Simulasi penambatan molekuler coumestrol pada reseptor estrogen alfa.

SIMULASI PENAMBATAN MOLEKULER COUMESTROL PADA

RESEPTOR ESTROGEN ALFA

Oleh:

Chandra Dewa Nata

NIM: 108114190

INTISARI

Kanker payudara merupakan kanker yang paling banyak diderita wanita.

Salah satu yang berperan memicu sel kanker yaitu reseptor estrogen

α

(RE

α

)

yang diekpresikan berlebihan. Untuk mencegah kanker tersebut diperlukan

senyawa yang dapat berperan sebagai antagonis

REα

. Coumestrol merupakan

senyawa fitoestrogen yang terdapat dalam kacang-kacangan, bayam, kedelai, dan

cengkeh. Secara

in vitro

dan

in vivo

diketahui bahwa coumestrol dapat berikatan

dengan

REα

maupun RE

β namun secara

in silico

belum diketahui. Penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui dan menguji apakah protokol yang dikembangkan

oleh Radifar dkk. (2013) dapat mengenali coumestrol sebagai ligan bagi

REα

dan

bagaimanakah posenya dalam kantung ikatan

REα

.

Penelitian ini merupakan komputasi eksperimental dengan menggunakan

protokol tervalidasi hasil pengembangan Anita dkk. (2012) dan divalidasi kembali

oleh Radifar dkk. (2013) yang menggunakan perangkat lunak sidik jari interaksi

Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprint

(PyPLIF) yang telah

terbukti dapat meningkatkan kualitas metode penapisan virtual berbasis struktur

(PVBS) dalam proses validasi retrospektif untuk identifikasi ligan bagi

REα

.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa protokol yang dikembangkan oleh

Radifar dkk. (2013) tidak dapat mengenali coumestrol sebagai ligan bagi

REα

selain itu protokol tersebut tidak dapat digunakan untuk elusidasi mode ikatan

coumestrol karena tidak mampu mereproduksi mode ikatan ligan kokristal

sehingga digunakan protokol PVBS tanpa sidik jari interaksi untuk elusidasi mode

dan didapatkan setidaknya 3 pose coumestrol.

ABSTRACT

Breast cancer is the most frequent cancer that happened in women.

estrogen receptor alpha (ER

α

) that expressed excessively, has a role in breast

cancer development. To prevent breast cancer, natural compound that has

antagonistic activity on ER

α

is needed. Coumestrol is phytoestrogen compound

which can be found in bean, spinach, soybean, and clove. Both

in vitro

and

in vivo

experimentals show that coumestrol can interact with ER

α

and ER

β

but

in silico

experiment, the activity is not yet known. The purposes of this experiment are to

test whether the protocol developed by Radifar

et al.

(2013) can identify

coumestrol as ligand for ER

α

and to examine the pose of coumestrol in ER

α

binding pocket.

The method of this experiment was computation experimental which

utilized a validated protocol by Anita

et al.

(2012) and revalidated by Radifar

et

al.

(2013) using interaction fingerprint (IFP) software named Python-based

Protein-Ligand Interaction Fingerprint (PyPLIF) that could improve the quality of

structure based virtual screening (SBVS) in retrospective validation to identify

ligands for ERα.

The results showed that the protocol developed by Radifar

et al.

(2013)

could not identify coumestrol as ligand for ER

α

. Moreover the protocol could not

be used for binding mode elucidation because the protocol could not reproduce

co-crystal ligand binding mode, therefore SVBS protocol without IFP was used

for binding mode elucidation and at least 3 pose of coumestrol are found.

i

SIMULASI PENAMBATAN MOLEKULER COUMESTROL PADA

RESEPTOR ESTROGEN ALFA

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:

Chandra Dewa Nata

NIM: 108114190

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

Persetujuan Pembimbing

SIMULASI PENAMBATAI\I MOLEKULER

COT]MESTROL

PADA

RESEPTOR ESTROGEN

ALFA

Skripsi

yang

diajukan

oleh:

Chandra

Dewa

Nata

NIM:108114190

Telah

disetujui

oleh:

Pembimbing Utama

Enade Pe\dqna

Istyastono, Ph.D..

Apt.

