UNIVERSITAS MERCU BUANA YOGYAKARTA TEKNOLOGI FERMENTASI DAN ENZIM

UNIVERSITAS MERCU BUANA

YOGYAKARTA

TEKNOLOGI FERMENTASI DAN

ENZIM

BAB X

PENGUNDUHAN DAN PEMURNIAN

PRODUK

Untuk produk dengan biaya besar perlupemilihan proses yang tepat dan efisien

Hal yang perlu diperhatikan dalam pemilihan proses pengunduhan dan pemurnian produk:

1. Lokasi produk yang diinginkan ( Intraseluler/ekstra

seluler)

2. Proses fermentasi yang dilaksanakan (kultur padat/cair) 3. Karakteristik fisiko-khemis produk

4. Kosentrasi produk dalam cairan fermentasi ( biasanya

rendah )

5. Kandungan substransi lain dalam cairan

6. Bentuk produk yang diinginkan (padat, cair, atau

Kristal)

7. Kemurnian produk 8. Nilai ekonomis produk

Pengunduhan dan pemurnian tidak lepas dari proses sebelumnya mengacu pada kemudahan pengunduhan dan pemurnian produk fermentasi antara lain :

1. Seleksi mikroorganisme

Pilih yang bersifat flokulan untuk memudahkan pemisahan sel dari cairannya

2. Modifikasi kondisi fermentasi untuk mengurangi metabolit yang tidak diinginkan

3. Ketepatan waktu pengunduhan

4. Pengendalian pH dan suhu setelah pengunduhan 5. Penambahan flokulan/immobile

SEPARASI MEKANIS

1. Pengapungan

Merupakan cara pemisahan yang didasarkan

perbedaan aktifitas permukaan dari suatu substansi ( yang berupa mikrooorganisme, makromolekul, spt protein, atau koloidal ) yang secara selektif diadsorbsi atau ditarik

kepermukaan olejh gelembung-gelembung yang diintroduksikan dari bagian bawah.

Substansi yang dipisahkan akan mengumpul di permukaan dan kemudian dipisahkan melalui over flow.

Pemisahan dapat dilakukan dengan bantuan surfaktan ( mis asam lemak, amina atau senyawa ammonium )

Variable yang berperanan :

• pH

• Kecepatan Udara

• Kosentrasi surfaktan

Pemisahan B.coli dengan konsentrasi awal 7,2 x 108 _sel/ml

menggunakan asam laurat stearilmina atau toktilamina mengahsilkan pemisahan 90% dalam waktu 10 menit

2. Presipitasi

Digunakan penambahan senyawa yang mampu membentuk senyawa kompleks atau garam tidak larut a. Isolasi teramisin digunakan senyawa ammonium

rantai panjang untuk proses presipitasi yang dilanjutkan dengan filtrasi

b. Polimer dengan BM tinggi (dekstran dan polietilen glikol ) digunakan untuk presipitasi protein

c. Salting out protein digunakan untuk memperoleh fraksi protein dengan menggunakan agensia ammonium dan sodium sulfat

d. Solvent organic (methanol, etanol, aseton) sering digunakan untuk presipitasi dekstran

3. Sedimentasi

Merupakan cara pemisahan berdasarkan

gaya gravitasi .

Berlaku hokum STOKE yang menyatakan

bahwa kecepatan sedimentasi partikel yang

tersuspensi dalam cairan yang bersifat Newtonian

adalah proporsional dengan kuadrat diameter

V

= Kecepatan sedimentasi (m/dt)

D

= diameter partikel mikroorganisme (m)

g

= gaya gravitasi (m/dt

2

₎

Pp = densitas parikel mikroorganisme (kg/m

3

₎

Pf

= densitas liquid (kg/m

3

₎

µ

= viskositas liquid

Apabila partikel tersuspensi dalam larutan

dengan viskositas tinggi, maka gerakan partikel

turun kebawah akan diimbangi dengan gerakan

liquid ke atas

4. Sentrifugasi

Pemisahan yang didasarkan oleh adanya perbedaan bobot jenis masing-masing komponen oleh adanya gaya sentrifugal

Pemisahan dengan sentrifugal dilakukan bila : 1. Perbedaan bobot jenis masing-masing komponen tidak jauh berbeda

2. Pemisahan sulit dilakukan dengan cara penyaringan 3. Sel mikroorganisme atau padatan tersespensi harus bebas dari filter aids

4. Diperlukan pemisahan secara kontinyu dengan tujuan untuk memperoleh standard higienis yang tinggi

5. Filtrasi / penyaringan

Merupakan cara pemisahan partikel dari

cairannya menggunakan medium porous

Hal-hal yang harus diperhatikan :

a.

