PERAGIAN ALKOHOLIK
1. Tujuan
Mengetahui pengaruh temperature terhadap proses fermentasi dan mengetahui zat penghambat aktivitas enzim yang bekerja pada proses fermentasi alkoholik
2. Prinsip
Berdasarkan reaksi glikolisis , di mana glukosa di ubah menjadi dua molekul piruvat melalui 10 tahapan reaksi enzimatik, berdasarkan reaksi dekarboksilasi piruvat, di mana piruvat di ubah menjadi asetaldehid dan CO2 dengan bantuan enzim piruvat dekarboksilase, dan berdasarkan reaksi dehidrogenasi asetaldehid, di mana asetaldehid akan di ubah menjadi alkohol (etanol) dengan bantuan enzim alkohol dehirogenase.
4. Teori
Fermentasi mempunyai pengertian aplikasi metabolisme mikroba untuk mengubah bahan baku menjadi produk yang bernilai tinggi, seperti asam–asam organik, protein sel tunggal, antibiotika, dan biopolymer. Salah satu produk yang dihasilkan dalam proses fermentasi adalah ethanol (Puspitasari dan Sidik, 2009).
Produksi etanol dapat diperoleh dari gula (sukrosa) dengan proses fermentasi secara anaerob (tanpa O2) oleh aktifitas khamir Saccharomyces cerevisiae. Saccharomyces cerevisiae telah lama digunakan dalam industri alkohol dan minuman beralkohol sebab memiliki kemampuan dalam memfermentasi glukosa menjadi ethanol. Proses fermentasi ethanol pada khamir tersebut berlangsung pada kondisi aerob. Setiap mikroorganisme seperti layaknya makhluk hidup pasti membutuhkan makanan sebagai sumber energi. Sumber energi utama bagi hampir semua makhluk hidup adalah karbohidrat, mulai dari yang rantai panjang seperti pati sampai yang paling sederhana (mono dan disakarida). Monosakarida paling utama adalah glukosa, gula dengan rumus kimia C6H12O11. Hampir semua makhluk hidup mengolah karbohidrat menjadi glukosa, menyebabkan glukosa menjadi muara utama dari metabolisme karbon. Beberapa organisme seperti Saccharomyces dapat hidup, baik dalam kondisi lingkungan cukup oksigen maupun kurang oksigen. Organisme yang demikian disebut aerob fakultatif. Dalam keadaan cukup oksigen, Saccharomyces akan melakukan respirasi biasa. Akan tetapi, jika dalam keadaan lingkungan kurang oksigen Saccharomyces akan melakukan fermentasi. Fermentasi alkohol, secara sederhana, berlangsung sebagai berikut.
C6H12O6 ---> 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP
Dalam keadaan anaerob, asam piruvat yang dihasilkan oleh proses glikolisis akan diubah menjadi asam asetat dan CO2. Selanjutnya, asam asetat diubah menjadi alkohol. Proses perubahan asam asetat menjadi alkohol tersebut diikuti pula dengan perubahan NADH menjadi NAD+.
Dengan terbentuknya NAD+, peristiwa glikolisis dapat terjadi lagi. Dalam fermentasi alkohol ini, dari satu mol glukosa hanya dapat dihasilkan 2 molekul ATP. Pada beberapa mikroba, peristiwa pembebasan energi terlaksana karena asam piruvat diubah menjadi asam asetat dan karbondioksida selanjutnya asam asetat diubah menjadi alkohol.
Dalam fermentasi alkohol, satu molekul glukosa hanya dapat menghasilkan 2 molekul ATP, jika dibandingkan dengan respirasi aerob satu molekul glukosa mampu menghasilkan 38 molekul ATP. Gula yang berfungsi sebagai substrat awal diubah menjadi asam piruvat melalui proses glikolis. Kemudian terjadi proses dekarboksilasi asam piruvat menjadi asetaldehid dan karbondioksida dengan bantuan enzim piruvat dekarboksilase. Asetaldehid hasil dari dekarboksilasi asam piruvat tersebut kemudian diubah menjadi alkohol (ethanol) dengan adanya alkohol dehidrogenase.