Tanggal21

Februari 2014

Pembimbing

Pendamping

11

Pengesahan

Skripsi

Berjudul

SIMULASI PENAMBATAN

MOLEKULTR

COUMESTROL

PADA RESEPTOR ESTROGEN

ALFA

Oleh:

Chandra Dewa

Nata

NIM:

108114190

Dipertahankan

di

Hadapan Panitia

Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi

iJniversitas

Sanata

Dharma

Pada

tanggal:20

Februari 2014

Mengetahui,

Fakultas Farmasi

Universitas

Sanata

Dharma

Panitia

Penguji Skripsi

1.

Enade Perdana

Istyastono, Ph.D.,

Apt.

Agustina

Setiawati, M.Sc.,

Apt.

.Ieffu

Julianus,

M.Si.

2.

a

lll

ipang Djunarko, M.Sc., Apt.

4.

Nunung

Yuniarti, M.Si.,

Ph.D.,

Apt.

PERNYATAAN

KEASLIAN KARYA

Saya menyatakan dengan

sesungguhnya

bahwa

skripsi yang

berjudul

"Simulasi

Penambatan

Molekuler

Coumestrol pada

Reseptor

Estrogen

Alfa",

tidak

memuat

karya

atau bagian

karya orang

lain,

kecuali yang telah

disebutkan

dalam

kutipan

dan

daftar pustaka,

sebagaimana

layaknya karya

ilmiah.

Apabila

di

kemudian

hari

ditemukan

indikasi

plagiarisme dalam

naskah

ini,

maka

saya bersedia menanggung segala

sanksi

sesuai peraturan

perundang-undangan

yang berlaku.

Yogy

akarta,

2I

Febru ert 201 4

Penulis

ffiffi

Chandra Dewa hlata

a

LEMBAR PERNYATAAN

PERSETUJUAN

PUBLIKASI

ILMIAH UNTUK KEPENTINGAN

AKADEMIS

Yang

bertanda tangan

di

bawah

ini, saya

mahasiswa

Universitas

Sanata

Dharma

:

NIama :

Chandra Dewa

}.{ata

Nomor

Mahasiswa

:

108114190

Demi

pengembangan

ilmu

pengetahuan,

saya memberikan

kepada

Perpustakaan

Universitas

Sanata

Dharma

karya

ilmiah

saya

yang

berjudul:

o'Simulasi Penambatan

Molekuler

Coumestrol

pada Reseptor Estrogen

Alfao

beserta

perangkat yang

diperlukan

(bila ada).

Dengan

demikian

saya

memberikan

kepada

perpustakaan

Universitas

Sanata

Dharma

hak

untuk

menyimpan,

mengalihkan dalam

bentuk media

lain,

mengelolanya

dalam bentuk

pangkalan

data

mendistribusikan

secara

terbatas, dan

mempublikasikannya

di

Internet

atau

media

lain

untuk

kepentingan akademis

tanpa

perlu

meminta

ijin

dari

saya

maupun memberikan

royalty

kepada

saya selama

tetap mencantumkan nama

saya

sebagai

penulis.

Demikian

pernyataan

ini

yang

saya

buat

dengan sebenafitya.

Dibuat

di

Yogyakarta

Pada

tanggal

:21

Februari

2AI4

Yang menyatakan

vi

HALAMAN PERSEMBAHAN

“A good head and a good heart are always a formidable

combination.” –

Nelson Mandela

“

All things are difficult before they are easy.” –

Thomas

Fuller

“Try not to become a man of success, but rather try

to become a man of value.

” –

Albert Einstein

”I've failed over and over and over again in my life

and that is why I succeed.”

-

Michael Jordan

Karya kecilku ini kupersembahkan untuk:

Tuhan yang Maha Esa yang telah membimbing, melindungi dan

menyertai dalam kehidupanku

Papa dan Mama yang selalu memberikanku dukungan, semangat,

cinta dan kasih sayang

Bapak/Ibu dosen dan staff pengajar Fakultas Farmasi USD

Sahabat-sahabatku tersayang

Serta

vii

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas rahmat

karunia dan penyertaan yang telah diberikan sehingga penyusunan skripsi yang

berjudul “

SIMULASI PENAMBATAN MOLEKULER COUMESTROL

PADA RESEPTOR ESTROGEN ALFA

” dapat dilaksanakan dengan baik.

Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi

(S.Farm.) di Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini, penulis mendapatkan

banyak bantuan dan dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, penulis

mengucapkan terima kasih kepada:

1.

Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma.

2.