Viskositas dan denditas filtrate

b.

Sifat partikel (bentuk, ukuran, karakteristik,

dan

distribusi ukuran )

c.

Rasio solid : liquid

d.

System produksi (batch / continue )

e.

Skala produksi

f.

Kondisi aseptis /non aseptis

Proses filtrasi dapat berlangsung bila ada

force yang dikenakan pada system yang berupa

perbedaan tekanan inlet dan outlet

Pada prinsipnya ada 3 cara :

1.

Berdasarakan gaya gravitasi

2.

Pengisapan ( filtrasi vakum )

3.

Penekanan ( filtrasi tekan )

Resistensi dapat terjadi selam proses filtrasi

oleh filter dan cake yang terbentuk. Pembentukan

cake semakin akan menyebabkan penurunan

kecepatan filtrasi.

Untuk memperbaiki proses filtrasi dapat

ditambahkan filter aids untuk mencegah

penyubatan filter. Filter Aids yang umum di

gunakan adalah Kieselghur (tanah diatomae)

Cara penggunaan filter aids:

a.

Dibuat lapis tipis filter aids sebelum dilakukan

filtrasi

b.

Filter aids dicampur pada cairan yang akan di

Disprupsi (Penghancuran Sel)

Dilakukan untuk mengeluarkan isi sel

mikroorganisme. Metode yang digunakan harus

menjamin

tidak

menyebabkan

kerusakan

(denaturasi) substansi dan tidak menyebabkan

terjadinya reaksi yang merugikan (mis hidrolisa )

Metode disrupsi sel :

1.

Metode fisiko mekanis : liquid shear, solid

shear, abrasive agitasi, freeze thawing.

2.

Metode khemis : penggunaan detergen, shock

1. Liquid shear

Digunakan homogenizer bertekanan tinggi hingga 550 kg/cm2 _{pada suspense yeast 60 % dilakukan}

pendinginan sampai 0,40_{c untuk mengurangin}

terjadinya kehilangan aktifitas enzim oleh panas yang di hasilkan selama homogenisasi

2. Solid shear

Ekstraksi mikroorganisme beku (-250_{c) bertekanan}

melalui orifice. Pengahancuran sel terjadi akibat kombinasi liquid shear melalui orifice dan adanya Kristal-kristal es.

3. Abrasive agitasi

Pengahancuran sel secara mekanis dengan

menggunakan disintegrator. Suhu dapat mencapai

35

0

_{C, perlu diperhatikan aktifitas enzim yang}

dihasilkan.

4. Freeze thawing

Pembekuan dan pencairan pada sel yang menyebabkan penghancuran sel. Proses berjalan lambat dan hanya terbatas substansi seluler saja. Enzim β –galaktosidase dapat dipisahkan dari sel S. cerevisae dengan cara sampel uyeast beku dibiarkan 10 jam pada 50_{C selama pencarian. Proses dilakukan}

5. Penggunaan detergen

Detergen akan merusak lipoprotein sel membrane mikroorganisme sehingga komponen entraselullar keluar. Senyawa yang digunakan : ammonium, sodium lauri, sulfat tween.

Detergen dapat menyebabkan protein mengalami denaturasi sehingga perlu dilakukan pemisahan lebih dulu sebelum dilakukan pemurnian lebih lanjut.

Disuspensikan dengan buffer pH6, tambahkan 1 % sodium kholat campuran diaduk selama 1 jam sehingga sebagian besar enzim larut.

6. Shock osmotic

Diakibatkan oleh perubahan mendadak konsentrasi garam sehingga menyebabkan pengahancuran sel.

Cara ini dapat diterapkan pada ektraksi enzim lusifarase dari photobacterium fischeri

7. perlakuan dengan alkali

Dapat digunakan untuk hidrolisa dinding sel

mikroorganisme yang toleran terhadap pH 11,5

12,0 selama 20-30 menit. Cara ini digunakan

untukn isolasi enzim aspariginase

.

8. Perlakuan dengan enzim

Enzim mempunya kemampuan menghidrolisa ikatan dalam sel mikroorganisme. Enzim yang dimaksud mis lisosim dan ekstrak enzim dari leukosit, enzim dari Streptomices, Micromonospora, Penicilium, Tricoderma.

Metode relatif sederhana tetapi perlu biaya tinggi dan relative suliit dalam proses pemurniannya.

S

EPARASI

SYSTEM

KESEIMBANGAN

1. Ekstraksi liquid-liquid

Merupakan pemisahan komponen dari campurannya dengan solvent yang melarutkan komponen tersebut.

Diisyaratkan agar dapat diperoleh produk terekstrak yang berkadar tinggi dalam solvent yang kecil.

