II. BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahapan. Tahapan –tahapan tersebut terdiri dari proses penyiapan dan ekstraksi tanaman, penyediaan bakteri, pengujian sensitivitas bakteri S. agalactiae dan A. hydrophila terhadap tanaman yang telah diekstraksi, dan pengujian minimum inhibitory concentration (MIC). 2.1 Penyediaan Tanaman
Tanaman uji diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatika (BALITTRO) Cimanggu, Bogor (Lampiran 1). Tanaman tersebut dibersihkan dari kotoran yang melekat dengan air mengalir, kemudian dipilih bagian yang akan digunakan. Untuk penyiapan umbi dan rhizoma dengan cara diiris tipis terlebih dahulu. Bagian tanaman yang telah dipilih selanjutnya dilakukan proses pengeringan dengan menggunakan blower (Lampiran 2) pada kisaran suhu 55-60oC. Sediaan bahan yang telah kering tersebut kemudian dihaluskan dengan blender. Setelah itu disimpan dalam wadah tertutup dan terhindar dari cahaya matahari. Sampel tumbuhan sebanyak 18 tanaman disajikan pada Tabel 1 di bawah ini:
Tabel 1. Sampel tumbuhan dan bagian yang diekstraksi No. Nama lokal Nama ilmiah
Bagian yang digunakan
1. Kunyit Curcuma domestica Rhizoma
2. Ketapang Terminalia catappa Daun
3. Kipahit Tithonia diversifolia Daun
4. Babandotan Ageratum conyzoides Semua bagian
5. Kirinyuh Eupatorium inulaefolium Daun
6. Meniran Phyllanthus niruri Semua bagian
7. Temu lawak Curcuma xanthorrhiza Rhizoma
8. Talas Colocasia esculenta Daun
9. Sirih Piper betle Daun
10. Kunyit putih Curcuma zedoaria Rhizoma
11. Kimanila Cassia alata Daun
12. Jawer kotok Plectranthus scutellaroides Daun
13. Combrang Etlingera elatior Daun
Lanjutan Tabel 1
No. Nama lokal Nama ilmiah Bagian yang
digunakan
15. Cebreng Gliricidia sepium Daun
16. Petai Parkia speciosa Daun
17. Bawang putih Allium sativum Umbi
18. Petai cina Leucaena leucocephala Daun
2.2 Ekstraksi Tanaman
Ekstraksi tanaman dilakukan dengan metode maserasi atau perendaman dari Pachanawan et al. (2008) dengan beberapa modifikasi. Ekstraksi komponen bioaktif tanaman pada Tabel 1 di atas menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 95% (Pro Analis) dan double distilled water (ddH2O).
a) Maserasi dengan Etanol 95%
Serbuk tanaman direndam pada pelarut dengan perbandingan 1:10 (w/v), pada penelitian ini digunakan 10 gram serbuk /100 mL. Masing-masing tanaman dilakukan sebanyak tiga ulangan. Diagram alir maserasi dengan pelarut etanol disajikan sebagai berikut (Gambar 1).
Gambar 1. Diagram alir metode maserasi komponen bioaktif tanaman dengan pelarut etanol 95%.
Sebanyak 10 gram serbuk tanaman direndam pada 100 mL etanol 95% selama 72 jam pada suhu ruang, untuk melarutkan komponen bioaktif pada tanaman tersebut. Setelah 72 jam larutan tersebut difilter dengan saringan teh ukuran ±1,2 mm (filter 1). Penyaringan selanjutnya digunakan saringan yang lebih
Sebuk tanaman dimaserasi 72 jam dengan etanol 95% (100 mL)
Hasil maserasi difiltrasi (filter 1,2,3)
Filtrat dievaporasi
Ekstrak kasar Serbuk tanaman (10 gram)
kecil ±0,6 mm (filter 2). Setelah tahapan filter kedua, digunakan kertas saring Whatman no. 125 sebagai filter ke tiga. Kemudian tahapan terakhir adalah dilakukan evaporasi. Rendemen ekstrak hasil evaporasi tersebut kemudian disimpan di freezer.
b) Maserasi dengan ddH2O
Serbuk tanaman direndam dengan ddH2O dengan perbandingan 1:10 (w/v). Digunakan 10 gram serbuk /100 mL ddH2O dan dilakukan sebanyak tiga ulangan. Diagram alir maserasi dengan pelarut ddH2O disajikan sebagai berikut (Gambar 2).
Gambar 2. Diagram alir metode maserasi komponen bioaktif tanaman dengan pelarut ddH2O.
Sebanyak 10 gram serbuk tanaman dilarutkan pada 100 mL ddH2O selama 72 jam pada suhu ruang. Setelah 72 jam larutan tersebut disaring dengan menggunakan saringan teh ukuran ±1,2 mm (filter 1). Saringan yang lebih kecil ±0,6 mm digunakan sebagai filter ke dua. Selanjutnya setelah melewati filter ke dua, difilter kertas saring Whatman no.125 (filter 3). Untuk mendapatkan supernatan, ekstrak yang telah melewati filter ke tiga disentrifugasi dengan kecepatan 5.000 g selama 10 menit. Supernatan kemudian diambil dengan menggunakan syringe 50 mL dan difiltrasi dengan saringan bakteri ukuran 0,22 dan 0,20 µm. Kemudian supernatan tersebut disimpan di freezer.