Fermentasi cair juga memanfaatkan substrat bahan-bahan pertanian seperti tepung serealia, biji-bijian, pati, malosa dan sebagainya, hanya pada konsentrasinya yang lebih kecil dibandingakan dengan fermentasi padat. Mikroba yang akan ditumbuhkan dimasukkan dalam bentuk inokulum. Biasanya jumlah 10% sudah dianggap cukup baik untuk pertubuhan. Umumnya fermentasi padat dalam menghasilkan suatu produk membutuhkan waktu lebih lama dibandingkan dengan fermentasi cair. Pada fermentasi cair, pengukuran pertumbuhan sel atau pemantauan fase hidup bakteri dapat menjadi petunjuk akan waktu panen.pada proses fermentasi, sejumlah sel dengan karakteristik yang sama dibiakan pada kondisi tertentu dan terkontrol. Proses fermentasi dapat dilakukan hanya dengan mencampur mikroorganisme dengan satu nutrisi dan membiarkan komponennya bereaksi (Danial, 2006 : 17-21)
Fermentasi adalah proses produksi energi dala sel dalam keadaan anaerobik (tanpa oksigen). Secara umum, fermentasi adalah salah satu bentuk anaerobik, akan tetapi terdapat defenisi yang lebih jelas yang mendefenisikan fermentasi sebagai respirasi dalam lingkungan anaerobik
dengan tanpa akseptor elektron eksternal. Gula adalah bahan yang umum dalam fermentasi. Beberapa contoh hasilfermentasi adalah etanol, asam laktat, dan hidrogen. Akan tetapi beberapa komponen lain dapat juga dihasilkan dari fermentasi seperti asam butirat dan aseton. Ragi dikenal sebagai bahan yang umum digunakan dalam fermentasi untuk menghasilkan etanol dalam bir, anggur dan minuman beralkohol lainnya. Respirasi anaerobik dalam otot mamalia selama kerja yang keras (yang tidak memiliki akseptor elektron eksternal) dapat dikategorikan sebagai bentuk fermentasi (Anonim, 2007)
Beberapa organisme seperti saccharomyices dapat hidup baik dalam kondisi lingkungan cukup oksigen maupun kurang oksigen. Organisme yang demikian disebutaerob fakultatif. Dalam keadaan cukup oksigen, saccharomyces akan melakukan respirasi biasa. Akan tetapi jika dalam keadaan lingkungan kurang oksigen, saccharomyces akan melakukan fermentasi. Dalam keadaan anaerob, asam piruvat yang dihasilkan oleh proses glikolisis akan diubah menjadi asam asetat dan CO2. Selanjutnya asam asetat akan diubah menjadi alkohol. Proses perubahan asam asetat menjadi alkohol tersebut diikuti pula dengan perubahan NADH menjadi NAD+ (Anonim, 2010)
Gula adalah bahan yang umum dalam fermentasi. Beberapa contoh hasil fermentasi adalah etanol, asam laktat, dan hidrogen.Akan tetapi beberapa komponen lain dapat juga dihasilkan dari fermentasi seperti asam butirat dan aseton. Ragi dikenal sebagai bahan yang umum digunakan dalam fermentasi untuk menghasilkan etanol dalam bir, anggur dan minuman beralkohol lainnya. Respirasi anaerobik dalam otot mamalia selama kerja yang keras (yang tidak memiliki akseptor elektron eksternal), dapat dikategorikan sebagai bentuk fermentasi yang mengasilkan asam laktat sebagai produk sampingannya. Akumulasi asam laktat inilah yang berperan dalam menyebabkan rasa kelelahan pada otot.
Dikenal bebrapa jaenis fermentasi diantaranya sebagai berikut: a. Fermentasi Asam Asetat
Bakteri Acetobacter aceti merupakan baktei yang mula pertama diketahui sebagai penghasil asam asetat dan merupakan jasad kontaminan pada pembuatan wine. Saat ini bakeri Acetobacter aceti digunakan pada produksi asam asetat karena kemampuanya mengoksidasi alkohol menjadi asam asetat.
b. Fermentasi Asam Laktat
Fermentasi asam laktat banyak terjadi pada susu. Jasa yang palingberperan dalam fermentasi ini adalah Lacobacillus sp. Laktosa diubah menjadi asam laktat. Kini asam laktat juga digunakan untuk produksi plastik dalam bentuk PLA.
