian
dibilas menggunakan akuades, selanjutnya dimasukan kedalam larutan acetone
dan acetone xylol masing-masing 20 celupan. Selanjutnya dijernihkan dalam larutanxylolselama 3 menit dan ditutup menggunakancover glassdengan perekat
enthelan new. 10. Labelling
Preparat histologis yang sudah diwarnai dan ditutup dengan enthelan
kemudian diberi label berisi nama organ, irisan, dan kode sampel.
40 11. Pengamatan
Preparat histologis tersebut kemudian diamati menggunakan mikroskop
cahaya dan didokumentasikan menggunakan kamera.