C.M. Ratna Rini Nastiti, M.Pharm., Apt., selaku Ketua Program Studi

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

3.

Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., selaku dosen pembimbing yang

telah memberikan bimbingan, masukan serta pengarahan dalam penelitian

dan penyusunan skripsi ini.

4.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku dosen pembimbing yang telah

memberikan bimbingan serta pengarahan dalam penelitian dan

penyusunan skripsi ini.

viii

6.

Mas Ottok selaku laboran Laboratorium Virtual Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma yang senantiasa menemani dan memberikan

fasilitas selama proses pelaksanaan penelitian di laboratorium.

7.

Papa, mama, dan kedua kakakku yang telah memberikan doa, semangat,

dan dukungan kepada penulis selama proses penyusunan skripsi.

8.

Astuti Malyawati Soesanto dan Ricardo Kenny Chandra, teman

seperjuangan yang bersama-sama berusaha, bertukar informasi dan saling

memberi dukungan dalam pengerjaan skripsi.

9.

Gisela Winda Permatasari, atas pengertian, semangat, doa, dan

dukungannya selama proses penelitian dan penyusunan skripsi ini.

10.

Sahabatku Hugo, Bram, Reza, Suryo, Christian, Tora atas canda tawa

dalam perkuliahan ini

11.

Teman-teman FST B 2010 atas kebersamaan, canda tawa, dan pengalaman

berharga untuk penulis selama menjalani kuliah di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma.

12.

Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu per satu yang telah

membantu dalam proses penyusunan skripsi ini.

Akhir kata, penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam

penyusunan skripsi ini mengingat keterbatasan kemampuan dan pengetahuan

penulis. Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun

dari semua pihak. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi pembaca.

ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL...

i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING... ii

HALAMAN PENGESAHAN... iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA... iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH

UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS...

v

HALAMAN PERSEMBAHAN... vi

PRAKATA... vii

DAFTAR ISI... ix

DAFTAR TABEL... xi

DAFTAR GAMBAR... xii

DAFTAR LAMPIRAN... xiii

DAFTAR SINGKATAN KATA... xiv

INTISARI... xv

ABSTRACT... xvi

BAB I. PENGANTAR ... 1

A.

Latar Belakang... 1

1.

Permasalahan ... 2

2.

Keaslian Penelitian... 2

3.

Manfaat Penelitian ... 3

a.

Manfaat teoretis ...

3

b.

Manfaat praktis ... 3

B.

Tujuan Penelitian ... 3

1.

Tujuan umum ...

3

2.

Tujuan khusus ...

3

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA... 4

x

B.

Kanker Payudara... 5

C.

Reseptor Estrogen... 6

D.

Coumestrol ... 9

E.

Penapisan Virtual Berbasis Struktur... 10

F.

Landasan Teori... 13

G.

Hipotesis ... 15

BAB III. METODE PENELITIAN... 16

A.

Jenis dan Rancangan Penelitian... 16

B.

Variabel dan Definisi Operasional... 16

1.

Variabel Penelitian... 16

a.

Variabel utama... 16

b.

Variabel pengacau... 16

2.

Definisi Operasional... 16

C.

Bahan dan Alat Penelitian... 17

D.

Tata Cara Penelitian... 18

E.

Tata Cara Analisis Hasil ... 20

BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN... 21

BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN... 32

A.

Kesimpulan ... 32

B.

Saran ... 32

DAFTAR PUSTAKA... 33

LAMPIRAN... 36

xi

DAFTAR TABEL

xii

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur hormon estrogen: (A) Estron, (B) Estradiol, (C) Estriol

6

Gambar 2. Struktur coumestrol... 10

Gambar 3. Diagram pengambilan keputusan... 19

Gambar 4. Histogram sebaran nilai Tc-PLIF coumestrol-

REα

... 24

Gambar 5. Histogram sebaran RMSD penambatan coumestrol-

REα

... 25

Gambar 6. Plot kelompok RMSD coumestrol... 26

Gambar 7. Interaksi 4-hidroksi-tamoksifen pada

REα

... 27

Gambar 8. (A) 3 pose ikatan coumestrol pada

REα

. Pose representatif

kelompok 1, 2, 3 coumestrol pada

REα

(B, C, D)...

29

Gambar 9. Jarak ikatan coumestrol pada

REα

kelompok

1 (A) dan 2 (B)... 31

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.