c. Fermentasi Asam Sitrat
Asam sitrat dihasilkan melalui fermentasi menggunakan jamur Aspergillus niger. Meskipun beberapa bakteri mampu melakukan, namun yang paling umum digunakan adalah jamur ini. Pada kondisi aerob jamur ini mengubah gula atau pati menjadi asam sitrat melalui pengubahan pada TCA.
d. Fermentasi Asam Glutamat
Asam glutamat digunakan untuk penyedap makanan sebagai penegas rasa. Mula pertama dikembangkan di Jepang. Organisme yang kini banyak digunakan adalah mutan dari Corynebacterium glutamicu.
Faktor-faktor yang mempengaruhi proses fermentasi untuk menghasilkan etanol adalah: sumber karbon, gas karbondioksida, pH substrat, nutrien, temperatur, dan oksigen.Untuk pertumbuhannya, yeast memerlukan energi yang berasal dari karbon. Gula adalah substrat yang lebih disukai. Oleh karenanya konsentrasi gula sangat mempengaruhi kuantitas alkohol yang dihasilkan. Kandungan gas karbondioksida sebesar 15 gram per liter (kira-kira 7,2atm) akan menyebabkan terhentinya
pertumbuhan yeast, tetapi tidak menghentikan fermentasi alkohol. Pada tekanan lebih besar dari 30 atm, fermentasi alcohol baru terhenti sama sekali.
PH dari media sangat mempengaruhi pertumbuhan mikroorganisme. Setiap mikroorganisme mempunyai pH minimal, maksimal, dan optimal untuk pertumbuhannya. Untuk yeast, pH optimal untuk pertumbuhannya ialah berkisar antara 4,0sampai 4,5. Pada pH 3,0 atau lebih rendah lagi fermentasi alcohol akan berjalan dengan lambat.
Mikroorganisme mempunyai temperature maksimal, optimal, dan minimal untuk pertumbuhannya. Temperatur optimal untuk yeast berkisarantara 25-30ºC dan temperature maksimal antara 35-47ºC. Beberapa jenis yeast dapat hidup pada suhu 0ºC. Temperatur selama fermentasi perlu mendapatkan perhatian, karena di samping temperature mempunyai efek yang langsung terhadap pertumbuhan yeast juga mempengaruhi komposisi produk akhir. Pada temperature yang terlalu tinggi akan menonaktifkan yeast. Pada temperature yang terlalu rendah yeast akan menjadi tidak aktif.
5. Alat dan bahan 5.1.Alat a. Tabung reaksi b. Tabung durham c. Pipa L d. Kaki tiga e. Kasa asbes f. Api Bunsen g. Beaker glass h. Gelas ukur i. Pipet tetes 5.2.Bahan a. Larutan ragi
b. Larutan makanan (sukrosa) c. Larutan NaOH
d. Larutan KI / I2 e. Larutan KF
6. Prosedur
Disiapkan 5 tabng reaksi dengan perlakuan yang diberi perlakuan sebagai berikut:
Tabung pertama diisi dengan 4 mL larutan makanan dan 1 mL suspensi ragi lalu di masukan tabung durham, kemudian disimpan dalam lemari es selama 45 menit, kemudian dimasukan ke dalam incubator 370C selama 2,5 jam.
Tabung ke-2 diisi dengan 8 ml larutan makanan dan 1 ml larutan ragi, masukan tabung durham, dan simpan didalam incubator 370 C selama 2,5 jam, lalu diatambahkan larutan NaOH sebanyak 2ml dan diamati gas yang terjadi sebelum dan sesudah penambahan NaOH.
Tabung ke-3 di isi dengan 8 ml larutan makanan dan larutan ragi, dimasukan tabung durham dan disimpan dalam incubator selama 2,5 jam pada suhu 370C. diuji adanya alcohol dengan cara menghubungkan pipa L kedalam tabung reaksi yang berisi larutan larutan NaOH + larutan KI – I2 diperhatikan bau yang tercium dari larutan berisi Iodoform yang terbentuk.
