Mihara, H., Sumi, H., Yoneta, T., Mizumoto, H., Ikeda, R., Seiki, M., Maruyama, M., (1991), A Novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm,

(1)

37 DAFTAR PUSTAKA

Ahn, M.Y., Hahn, B.S., Ryu, S.K., Hwang, S.J., Kim, Y.S., (2005), Purification and characterization of a serine protease (CPM-2) with fibrinolytic activity from the dung beetles, Arch. Pharm. Res , 28, 816–822.

Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Strayer, L., (2002), Biochemistry, 5th_{Ed., W.H. Freeman and}

Florida, 370–373.

Bhagavan, N.V., (2002), Medical Biochemistry, Harcourt Academic Press, California, 840– 870.

Bhattacharjee, G., Chaudhuri, PS., (2002), Cocoon production, morphology, hatching pattern and fecundity in seven tropical earthworm species – a laboratory-based investigation, J. Biosci., 27, 283–294.

Bolger, M.B., (2001), Three-dimensional structure of fibrolase, the fibrinolytic enzyme from southern copperhead venom, modeled from the X-ray structure of adamalysin II and atrolysin C, AAPS Pharmsci, 3, 1–13.

Deutscher, M.P., (1990), Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., California, 285–291.

Dong, G.Q., Yuan, X.L., Shan, Y.J., Zhao, Z.H., Chen, J.P dan Cong, Y.W., (2004), Molecular cloning and characterization cloning and characterization of cDNA encoding fibrinolytic enzyme-3 from eartworm Eisenia foetida, Acta Biochim. Biophys. Sin., 36 (4),

303–308.

Edwards, C.A., Dominguez, J,. Nenhanser,. E.F, (1998), Growth and reproduction of P.

excavatus (Megascolecidae) as factors organic waste management, Biol. Fertil. Soils,

27,155–161.

Edward., C.A., dan Lofty, J.R., (1972) Biology of earthworm. Chapman nad Hal Ltd:London, 1–36

Elyani, N., (2005), Deteksi enzim fibrinolitik dari cacing tanah P. excavatus, Tesis, Program

Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung.

Fan, Q. Wu, C,. Li., Fan, R., WU, C., Hou, Q., He, R., (2001), Some feature of instestinal absorbtion of intact fibrinolytic enzyme III-1 from L. rubellus, Biochem. Biophys. Acta,

1526, 286–292.

Fersht, A., (2000), Structure and mechanism in protein science, 3rd Edition, W.H Freeman and Company, New York, 224 – 228.

Fulyani, F., (2006), Identifikasi enzim fibrinolitik dari cacing tanah P. excavatus, Skripsi,

Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung.

Hardiany, A., (2002), Identifikasi enzim fibrinolitik cacing tanah Pheretima sp dengan

(2)

Mihara, H., Sumi, H., Yoneta, T., Mizumoto, H., Ikeda, R., Seiki, M., Maruyama, M., (1991), A Novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus, Jpn. J. Physiol, 41, 461–472.

Nakajima,N., Mihara, N., Sumi, H., (1993), Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus, Biosci. Biotech. Biochem., 57, 1726–1730.

Nakajima, N., Sugimoto, M., Ishihara, K., (2003), Earthworm-serine protease: characterization, molecular cloning, and application of the catalytic function, J. Molec. Catal., 23, 191–212.

Nurachman, Z., Hermawan, J., Racmayanti, Y., Bardja, L., (2003), A simple way to visualize fibrinolysis in the classroom, Biochem. Mol. Bio. Edu., 31, 16–18.

Murray, R.K.,Garner, D.K., Mayes, P.A., Rodwel, V.W., (1992), Biokimia Harper. Edisi 24. CV. EGC, Jakarta.

Mathews, C.K., van Holde, K.E., Ahrn, K.G., (2000), Biochemistry, 3rd Ed., Addison-Wesley, Pub. Comp., San Fransisco, 374–375.

Pechenick, (2005), Biology of the Invertebrates, 5th Ed., McGraw Hill International, New York, 302–305.

Sahlan, M., (2002), Eksplorasi enzim fibrinolitik dari cacing tanah Pheretima sp galur local,

Skripsi, Departemen Kimia, Institut Teknologi Bandung.