Tabel nilai RMSD ChemPLP

non filter

4-hidroksi-tamoksifen.

37

Lampiran 2.

Tabel nilai RMSD ChemPLP f

ilter

4-hidroksi-tamoksifen... 45

Lampiran 3.

Tabel nilai RMSD Tc-PLIF

non filter

4-hidroksi-tamoksifen...

53

Lampiran 4.

Tabel nilai RMSD Tc-PLIF

filter

4-hidroksi-tamoksifen... 60

Lampiran 5.

Script

untuk melakukan penambatan ulang

4-hidroksi-tamoksifen pada

REα

...

68

Lampiran 6.

Script

untuk melakukan penambatan coumestrol pada

REα

... 69

Lampiran 7.

Script

perhitungan nilai RMSD 4-hidroksi-tamoksifen pada

protokol Tc-PLIF

nonfilter

...

70

Lampiran 8.

Script

perhitungan nilai RMSD 4-hidroksi-tamoksifen pada

protokol Tc-PLIF

filter

...

71

Lampiran 9.

Script

perhitungan nilai RMSD 4-hidroksi-tamoksifen pada

protokol ChemPLP

nonfilter

...

72

Lampiran 10.

Script

perhitungan nilai RMSD 4-hidroksi-tamoksifen pada

protokol ChemPLP

filter

...

73

Lampiran 11.

Script

perhitungan nilai RMSD coumestrol pada protokol

ChemPLP

filter..

...

74

xiv

DAFTAR SINGKATAN KATA

AF

Activation function

ChemPLP

Chemical piecewise linear potential

DBD

DNA binding domain

EF1%

Enrichment factor 1%

ER

Estrogen receptor

ERE

Estrogen receptor element

HB-EGF

Heparin binding epitelial growth factor

IFP

Interaction finger print

LBD

Ligand binding domain

PLANTS

Protein ligand ant system

PVBS

Penapisan virtual berbasis struktur

PyPLIF

Python based protein ligand interaction fingerprint

RMSD

Root mean square deviation

SIRS

Sistem informasi rumah sakit

Tc

Tanimoto coefficient

xv

INTISARI

Kanker payudara merupakan kanker yang paling banyak diderita wanita.

Salah satu yang berperan memicu sel kanker yaitu reseptor estrogen

α (REα)

yang diekpresikan berlebihan. Untuk mencegah kanker tersebut diperlukan

senyawa yang dapat berperan sebagai antagonis

REα

. Coumestrol merupakan

senyawa fitoestrogen yang terdapat dalam kacang-kacangan, bayam, kedelai, dan

cengkeh. Secara

in vitro

dan

in vivo

diketahui bahwa coumestrol dapat berikatan

dengan

REα

maupun RE

β namun secara

in silico

belum diketahui. Penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui dan menguji apakah protokol yang dikembangkan

oleh Radifar dkk. (2013) dapat mengenali coumestrol sebagai ligan bagi REα dan

bagaimanakah posenya dalam kantung ikatan

REα

.

Penelitian ini merupakan komputasi eksperimental dengan menggunakan

protokol tervalidasi hasil pengembangan Anita dkk. (2012) dan divalidasi kembali

oleh Radifar dkk. (2013) yang menggunakan perangkat lunak sidik jari interaksi

Python-based Protein-Ligand Interaction Fingerprint

(PyPLIF) yang telah

terbukti dapat meningkatkan kualitas metode penapisan virtual berbasis struktur

(PVBS) dalam proses validasi retrospektif untuk identifikasi ligan bagi REα.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa protokol yang dikembangkan oleh

Radifar dkk. (2013) tidak dapat mengenali coumestrol sebagai ligan bagi

REα

selain itu protokol tersebut tidak dapat digunakan untuk elusidasi mode ikatan

coumestrol karena tidak mampu mereproduksi mode ikatan ligan kokristal

sehingga digunakan protokol PVBS tanpa sidik jari interaksi untuk elusidasi mode

dan didapatkan setidaknya 3 pose coumestrol.

xvi

ABSTRACT

Breast cancer is the most frequent cancer that happened in women.

estrogen receptor alpha (ERα) that expressed excessively, has a role in breast

cancer development. To prevent breast cancer, natural compound that has

antagonistic activity on ER

α

is needed. Coumestrol is phytoestrogen compound

which can be found in bean, spinach, soybean, and clove. Both

in vitro

and

in vivo

experimentals show that coumestrol can interact with ERα and ERβ but

in silico

experiment, the activity is not yet known. The purposes of this experiment are to

test whether the protocol developed by Radifar

et al.

