1
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Munculnya resistensi mikrob patogen terhadap berbagai antibiotik (multiresisten) merupakan masalah serius dalam pengobatan penyakit infeksi. Multiresistensi mikrob patogen menyebabkan peningkatan morbiditas dan mortalitas akibat penyakit infeksi. Multiresistensi ini mendorong para peneliti di dunia mencari antibiotik baru yang lebih sensitif untuk melawan mikrob patogen yang resisten (Oskay et al., 2005; Parungao et al., 2007; Sulistyani, 2013).
Bahan alam dari mikrob merupakan sumber utama antibiotik dan obat-obat lain. Selama beberapa dekade, metabolit sekunder mikrob menjadi sumber utama antibiotik baru. Beberapa antibiotik yang ada di klinik saat ini merupakan hasil eksplorasi dari mikrob. Hingga saat ini masih banyak molekul baru metabolit sekunder bersumber dari mikrob yang potensial dikembangkan menjadi antibiotik baru (Genilloud et al., 2011). Menemukan senyawa antibiotik baru dan menambah keragaman kimia antibiotik yang sudah ada merupakan hal yang tidah mudah (Thaker et al., 2013).
Proses eksplorasi antibiotik yang dilakukan secara konvensional dengan skrining sejumlah besar strain terbukti tidak efisien karena membutuhkan waktu lama dan biaya besar (Genilloud et al., 2011). Selain itu, dalam pendekatan konvensional ini sering terjadi replikasi atau rediscovery, yaitu penemuan kembali molekul yang sudah dikenal luas setelah dilakukan penelitian panjang dan berkelanjutan (Busti et al., 2006). Dengan demikian penelitian yang sudah
2
dilakukan menjadi tidak produktif. Oleh karena itu harus dikembangkan pendekatan sistematis untuk dereplikasi sedini mungkin. Dereplikasi merupakan proses untuk membedakan senyawa atau metabolit sekunder yang sudah diketahui dengan senyawa yang diduga baru (Lang et al., 2008).
Pendekatan yang telah banyak dilakukan untuk dereplikasi adalah pendekatan genomik. Pendekatan molekuler (genomik) bertujuan untuk eksplorasi senyawa biosintetik baru berdasarkan studi genomik molekuler dengan fokus pada perangkat metagenomik dan biorekayasa. Pendekatan genomik ini menunjukkan perkembangan luar biasa pada beberapa tahun terakhir (Banik and Brady, 2008; Brady et al., 2009; Corre and Challis, 2009; Craig et al., 2009; Nett et al., 2009; Scherlach and Hertweck, 2009). Penerapan skrining dengan pendekatan gen biosintetik dapat digunakan untuk menemukan senyawa antibakteri glikopeptida yaitu pekiskomicyn. Strategi ini memberikan informasi keragaman kimia senyawa dalam mikrob sehingga dapat mempercepat penemuan bahan alam dari mikrob maupun informasi keragaman enzim biosintetik (Thaker et al., 2013). Salah satu pendekatan yang bisa dilakukan adalah dengan analisis gen NRPS (Non Ribosomal Peptide Synthetase). Pendekatan ini telah dilakukan oleh beberapa peneliti baik menggunakan gen NRPS saja maupun dikombinasi dengan gen PKS (Polyketide Synthase) (Ayuso et al., 2005; Zhao et al., 2007; Zhang et al., 2008; Pimentel-Elardo et al., 2012). NRPS dan PKS I adalah klaster enzim biosintetik yang terlibat dalam biosintesis sejumlah besar senyawa-senyawa aktif yang dihasilkan mikrob (Ayuso et al., 2005; Ayuso-Sacido and Genilloud, 2005). Berbagai senyawa biologis aktif poliketida dan peptida senyawa yang diaplikasikan di bidang kedokteran, pertanian, dan penelitian biokimia disintesis oleh PKS-I dan NRPS. Metabolit yang secara struktural beragam ini meliputi antibiotik (misalnya penisilin, vankomisin, dan eritromisin), antijamur (misalnya nistatin), antitumor (misalnya ansamitocin,
3
bleomycins), anthelmintik (misalnya, avermectin) dan imunosupresif (misalnya rapamycin dan FK506) (Ayuso-Sacido and Genilloud, 2005). Modul inti gen NRPS mengandung minimal 3 domain yaitu adenilasi (A), kondensasi (C) dan tiolasi atau peptidyl carrier protein (T or PCP) (Ansari et al., 2004). Adapun modul PKS-I mengkode setidaknya tiga domain yang berhubungan dengan ketosynthase (KS), acyltransferase (AT) dan acyl carrier protein (ACP) (Donadio and Katz, 1992; Anderson et al., 2000). Perbedaan profil klaster gen tersebut mengindikasikan adanya perbedaan metabolit sekunder yang dihasilkan oleh mikrob yang dianalisis. Hal ini menjadi dasar analisis keragaman mikrob berdasarkan perbedaan profil gen tersebut.