Tabung ke-4 di isi dengan larutan 8 ml larutan makanan dan 1 ml larutan ragi yang sebeblumnya telah di panaskan, lalu dimasukan tabung durham kemudian disimpan dalam incubator 370 C selama 2,5 jam lalu diamati hasilnya.
Tabung ke-5 di isi dengan larutan 8 ml makanan, 1 ml suspensi ragi dan 1 ml larutan KF, dimasukan tabung durham simpan dalam incubator 370C selama 2,5 jam dan diamati hasilnya.
7. Data pengamatan
No Percobaan Hasil
1 4 ml larutan makanan + suspensi ragi + di dinginkan
terdapat gelembung
2 8 ml larutan makanan + suspensi ragi,di inkubasi 2,5 jam + NaOH
terdapat gelembung gas hilang setelah penambahan NaOH
3 8 ml larutan makanan + suspensi ragi, di inkubasi 2,5 jam + uji Iodoform
tabung yang berisi NaOH + iodoform berwarna coklat pekat, setelah ada aliran gas dari tabung (3) berubah jadi coklat muda berbau seperti antiseptik 4 8 ml larutan makanan +
suspensi ragi yang di panaskan
terdapat gelembung gas
5 8 ml larutan makanan + suspensi ragi + larutan KF
8. Pembahasan
Praktikum kali ini telah dilakukan pengamatan terhadap proses fermantasi alkohol. Fermentasi merupakan aktivitas mikroorganisme untuk memperoleh energi melalui pemecahan substrat atau katabolisme yang diperlukan untuk proses metabolisme dan pertumbuhannya. Adapun pengertian dari peragian alkoholik itu sendiri yaitu suatu proses pengubahan glukosa menjadi alkohol dan gas karbondioksida melalui suatu rangkaian reaksi enzimatik yang terdapat pada ragi, ragi yang digunakan dalam percobaan ini yaitu Saccharomyces cerevisiae.
Percobaan peragian alkoholik ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh suhu dan pengaruh zat penghambat atau inhibitor terhadap proses peragian alkoholik, untuk mengetahui adanya alkohol (etanol) melalui uji iodoform pada proses peragian alkoholik, untuk mengetahui cara kerja enzim akibat adanya denaturasi serta untuk mengetahui pengaruh penambahan natrium hidroksida terhadap gas karbondioksida yang dihasilkan dari proses peragian alkoholik.
Prinsip yang mendasari percobaan ini yaitu berdasarkan reaksi glikolisis , di mana glukosa di ubah menjadi dua molekul piruvat melalui 10 tahapan reaksi enzimatik. Pada tahapan reaksi enzimatik ini terbagi menjadi dua tahap, pada tahap pertama glukosa akan di ubah menjadi gliseraldehid 3-fosfat dan pada tahap kedua griseraldehid 3-fosfat yang terbentuk pada tahap pertama akan di ubah menjadi dua molekul piruvat. Selain itu, prinsip yang mendasari percobaan ini yaitu berdasarkan reaksi dekarboksilasi piruvat, di mana piruvat di ubah menjadi asetaldehid dan karbondioksida dengan bantuan enzim piruvat dekarboksilase dan berdasarkan reaksi dehidrogenasi asetaldehid, di mana asetaldehid akan di ubah menjadi alkohol (etanol) dengan bantuan enzim alkohol dehirogenase.
Proses peragian alkoholik sangat dipengaruhi oleh kerja enzim untuk mengubah glukosa menjadi alkohol. Enzim adalah substansi yang dihasilkan oleh sel-sel hidup dan berperan sebagai katalisator pada reaksi kimia yang berlangsung dalam organisme.