(2013) can identify

coumestrol as ligand for ERα and to examine the pose of coumestrol in ERα

binding pocket.

The method of this experiment was computation experimental which

utilized a validated protocol by Anita

et al.

(2012) and revalidated by Radifar

et

al.

(2013) using interaction fingerprint (IFP) software named Python-based

Protein-Ligand Interaction Fingerprint (PyPLIF) that could improve the quality of

structure based virtual screening (SBVS) in retrospective validation to identify

ligands for ERα.

The results showed that the protocol developed by Radifar

et al.

(2013)

could not identify coumestrol as ligand for ER

α

. Moreover the protocol could not

be used for binding mode elucidation because the protocol could not reproduce

co-crystal ligand binding mode, therefore SVBS protocol without IFP was used

for binding mode elucidation and at least 3 pose of coumestrol are found.

1

BAB I

PENGANTAR

A.

Latar Belakang

Kanker payudara merupakan sekelompok sel abnormal yang disebabkan

oleh proses pembelahan sel yang berlebihan dan tidak terkoordinasi yang terjadi

pada payudara (Kumar, 2007). Saat ini kanker payudara merupakan kanker

terbanyak kedua yang menyebabkan kematian setelah kanker paru-paru dan

merupakan kanker terbanyak pada wanita. Sebanyak 203.000 kasus ditemukan

pada setiap negara (rasio populasi 1:4) di Asia Tenggara dengan jumlah kematian

93.000 (Globocan, 2008). Di Indonesia, berdasarkan data Sistem Informasi

Rumah Sakit (SIRS) tahun 2007, kanker payudara menempati urutan pertama

pada pasien rawat inap di seluruh RS di Indonesia yaitu sekitar 16,85%. Salah

satu yang berperan memicu sel kanker yaitu reseptor estrogen

α (REα) dimana

pada kanker payudara sekitar 70% ditemukan

REα

yang diekspresikan berlebihan

(Deroo dan Korach, 2006).

Berdasarkan penelitian Hopert, Beyer, Frank, Strunck, Wiinsche, dan

Volimer (1998), coumestrol secara

in vitro

dapat berikatan dengan

REα

. Selain itu

Jacob, Temple, Patisaul, Young, dan Rissman (2000) menunjukan bahwa

coumestrol secara

in vivo

dapat berikatan dengan

REα

. Meskipun secara

in vitro

dan

in vivo

telah diketahui bahwa coumestrol dapat berfungsi sebagai ligan

REα

,

namun perlu diketahui apakah secara

in silico

coumestrol dapat menjadi ligan

REα

, sehingga dapat digunakan untuk pengembangan obat.

Penelitian ini menggunakan protokol tervalidasi hasil pengembangan

Anita, Radifar, Kardono, Hanafi, dan Istyastono (2012) dan divalidasi kembali

oleh Radifar, Yuniarti, dan Istyastono (2013).

Untuk mengetahui dan menguji

kemampuan protokol yang dikembangkan oleh Radifar dkk. (2013) diharapkan

dapat mengenali coumestrol sebagai ligan pada

REα

serta mengetahui pose

coumestrol pada kantung ikatan

REα

.

1.

Permasalahan

Berdasarkan latar belakang tersebut, permasalahan pada penelitian ini

adalah:

1.

Apakah coumestrol merupakan ligan bagi

REα

secara

in silico

menurut

protokol penapisan yang dikembangkan Radifar dkk. (2013)?

2.

Bagaimanakah pose coumestrol di dalam kantung ikatan

REα

?

2.

Keaslian Penelitian

Penelitian mengenai simulasi penambatan molekuler coumestrol pada

REα

belum pernah dilakukan. Adapun beberapa jurnal terkait antara lain

Antagonists

oleh Anita dkk. pada tahun 2012;

In silico Screening and Binding

Mode Analysis of Celexocib as a Ligand for Estrogen Receptor Alpha

oleh

Riswanto, Setiawati, Yuliani, dan Istyastono pada tahun 2013.

3.

Manfaat Penelitian

a.