Smith, E.T., (1991), Exploring Biology, 5th_{Ed., Harcourt Brace & Word Inc., London}

Stephenson, J., (1930), The Oligochaeta, Oxford University Press, Oxford.

Scopes, K., (1994), Protein purification : Principle and Practice,3rd _{Ed., Springer, New York.}

Tao, G., Sun., Z.J., Fu, S. H., Liang, G. D., (2005), Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris, Prot. Expr. Purif., 42, 20–28.

Wallwork, J.A., (1920), Ecology of soil animals, Mc Graw-Hill, London.

Webb, J., Thompson, C., (1992), Trombolysis for acute myocardial infraction, Can. Fam.

Physician, 38, 1415.

Wiseman, A., (1986), Handbook of enzyme biotechnology, 2nd_{Ed., John Willey & Sons,}

New York, 26–34.

Yang, J.S., Ru, B.G., (1997), Purification and characterization of an SDS-actived fibrinolytic enzyme from Esenia fetida, J. Comp.Biochem. Physiol, 118B, 623–637.

(3)

39 LAMPIRAN A

Penentuan Kadar Protein Enzim

A.1 Kurva Standar BSA (dibaca pada A595)

No BSA standar (mg/mL) A1 A2 A3 Arata-rata

1 2 0,096 0,152 0,130 0,126

2 4 0,280 0,267 0,280 0,262

3 6 0,373 0,386 0,367 0,375

4 8 0,471 0,444 0,532 0,482

5 10 0,665 0,585 0,610 0,620

Kurva Standar BSA

y = 0.0604x + 0.0106 R2 = 0.998 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 2 4 6 8 10 12 Konsentrasi BSA A

Dari kurva tersebut dihasilkan persamaan garis y = 0,0604x + 0,0106 yang dipakai untuk perhitungan kadar enzim,

(4)

A. 2 Perhitungan Kadar Protein Sampel

Perhitungan kadar protein pada sample dilakukan menggunakan persamaan yang didapatkan dari aluran kurva standar, Dengan memperhitungkan faktor pengenceran, diperoleh hasil sebagai berikut: A595 nm Sampel A1 A2 A3 Arata-rata Konsentrasi pengujian (μg/mL) Faktor pengenceran Konsentrasi awal (mg/mL) Ekstrak kasar 0,345 0,364 0,371 0,360 5,78 2000 11,6 Filtrasi gel 0,673 0,631 0,643 0,649 10,6 20 0,21

Sampel Konsentrasi Awal (mg/mL) Volume Total (mL) Protein Total (mg) Ekstrak Kasar 11,6 50 580 Hasil Filtrasi 0,21 135 28,4

(5)

41 LAMPIRAN B

Penentuan Aktivitas Enzim

B. 1 Kurva Uji Azokaseinolitik Ekstrak Kasar Enzim

Waktu (menit) A1 A2 A3 Arata-rata 0,187 0,189 0,190 10 0,184 0,185 0,189 0,187 0,423 0,423 0,420 20 0,404 0,403 0,403 0,412 0,592 0,591 0,597 30 0,595 0,600 0,599 0,596 0,773 0,768 0,776 40 0,774 0,773 0,781 0,774

Uji Aktivitas Azokaseinolitik Ekstrak Kasar Enzim

y = 0,0194x + 0,0066 R2 = 0,9967 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 0 10 20 30 40 50 Waktu (Menit) Ab so rb a n si

(6)

B. 2 Kurva Uji Azokaseinolitik Hasil Filtrasi Gel Waktu (menit) A1 A2 A3 Arata-rata 0,312 0,320 0,314 10 0,283 0,288 0,287 0,300 0,577 0,565 0,570 20 0,517 0,517 0,522 0,544 0,804 0,809 0,809 30 0,775 0,786 0,781 0,794 0,925 0,936 0,939 40 0,944 0,953 0,961 0,943

Uji Aktivitas Azokaseinolitik Enzim

Hasil Filtrasi Gel

y = 0,0218x + 0,1015

R

2

= 0,9883

0 0,2

0,4

0,6

0,8

1 1,2

0

10

20

30

40

50 Waktu (menit)

Ab

so

rb

a

n

si

(7)

43

B. 3 Perhitungan Analisis Pemurnian Enzim

Unit aktivitas (U) didefinisikan sebagai perubahan absorban sebesar satu satuan yang terjadi per jam per mL sample.