Adapun faktor-faktor yang mempengaruhi kerja enzim yaitu konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, suhu, pH dan inhibitor atau zat penghambat. Fungsi enzim adalah sebagai katalisator, oleh karena itu enzim memerlukan kondisi yang optimum dalam melakukan aktivitasnya. Inhibitor terbagi menjadi dua, yaitu inhibitor reversible dan inhibitor irreversible. Inhibitor reversible yaitu suatu zat penghambat yang dapat dihilangkan dengan meggeseser kesteimbangan, inhibitor reversible di bagi lagi menjadi dua yaitu inhibitor kompetitif dan inhibitor nonkompetitif. Inhibitor kompetitif dimana zat penghambat memiliki stuktur yang sama dengan substrat dan zat penghambat tersebut akan masuk pada sisi aktif enzim, dan merusak bagian sisi aktif enzim, sehingga substrat tidak dapat bereaksi dengan enzim. contoh dari inhibitor kompetitif yaitu anion malonat yang menghambat enzim dehidrogenase suksinat. Inhibitor nonkometitif dimana zat penghambat tidak memiliki struktur yang sama dengan substrat, akan tetapi zat penghambat ini akan menempel pada bagian enzim yang dapat merusak bagian aktif enzim, sehingga mengakibatkan substrat tidak dapat bereaksi dengan enzim. contoh dari inhibitor nonkompetitif yaitu dehidratase treonin di hambat oleh isoleusin, antibiotik penisilin menghambat kerja enzim penyusun dinding sel bakteri. Ilustrasi inhibitor kompetitif dan nonkompetitif dapat di lihat pada dibawah ini:
Inhibitor irreversible disebabkan karena terjadinya proses destruksi atau modifikasi gugus fungsi yang terdapat pada enzim. contoh inhibitor irreversible yaitu senyawa diisoprofilfluorofosfat (DFP) menghambat enzim asetilkolinesterase yang penting dalam transmisi implus syaraf. Iodoasetamida yang dapat bereaksi dengan enzim yang memiliki gugus SH.
Sifat-sifat enzim yaitu kecepatan reaksi yang dikatalis oleh enzim sangat tinggi, enzim bersifat spesifik untuk reaksi tertentu, tidak ada produk samping yang terbentuk pada reaksi enzim, reaksi enzim bersifat reversible, enzim yang digunakan untuk suatu reaksi dapat digunakan sedikit mungkin.
Dalam percobaan ini digunakan larutan makanan yang mengandung gula yang dicampur dengan susupensi ragi. Fungsi dari gula yaitu sebagai substrat dan sebagai sumber energi dan sebagai sumber makanan bagi mikroorganisme yang ada dalam ragi. Selain itu digunakan air yang berfungsi sebagai sumber mineral, pelarut dan menghomogenkan substrat. Suspensi ragi merupakan penghasil mikroba sacharomyces cerevisiae, merupakan mikroba yang terdapat pada roti. mikroba ini memiliki 10 enzim yang berperan dalam proses glikolisis.
Dalam percobaan ini digunakan lima tabung reaksi dan tiap tabung mengalami perlakuan yang berbeda.
Tabung (1)
Pada tabung ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh suhu. Dimasukkan larutan makanan, air dan suspensi ragi ke dalam tabung, kemudian dimasukkan tabung durham dengan posisi terbalik. fungsi dari tabung durham yaitu untuk mempermudah pengamatan adanya gas karbondioksida yang dihasilkan. tidak boleh ada rongga ketika tabung durham dimasukkan ke dalam tabung reaksi. setelah itu tabung reaksi A di tutup dengan plastik wrap, kemudian didinginkan pada penangas es selama 45 menit. setelah itu diamati dan tabung durham tetap berada di bawah, hal ini menandakan tidak ada aktivitas enzim pada suhu rendah atau dengan kata lain enzim nonaktif. Kemudian setelah itu tabung reaksi A di simpan
pada inkubator dengan suhu 37oC selama 2,5 jam. Kemudian diamati dan tabung durham naik, hal ini menandakan adanya aktivitas enzim, sehingga terbentuk gas karbondioksida.