Serbuk tanaman dimaserasi 72 jam dengan ddH2O (100 mL) Hasil maserasi difiltrasi (filter 1,2,3)
Filtrat disentrifugasi 5.000 g (10 menit)
Supernatan
Supernatan difiltrasi dengan saringan bakteri 0,22 dan 0,20 µm Serbuk tanaman (10 gram)
2.3 Penyediaan Bakteri
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah A. hydrophila dan S. agalactiae. Kedua bakteri ini adalah koleksi Laboratorium Patologi BPPBAT Sempur, Bogor. Sebelum dipergunakan bakteri tersebut diidentifikasi terlebih dahulu dengan metode pewarnaan Gram dan uji Biokimia. Bakteri A. hydrophila ditumbuhkan pada media Müller Hinton Agar (MHA) dan Müller Hinton Broth (MHB), sedangkan untuk bakteri S. agalactiae ditumbuhkan pada media brain heart infusion agar (BHIA) dan brain heart infusion broth (BHIB).
2.4 Pengujian Sensitivitas Bakteri S. agalactiae dan A. hydrophila terhadap Ekstrak Tanaman
a) Persiapan Suspensi Bakteri
Persiapan bakteri untuk uji sensitivitas dilakukan dengan metode direct colony suspension (NCLLS 2005). Bakteri digores pada cawan petri yang telah berisi medium MHA untuk A. hydrophila dan medium BHIA untuk S. agalactiae, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 34o C. Setelah 24 jam, dipilih beberapa koloni dengan ose dan dihomogenkan dengan vortex pada phosphate buffer saline (PBS) steril. Selanjutnya suspensi bakteri disamakan turbiditasnya dengan McFarland 0,5 yaitu dengan nilai absorbansi 0,08-0,1 pada panjang gelombang 625 nm. Nilai absorbansi tersebut kira-kira setara dengan 1,5x108 CFU/mL (NCLLS 2005). Suspensi bakteri tersebut diupayakan disebar dengan waktu pengerjaan tidak lebih dari 15 menit.
b) Prosedur uji sensitivitas bakteri terhadap bahan
Pengujian sensitivitas bakteri S. agalactiae dan A. hydrophila terhadap tanaman yang telah diekstraksi dilakukan dengan metode Kirby Bauer (NCLLS 2005). Tahap pertama pada pengujian sensitivitas bakteri terhadap bahan uji ini adalah persiapan ekstrak pada kertas cakram. Ekstrak kasar dilarutkan dengan etanol 95% hingga konsentrasinya 100.000 ppm, kemudian ekstrak diteteskan pada kertas cakram yang berdiameter 6 mm sebanyak 20 µL dan ditunggu hingga pelarut etanol 95% menguap (± 3 menit). Konsentrasi ekstrak tiap kertas cakram adalah 2000 µg/kertas cakram (Lampiran 3).
Tahap kedua adalah mempersiapkan bakteri A. hydrophila dan S. agalactiae pada masing-masing medium agar. Sebanyak 100 µL bakteri yang
telah disamakan nilai absorabansinya dengan McFarland 0,5 diteteskan pada permukaan medium agar yang telah mengeras. Bakteri yang telah diteteskan tersebut disebar secara merata pada permukaan agar dengan teknik swabbing. Digunakan cotton bud steril sebagai alat penyebarnya. Masing-masing kertas cakram yang telah berisi ekstrak kemudian ditempelkan pada permukaan agar yang telah disebar bakteri dengan bantuan pinset steril secara aseptik. Cawan petri tersebut kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 34°C. Ekstrak tanaman yang positif memiliki zat antibakteri, akan terbentuk zona bening pada sekeliling kertas cakram (Lampiran 4). Diameter zona bening dihitung secara total menggunakan jangka sorong. Metode untuk uji sensitivitas bakteri terhadap bahan uji dapat dilihat pada Gambar 3.
Gambar 3. Tahapan uji sensitivitas antibakteri 2.5 Uji Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
Uji minimum inhibitory concentration (MIC) ini dilakukan dengan metode Macrodilution (NCLLS 2005) dengan beberapa modifikasi. Uji MIC ini dilakukan pada dua macam hasil ekstraksi yakni ekstraksi dengan ddH2O dan dengan etanol 95%.