Manfaat teoretis

Hasil penelitian diharapkan dapat menambah pengetahuan tentang

pengikatan coumestrol pada

REα

, sehingga dapat menjadi acuan dalam

pengembangan antagonis

REα

dan mengetahui apakah protokol penapisan

in silico

yang dikembangkan Radifar dkk. (2013) mampu mengenali

coumestrol sebagai ligan pada

REα

.

b.

Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan menghasilkan protokol yang mampu mengenali

ligan bagi

REα

.

B.

Tujuan Penelitian

1.

Tujuan umum

Untuk mengidentifikasi senyawa yang dapat menjadi ligan bagi

REα

secara

in silico

.

2.

Tujuan khusus

Untuk mengetahui dan menguji apakah protokol penapisan

in silico

yang

4

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A.

Kanker

Kanker merupakan kumpulan sel-sel yang tumbuh melampaui batas

normal, yang kemudian dapat menyerang suatu bagian tubuh dan dapat menyebar

ke organ lain (metastasis). Kanker merupakan istilah umum untuk menunjukkan

adanya neoplasma. Neoplasma didefinisikan sebagai massa abnormal jaringan

yang pertumbuhannya berlebihan dan tidak terkoordinasikan dengan pertumbuhan

jaringan normal walaupun rangsangan yang memicu pertumbuhan tersebut telah

berhenti (Kumar, 2007).

Karsinogenesis merupakan proses pembentukan sel kanker yang melalui

banyak tahap, baik pada tingkat fenotip maupun genotip. Dalam kondisi normal,

langkah-langkah proliferasi sel dapat dibagi sebagai berikut: (1) faktor

pertumbuhan terikat pada reseptor pertumbuhan pada permukaan sel; (2) reseptor

faktor pertumbuhan memberi sinyal untuk mengaktifkan protein tranduser; (3)

sinyal ditransmisikan melewati sitosol melalui second messenger menuju inti sel;

(4) faktor transkripsi inti yang memulai pengaktifan transkripsi DNA. Berbeda

dengan sel normal, jumlah proliferasi sel kanker akan meningkat dan sel yang

berapoptosis menurun (Kumar, 2007).

perubahan sel normal dan meningkatkan proliferasi. Pada tahap ini

terjadi kerusakan DNA yang dapat diperbaiki dengan mekanisme enzimatik. Bila

pembelahan sel telah terjadi sebelum DNA diperbaiki maka dapat menyebabkan

perubahan sel yang permanen dan

irreversible

. Pada tahap ini sel normal disebut

juga sel inisiasi (Bertram, 2001).

Promosi adalah tahap setelah inisiasi. Bila senyawa yang dapat

menyebabkan kanker terus terpapar maka akan meningkatkan proliferasi sel,

perubahan ekspresi gen dan peubahan pada kontrol pertumbuhan seluler sehingga

sel inisiasi terus berkembang dan menjadi sel tumor (Trosko, 2001).

Tahap selanjutnya adalah progresi. Pada tahap ini sel dapat berproliferasi

tanpa adanya stimulus. Sel tumor akan semakin berkembang menjadi sel kanker

yang disebabkan oleh perubahan DNA, ekspresi onkogen, dan mutasi tambahan.

Karakteristik sel kanker yaitu

irreversible

, perkembangan yang sangat cepat,

perubahan pada morfologi, biokimia, dan metabolisme sel (Dixon dan Kopras,

2004).

B.

Kanker Payudara

Data WHO (Globocan, 2008) menunjukkan bahwa kanker payudara

adalah kanker yang paling banyak menyebabkan kematian setelah kanker

paru-paru dan merupakan kanker yang paling banyak diderita wanita dengan 203.000

kasus ditemukan pada setiap negara (rasio populasi 1:4) di Asia Tenggara dengan

jumlah kematian 93.000. Di Indonesia kanker payudara menempati urutan

pertama pada pasien rawat inap di seluruh RS di Indonesia (16,85%), disusul

kanker leher rahim (11,78%) (Yayasan Kanker Indonesia, 2012).