Dari kurva dihasilkan persamaan garis y = ax + b, dimana gradien garis merupakan fungsi perubahan absorbansi terhadap waktu (menit)

m = dA/dt, sehingga

U = (dA/dt) × 60 × fp × 1/mL, fp = faktor pengenceran Maka didapatkan hasil sebagai berikut :

Sampel dA/dt Faktor pengenceran Unit aktivitas (U)

Ekstrak kasar 0,0194 1000 1164

Filtrasi gel 0,0218 40 52,3

Aktivitas total enzim didapatkan dari hasil kali unit aktivitas dengan volume total enzim. Sedangkan yield dihitung dari perbandingan aktivitas total ekstrak kasar enzim dengan enzim hasil filtrasi gel.

Sampel Unit Aktivitas (U) Volume total (mL) Aktivitas total

(U mL) Yield (%)

Ekstrak kasar 1164 50 58200 100

Filtrasi gel 52,3 135 7063 12

Aktivitas spesifik enzim adalah hasil bagi dari aktivitas total enzim dengan proteim total. Kelipatan pemurnian didapatkan dari hasil perbandingan aktivitas spesifik antara enzim hasil filtrasi gel dengan ekstrak kasarnya.

Sampel Protein total (mg) Aktivitas total (U mL)

Aktivitas spesifik

(U mL/ mg) Kelipatan pemurnian

Ekstrak kasar 580 58200 100 1

(8)

LAMPIRAN C

Optimasi Suhu dan pH

Unit aktivitas (U) pada pengujian optimasi pH dan suhu ini didefinisikan sebagai besarnya perubahan absorbansi sebesar satu satuan.

Aktivitas enzim pada pengujian optimasi pH dan suhu ini didefinisikan sebagai besarnya perubahan absorbansi sebesar satu satuan per menit per mL enzim.

Unit aktivitas (U)

=

(A

rata-rata

– A

blanko

)

(t

reaksi

– t

0

)

Aktvitas enzim

=

U × fp × 1/mL

C. 1 Optimasi Suhu

Aktivitas relatif merupakan perbandingan dari unit aktivitas berbagai suhu dengan unit aktivitas pada suhu 55o_C.

Suhu (o_{C) A}

1 A2 A3 Arata-rata

Aktivitas

(U/menit/mL) Aktivitas relatif (%)

34 0,414 0,415 0,434 0,421 0,842 31 40 0,620 0,636 0,736 0,664 1,328 48 47 0,949 0,959 0,917 0,940 1,881 68 50 1,069 1,073 0,990 1,044 2,088 75 54 1,148 1,159 1,132 1,146 2,292 83 55 1,367 1,378 1,390 1,378 2,756 100 56 1,331 1,350 1,312 1,331 2,662 96 59 1,214 1,187 1,127 1,176 2,352 85 62 0,979 1,128 1,100 1,069 2,138 77

(9)

45

Kurva Optimasi Suhu

0 20 40 60 80 100 120 30 35 40 45 50 55 60 65 suhu A k ti vi ta s r e la ti f (% ) C. 2 Optimasi pH

Aktivitas relatif pada pH merupakan perbandingan dari nilai unit aktivitas enzim pada berbagai pH dengan unit aktivitas enzim pH 8.

pH A1 A2 A3 Arata-rata Aktivitas (U/menit/mL) Aktivitas relatif (%) 4 0,164 0,137 0,152 0,151 0,015 14 5 0,383 0,397 0,351 0,377 0,038 36 6 0,961 0,950 0,992 0,967 0,098 91 7 1,043 1,006 1,043 1,031 0,103 97 8 1,063 1,063 1,070 1,065 0,107 100 9 1,263 1,315 1,210 1,262 0,126 118 10 1,264 1,130 1,009 1,134 0,113 106 11 1,130 1,124 1,136 1,130 0,113 106 12 1,09 1,084 1,123 1,099 0,109 103

(10)

Kurva Optimasi pH 0 20 40 60 80 100 120 140 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pH A k ti vi ta s r e la ti f (% )