Suspensi bakteri diukur absorbansinya 0,08-0,1 pada 625 nm Kertas cakram ditetesi ekstrak 20 µL Suspensi bakteri disebar dengan teknik swabbing
pada permukaan agar sebanyak 100 µL
Kertas cakram diuapkan hingga pelarut menguap atau hingga permukaannya kering
Kertas cakram diletakkan secara aseptik pada permukaan agar yg telah disebar bakteri uji
Agar yang berisi bakteri dan kertas cakram diinkubasi selama 24 jam Pengamatan dan pengukuran zona bening
a) Persiapan Suspensi Bakteri
Persiapan bakteri untuk uji MIC dilakukan dengan mengkultur bakteri uji pada masing-masing media cair, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Media MHB untuk bakteri A. hydrophila dan BHIB untuk S. agalactiae. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kultur bakteri diukur turbiditasnya pada panjang gelombang 625 nm. Dicari nilai absorbansi 0,08-0,1 atau disetarakan dengan McFarland 0,5. Bakteri dengan nilai absorbansi 0,08-0,1 dikatakan setara dengan 108 CFU/mL. Setelah itu kultur bakteri tersebut diencerkan sehingga didapatkan stok 106 CFU/mL.
b) Prosedur uji MIC dengan metode macrodilution pada ekstraksi dengan ddH2O.
Ekstraksi dengan ddH2O dilakukan tanpa melalui proses evaporasi, sehingga nilai konsentrasinya didapat dari perbandingan serbuk tanaman dengan pelarutnya. Untuk uji MIC pada ekstrak hasil maserasi dengan ddH2O, digunakan double strength broth atau media cair dengan kuantitas serbuk medianya dua kali dosis (Lampiran 5). Pertama-tama dipersiapkan larutan stok dari ekstrak tanaman yang diperoleh dengan mencampurkan 1 mL larutan ekstrak dengan 1 mL media cair double strength untuk masing-masing bakteri. Larutan stok ini nilai konsentrasinya setengah dari nilai konsentrasi awal, konsentrasinya adalah sebesar 50.000 ppm.
Setelah larutan stok dipersiapkan, selanjutnya dipersiapkan tabung reaksi sebanyak 12 buah untuk masing-masing ekstrak tanaman. Tabung reaksi diisi dengan media cair double strength untuk masing-masing bakteri sebanyak 1 mL dimulai dari tabung nomor 2 hingga tabung nomor 12. Tabung pertama dan kedua diisi dengan larutan stok, tabung ke-2 yang telah berisi larutan ekstrak 1 mL dan media cair double strength sebanyak 1 mL dihomogenasi vortex kemudian diambil 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung nomor 3, dilakukan seterusnya hingga tabung ke-11. Pada tabung ke-11, sebanyak 1 mL larutan tidak dimasukkan ke tabung ke-12 tetapi dibuang. Tabung ke-12 merupakan kontrol yang berisi media saja. Setelah keduabelas tabung tersebut berisi masing-masing konsentrasi larutan, kemudian masing-masing tabung diisi suspensi bakteri
dengan kepadatan 106 CFU/mL sebanyak 1 mL (Lampiran 6). Pengenceran konsentrasi dilakukan dengan deret geometrik (Lampiran 7).
Tabung-tabung yang telah berisi ekstrak dan bakteri tersebut diinkubasi pada suhu 34°C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, diamati tabung yang relatif bening dibandingkan kontrol (tabung 12) secara visual. Kemudian campuran ekstrak dan suspensi bakteri tersebut disebar sebanyak 50 µL di media agar BHIA untuk S. agalactiae dan MHA untuk A. hydrophila pada cawan petri, dimulai dari tabung yang relatif bening hingga tabung ke-1. Kemudian diinkubasi selama 24 jam, selanjutnya dihitung jumlah koloninya. Jumlah bakteri pada uji MIC ini dalam bentuk log koloni/mℓ. Berdasarkan Pankey dan Sabath (2010), MIC adalah konsentrasi terendah ekstrak tanaman uji yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba sebanyak 90%-99% (1 log koloni dari jumlah koloni awal).
c) Prosedur uji MIC dengan metode Macrodilution pada ekstrak hasil maserasi dengan etanol 95%.
Ekstraksi hasil maserasi dengan etanol 95% dilakukan melalui tahap evaporasi sehingga didapatkan ekstrak kasar. Untuk membuat larutan stok, dilakukan pencampuran ekstrak kasar dengan pelarut broth sehingga didapatkan konsentrasi yang diinginkan yaitu 50.000 ppm. Karena ekstrak kasar hasil evaporasi dengan ethanol 95% sebagian besar berupa pasta yang agak berminyak. Pencampuran ekstrak kasar dengan broth ditambahkan emulsifier Polysorbate 80 (Tween 80) supaya ekstrak terlarut sempurna. Hal ini menurut Purseglove et al. (1981) dalam Fadhilla (2010), penggunaan alkohol dengan konsentrasi lebih dari 70% akan menghasilkan ekstrak dengan kandungan fixed oil tinggi. Broth dipanaskan terlebih dahulu pada suhu sekitar 45o C sebelum ekstrak dilarutkan. Ditambahkan Tween 80 sebanyak 0,1 gram untuk melarutkan 0.1 gram ekstrak kasar. Setelah ekstrak kasar dan broth terlarut sempurna, sebelum dimasukkan ke dalam tabung reaksi dilakukan filtrasi terlebih dahulu menggunakan filter bakteri dengan ukuran pori-pori 0,20 µm. Langkah selanjutnya relatif sama dengan prosedur uji MIC dengan metode macrodilution pada ekstrak hasil maserasi dengan ddH2O.