Sebelum dilakukan ekstraksi dalam skala besar perlu diketahui lebih dulu solibilitas karakteristik produk skala kecil menggunakan berbagai solvent. Pedoman yang digunakan like dissolved like (dalam artian polaritas molekul )

Solvent dari senyawa non polar adalah liquid dengan polaritas rendah atau nol, sebaliknya solvent untuk senyawa polar ada liquid dengan polaritas tinggi.

Konstanta dielektrik merupakan ukuran derajat polarisasi dari senyawa. Jika nilai ini deiketahui maka kemungkinan untuk meramalkan seuatu senyawa polar atau non polar.

2. Destilasi

Merupakan pemisahan komponen dari

campurannya yang didasarkan atas perbedaan

titik didih masing-masing komponen.v

Tahapan proses destilasi :

1.

Evaporasi campuran

2.

Pemisahan vapor liquid dalam kolom sehingga

terpisahkan komponen dengan titik didih

rendah dari komponen dengan titik didih tinggi.

P

URIFIKASI

/

PEMURNIAN

Pemurnian dapat dilakukan dengan cara :

1.

Khromatografi adsorbs

2.

Ion exchange

3.

Filtrasi gel

4.

Afinitas

1. Khromatografi Adsorbsi

Melibatkan pengikatan solu pada fase-fase solid oleh ikatan vander wals.

Kolom yang digunakan berisi adsorben (karbon aktif, alumunium oksida, alumunium hidroksida, magnesium oksida, silica gel) dan resin makroporous.

Dihidroksi streptomisin dapat diekstraksi dari cairannya menggunakan kolom charcoal, kemudian dielusi dengan asam hidroklorit metanolat untuk selanjutnya dimurnikan.

Karbon aktif digunakan untuk menghilangkan pigmen atau menjernihkan cairan fermentasi. Resin digunakan untuk memurnikan cephalosporin, desferioksamin, dan parametason.

2. Ion Exchange

Merupakan cara pemurnian dengan perubahan ion yang reversible antara fase liquid dengan fase solid yang tidak diikuti dengan perubahan radikal dalam struktur solid.

Dikenal ion exchange resing yang mempunyai komponen utama divinil stiren kopolimer yang mengikat grup reaktif, sehingga memberikan sifat kationik atau anionic exchange.

Resin kationik umumnya mengandung asam sulfonat asam karboksilat atau asam fosfat.

Resin anionic mengandung amina, ammonium.

Dalam pemurnian streptomisin, cairan fermentasi dilewatkan keresin kation seperti amberlite IRC-50. Antibiotic ini akan diadsorbsi kan ke kolom

3. Filtrasi Gel

Merupakan proses filtrasi dengan solute BM tinggi akan bertahan pada filter yang mempunyai pori-pori sangat lembut, sedang solvent dan solute dengan BM rendah akan lolos tersedia membrane dengan BM 500 – 500.000, sehingga dimungkinkan untuk melakukkan pemisahan makromolekul seperti protein, enzim, hormone.

4. Afinitas

Teknik pemisahan ini sangat potensial untuk berbagai tujuan karena dapat memisahkan dan memurnikan molekul biologis. Teknik ini didasarkan pada fungsi dan struktur kimia suatu senyawa biologis. Teknik ini tergantung dari interaksi antara senyawa biologis dan pasangannya seperti enzim, substrat, inhibitor, antigen, antibody.

Molekul yang akan dimurnikan secara spesifik diadsorbsi oleh ligan yang diimobilisasi pada metik. Ligan dapat terikat pada matriks secara adsorbs atau khemis.

KRISTALISASI

Kristalisasi merupakan cara pemisahan

yang banyak digunakan dalam produksi asam

organic dan asam amino. Pada produksi asam

sitrat, cairan fermentasi ditambahkan kalsium

hidroksida dengan tujuan presipitasi Ca-sitrat.

Kristal Ca-sitrat kemudian difiltrasi dan

direaksikan dengan sulfat tak larut sehingga akan

dibebaskan asam sitrat kembali. Larutan asam

sitrat kemudian dikristalisai

PENGERINGAN

Pengeringan merupakan cara pemisahan system solid-luquid dengan cara menguapkan liquidnya (atau airnya) . pengeringan dapat dilakukan dengan cara spray drier untuk material biologis sehingga produk yang diperoleh tidak mengalami kerusakan. Bila material yang dikeringkan bersifat stabil terhadap pemanasn, digunakan pengeringan dengan drum drier yang mempunyai efisiensi tinggi.

Keuntungan yang diperoleh dangan pengeringan :

1. Mengehemat ongkos transport.

2. Material yang diperoleh mudah ditangani dan

dikemas.

3. Tidak memerlukan fasilitas penyimpanan