Pendekatan selain pendekatan molekuler yang telah digunakan untuk proses dereplikasi adalah pendekatan dengan analisis spektroskopi. Analisis spektroskopi yang sudah diterapkan yaitu analisis LC-MS (Liquid Chromatography – Mass Spectroscopy) (Cremin and Zeng, 2002; Tormo et al., 2003a; Genilloud et al., 2011) dan HPLC-NMR (High Performance Liquid Chromatography-Nuclear Magnetic Resonance (Lang et al., 2008). Prinsip pendekatan ini adalah mendeteksi adanya perbedaan antara spektra sampel uji dengan spektra senyawa-senyawa standar. Namun demikian, analisis LC-MS dan NMR untuk dereplikasi di awal penelitian akan membutuhkan biaya yang mahal (Field et al., 2008). Ketersediaan alat LC-MS dan NMR di Indonesia juga sangat terbatas sehingga memerlukan waktu tunggu yang lama karena banyak sampel yang harus dianalisis dari berbagai wilayah di Indonesia. Selain itu, data base spektra ESI-MS (Electrospray Ionization -Mass Spectroscopy) dan NMR yang universal tidak ada. ESI adalah metode ionisasi pada LC-MS. Para peneliti hanya menggunakan data base yang dimiliki oleh masing-masing peneliti atau kelompok.
4
Analisis spektroskopi lain yang potensial bisa digunakan untuk dereplikasi awal adalah spektroskopi infra merah (IR). Setiap senyawa memberikan spektrum yang spesifik, sehingga tidak ada dua senyawa yang memiliki spektrum yang sama. Hal ini disebabkan karena frekuensi vibrasi dipengaruhi oleh lingkungan ikatan (Field et al., 2008). Kesamaan spektra senyawa yang diteliti dengan spektra senyawa referensi menunjukkan kesamaan struktur kimia (Varmuza et al., 2003). Analisis spektroskopi IR belum pernah digunakan untuk proses dereplikasi pada ekstrak metabolit mikrob, tetapi lebih digunakan untuk analisis elusidasi struktur kimia.
Berdasarkan uraian tersebut, maka penelitian ini akan dilakukan dengan menerapkan pendekatan kombinasi antara analisis molekuler serta analisis spektroskopi IR untuk menentukan klaster sampel isolat bakteri tanah. Pendekatan ini akan diterapkan terhadap bakteri yang diisolasi dari tanah dan merupakan koleksi peneliti. Analisis molekuler dilakukan dengan teknik RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) terhadap produk PCR gen NRPS dan atau PKS I, artinya RFLP dilakukan terhadap gen yang dapat diamplifikasi pada proses PCR. Klaster gen NRPS dan PKS I ini mengkode cakupan yang luas berbagai senyawa aktif antibiotik, anti inflamasi, imunosupresan, toksin dan siderophore (Ayuso-Sacido and Genilloud, 2005; Zhang et al., 2008; Caboche et al., 2010). Oleh karena itu pendekatan molekuler dengan gen PKS I dan NRPS ini dapat digunakan secara luas untuk mendapatkan senyawa peptida non ribosomal maupun poliketida dengan berbagai aktivitas. Adapun pemilihan spektroskopi IR adalah karena spesifisitas spektra yang berbeda dari setiap senyawa, sehingga tidak ada dua senyawa yang memiliki spektrum yang sama (Field et al., 2008) dan merupakan metode yang relatif murah dibandingkan metode-metode yang sudah digunakan sebelumnya seperti LC-MS dan NMR.
Koleksi bakteri tanah yang digunakan pada penelitian ini berpotensi menghasilkan antibiotik karena telah diuji dan menunjukkan aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri
5
Staphyllococcus aureus dan atau Escherichia coli. Koleksi tersebut diisolasi dari berbagai sumber yaitu rizosfer tanaman padi (Oriza sativa L.), rizosfer tanaman tin (Ficus carica L.) dan rizosfer tanaman obat (Kurniasari, 2012; Ramadhan, 2012). Penelitian yang pernah dilakukan terkait koleksi tersebut adalah isolasi dari tanah dan dilakukan uji antibakteri menggunakan metode agar block (Nedialkova and Naidenova, 2005). Isolat bakteri yang menunjukkan aktivitas antibakteri dikoleksi oleh peneliti. Koleksi tersebut belum diteliti lebih lanjut baik tentang senyawa yang terkandung maupun karakteristik genomik.
Berdasarkan uraian tersebut, secara garis besar dapat dirumuskan beberapa permasalahan penelitian sebagai berikut :
1. Isolat bakteri manakah yang menghasilkan fraksi aktif antibakteri dari fermentasi kultur? 2. Bagaimana keragaman molekuler isolat-isolat bakteri yang menghasilkan fraksi aktif
antibakteri ?
3. Bagaimana keragaman spektra IR fraksi aktif antibakteri dari isolat-isolat bakteri terpilih? 4. Isolat bakteri manakah yang terpilih berdasarkan kombinasi analisis molekuler dan
spektra IR?