Tabung (1)
Percobaan pada tabung ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh penambahan natrium hidroksida pada hasil peragian alkoholik. Pada tabung ini ditambahkan larutan natrium hidroksida 2N, kemudian tabung durham turun dan gelembung gas menghilang karena gas karbondioksida bereaksi dengan natrium hidroksida yang membentuk endapan natrium karbonat. seperti reaksi dibawah ini:
NaOH + CO2 ----> Na2CO3 + H2O
Tabung (3)
Pada tabung ini bertujuan untuk mengetahui adanya etanol melalui uji iodoform. dihubungkan dengan tabung F melalui pipa L, kemudian tabung (3) dipanaskan dengan spirtus, lalu uap etanol mengalir ke tabung F yang berisi NaOH 1 N dan larutan KI-I2. sehingga terjadi reaksi:
C2H5OH + NaOH + KI-I2 ----> I3CH + NaOCOH
Pada tabung F tercium bau iodoform atau bau antiseptik dan terjadi perubahan warna dari coklat tua menjadi coklat. Penambahan KI-I2 akan menghambat kerja enzimgliseraldehid dihidrogenase. Enzim ini bekerja sebagai katalis pada reaksi gliseraldehida-3-fosfat menjadi 1,3 difosfogliserat. Dalam reaksi ini digunakan koenzim NAD+. Sedangkan gugus fosfat diperoleh dari asam fosfat. Reaksi oksidasi ini mengubah aldehida menjadi asam karboksilat. Gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase telah dapat diperoleh dalam bentuk Kristal dari ragi dan mempunyai berat molekul 145.000. Enzim ini adalah suatu tetramer yang terdiri atas empat subunit yang masing-masing mengikat suatu molekul NAD+, jadi pada tiap molekul enzim terikat empat molekul NAD+.
Tabung (4)
Percobaan pada tabung ini bertujuan untuk mengetahui cara kerja enzim akibat adanya denaturasi. Suspensi ragi dipanaskan terlebih dahulu bertujuan untuk mengetahui pengaruh suhu tinggi terhadap proses peragian alkoholik. dan terlihat tabung durham tidak naik, hal ini menandakan bahwa tidak ada kativitas enzim, karena enzim telah terdenaturasi. Denaturasi sendiri merupakan proses penguraiian enzim oleh adanya pemanansan yang menyebabkan perubahan pada struktur enzim itu sendiri, sehingga enzim tersebut berkurang aktivitasnya, bahakan bias jadi samasekali menjadi inaktif
Tabung (5)
Bertujuan untuk mengamati pengaruh zat penghambat. ditambahkan larutan KF, ion flouride dapat menghambat kerja enzim enolase yang berperan dalam proses glikolisis. Enzim enolase berperan dalam pembentukan asam fosfofenol piruvat dari asaam 2-fosfogliserar dengan katalis enzim enolase dan ion Mg2+ sebagai kofaktor. Reaksi pembentukkan asam fosfofenol piruvat ini ialah pembentukan asam fosfofenol piruvat dari asaam 2-fosfogliserar dengan katalis enzim enolase dan ion Mg2+ sebagai kofaktor. Reaksi pembentukkan asam fosfofenol piruvat ini ialah reaksi dehidrasi. Adanya ion F- dapat menghambat kerja enzim enolase, sebab ion F- dengan ion Mg2+dan fosfat dapat membentuk kompleks magnesium fluoro fosfat. Dengan terbentuknya kompleks ini akan mengurangi jumlah ion Mg2+ dalam campuran reaksi dan akibat berkurangnya ion Mg2+maka efektivitas reaksi berkurang.(Anna Poedjiadi, 1994).
9. Kesimpulan
Suhu sangat berpengaruh dalam proses fermentasi, diperlukan suhu yang stabil agar proses fermentasi dapat belangsung dengan baik, suhu terlalu tinggi menyebabkan enzim menjadi inaktif, sedangkan jika suhu terlalu tinggi dapat mengakibatkan denaturasi ezim atau mikroorganisme ragi dalam fermentasi.
Selain suhu, zat penghambat atau inhibitor juga dapat mengganggu proses fotosintesis, dalam percobaan ini inhibitor yang berperan yaitu larutan KI-I2 yang menghambat kerja enzim gliseraldehid fosfat
dehydrogenase, serta senyawa flourisa yang dapat menghambat aktivitas enolase.
10. Daftar pustaka
Armstrong, Frank.B. 1995. Buku ajar biokimia ( Biochemistry ) edisi ketiga. diterjemahkan oleh dr. RF. Maulany Msc. Jakarta : Penerbit buku kedokteran EGC.
Kimball, John. 1983. Biologi Edisi Kelima Jilid 1 diterjemahkan oleh Hj. Siti Soetarni Tjitrosomo, Nawangsari Sugiri. Jakarta : Penerbit erlangga.
Martin Muliawan. 1979. Biokimia ( Review Physiological Chemistry ). Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC
Lehninger. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : Erlangga