5. Adakah perbedaan taksonomi berdasarkan sekuen gen 16S rRNA di antara isolat-isolat bakteri yang terpilih mewakili tiap klaster?
6. Apakah metode pendekatan molekuler dan spektroskopi IR berhasil mendapatkan isolat-isolat bakteri terpilih yang menghasilkan fraksi aktif antibakteri dengan kandungan kimia berbeda-beda?
6
Tujuan umum penelitian ini adalah menerapkan pendekatan kombinasi antara analisis molekuler serta analisis spektroskopi IR untuk seleksi bakteri tanah penghasil senyawa antibakteri. Penelitian ini tidak membandingkan dengan pendekatan-pendekatan sebelumnya, namun mengaplikasikan pendekatan baru yang diharapkan dapat mengelompokkan sekumpulan isolat bakteri berdasarkan karakteristik molekuler dan kimiawi sekaligus. Diharapkan, bakteri yang terseleksi mewakili masing-masing kelompok, memiliki karakteristik molekuler dan kimiawi yang berbeda.
Tujuan khusus penelitian ini adalah :
1. Mendapatkan isolat bakteri tanah yang menghasilkan fraksi aktif antibakteri dari fermentasi kultur.
2. Mengetahui keragaman molekuler dari isolat-solat bakteri yang menghasilkan fraksi aktif antibakteri.
3. Mengetahui keragaman spektra IR fraksi aktif antibakteri dari isolat bakteri terpilih. 4. Memilih isolat bakteri yang mewakili tiap klaster berdasarkan kombinasi analisis
keragaman molekuler dan spektra IR.
5. Mengidentifikasi perbedaan taksonomi di antara isolat-isolat bakteri terpilih berdasarkan sekuen gen 16S rRNA.
6. Membuktikan bahwa pendekatan molekuler dan spektroskopi IR berhasil mendapatkan isolat bakteri terpilih yang menghasilkan fraksi aktif antibakteri dengan kandungan kimia berbeda-beda.
7
Pendekatan yang telah dilakukan dalam rangka mengeksplorasi sumber mikrob penghasil antibiotik baru adalah pendekatan molekuler, spektroskopi atau kombinasi. Pendekatan molekuler dilakukan dengan menganalisis keberagaman isolat mikrob melalui analisis sequencing gen 16S rDNA (Anderson and Wellington, 2001; Egan et al., 2001; Morningstar et al., 2006; Guo et al., 2008; Alam et al., 2010). Selain itu beberapa metode molecular fingerprinting juga bisa diterapkan seperti AFLP, RAPD, REP-PCR fingerprinting, RFLP untuk mendeteksi variabilitas spesies Actinomycetes (Welsh and McClelland, 1990; Versalovic et al., 1994; Vos et al., 1995; Lanoot et al., 2005; Faizal et al., 2008). Fingerprinting juga bisa dilakukan terhadap gen-gen biosintetik yaitu gen PKS dan NRPS (Ayuso et al., 2005; Ayuso-Sacido and Genilloud, 2005). Adapun analisis spektroskopi yang sudah digunakan untuk dereplikasi adalah spektroskopi massa (Cremin and Zeng, 2002; Janso and Carter, 2010; Genilloud et al., 2011) dan NMR (Lang et al., 2008).
Keaslian penelitian ini adalah penggunaan pendekatan kombinasi metode analisis molekuler menggunakan analisis molekuler dengan teknik RFLP dan analisis spektroskopi IR untuk dereplikasi. Pendekatan kombinasi ini belum pernah dilakukan pada penelitian-penelitian sebelumnya. Pendekatan kombinasi yang sudah digunakan sebelumnya ada 2 yaitu kombinasi high throughput screening (HTS) dengan LC-MS (Genilloud et al., 2011) dan kombinasi analisis molekuler (gen PKS-NRPS) dengan LC-MS (Janso and Carter, 2010). Adapun pada penelitian ini adalah kombinasi analisis molekuler dengan spektroskopi IR.
D. Manfaat dan Luaran Penelitian
8
1. Mengembangkan metode untuk dereplikasi dalam rangka memilih isolat bakteri yang memiliki karakteristik molekuler dan kimiawi yang berbeda-beda. Dalam jangka panjang metode ini dapat digunakan untuk eksplorasi antibiotik baru. Hal ini disebabkan karena dengan metode ini dapat dipilih strain yang berbeda dan memiliki kandungan kimia yang berbeda dalam satu program penelitian.
2. Membantu program pemerintah meningkatkan taraf kesehatan masyarakat melalui eksplorasi antibiotik dari bakteri penghasil. Antibiotik merupakan obat utama untuk melawan penyakit infeksi mikrob.
3. Dalam eksplorasi antibiotik sangat mungkin ditemukan antibiotik baru sehingga di bidang kedokteran dapat menjadi alternatif pilihan terapi antibiotik dalam pengobatan penyakit infeksi. Hal ini mendukung peningkatan kesembuhan dari penyakit infeksi.