C. Reseptor Estrogen

Reseptor estrogen (RE) adalah salah satu anggota reseptor inti yang

diaktivasi oleh hormon estrogen. tiga tipe utama hormon estrogen yang terdapat

pada wanita adalah estron (E1)

yang hanya dapat berikatan pada REα, e

stradiol

(E2) yang dapat berikatan dengan RE

α maupun REβ, dan e

striol (E3) yang hanya

dapat berikatan dengan

REβ

. Estradiol merupakan hormon yang paling dominan

diproduksi selama masa reproduksi. Peran estradiol digantikan oleh estriol pada

saat wanita sedang mengandung. Setelah masuk masa

menopause

hormon

estrogen yang paling berperan adalah estron (Kikandi, 2008). Struktur hormon

estrogen ditunjukkan pada Gambar 1.

Molekul RE memiliki tiga tempat ikatan spesifik, yaitu terhadap ligan

yang disebut

ligand binding domain

(LBD) atau disebut juga

activation function

2

(AF-2) atau terhadap

growth factor

yang biasa disebut AF-1 dan terhadap DNA

yang disebut

DNA binding domain

(DBD). DBD yang nantinya akan berikatan

dengan

estrogen receptor element

(ERE) (Gustaffson, 1999).

Terdapat 2 mekanisme aktivasi RE yaitu aktivasi RE pada kompartemen

inti (

translation transactivation

) dan aktivasi RE yang terdapat pada membran

(

signaling

). Mekanisme aktivasi RE pada kompartemen inti yaitu ligan agonis

berikatan dengan RE akan mengakibatkan terjadinya perubahan konformasi

reseptor yang memungkinkannya berikatan dengan koaktivator. Kemudian

kompleks ligan-reseptor akan berikatan dengan ERE. Setelah berikatan dengan

ERE, kompleks tersebut akan berikatan dengan suatu protein koaktivator dan

mengaktifkan faktor transkripsi. Aktivasi transkripsi gen tadi akan menghasilkan

mRNA yang mengarah pada sintesis protein tertentu dan kemudian

mempengaruhi berbagai fungsi sel bergantung sel target (Gustaffson, 1999).

Mekanisme aktivasi RE pada membran yaitu ligan agonis berikatan pada

RE di membran, kemudian melalui

heparin binding epitelial growth factor

(HB-EGF) mengaktivasi reseptor EGF yang kemudian memberi sinyal melalui jalur

Ras/Raf/MAP kinase memberi sinyal kepada target gen seperti P53 yang akan

menginaktivasi P53 sehingga

tumor supressor gen

tidak bekerja, C-Myc yang

Terdapat 2 jenis RE yaitu

REα

dan RE

β yang disandi oleh gen yang

berbeda.

REα

dapat ditemukan di endometrium, sel kanker payudara, dan

hipotalamus (Yaghmaie, Saeed, Garan, Freitag, Timiras, dan Sternberg, 2005),

sedangkan RE

β dapat ditemukan pada ginjal, otak,

tulang, jantung, prostat,

paru-paru, mukosa intestinal, dan sel endothelial (Babiker, De Windt, van Eickels,

Grohe, Meyer, dan Doevendans, 2002).

REα

dan RE

β dihasilkan oleh gen yang berbeda.

Gen

REα

terletak pada

kromosom 6 lokus q25.I, sedangkan gen RE

β terletak pada pita q22

-24 kromosom

14.

REα

dan RE

β mempunyai kemiripan karakteristik, 95% domain ikatan DNA

dan 55% domain ikatan ligan kedua jenis RE tersebut sama (Shaun, Susan, Sietse,

dan Malcolm, 1997).

REα

dan RE

β dapat membentuk heterodimer u

ntuk merangsang

transkripsi gen-gen yang mengatur proliferasi dan siklus sel. Pada organ yang

mempunyai ekspresi

REα

lebih banyak dari RE

β maka akan banyak terbentuk

homodimer

REα

dan heterodimer

REα/β di

bandingkan dengan homodimer RE

β.

Bentuk heterodimer

REα/β dapat berikatan pada DNA dengan afinitas yang sama

dengan homodimer

REα

dan lebih besar daripada homodimer RE

β.

RE

β dapat

menghambat aktivasi transkripsional yang diperantarai oleh

REα

jika terdapat

dalam bentuk heterodimer (Paruthiyil, Parmar, Kerekatte, Cunha, Firestone,

Leitman, 2004).

pada

REα

dapat menstimulasi proliferasi dari sel payudara sehingga menyebabkan

peningkatan pembelahan sel dan replikasi DNA. Laju replikasi yang sangat cepat

akan menyebabkan sel menjadi rentan terhadap kesalahan penyandian genetik

sehingga memicu mutasi. Hal tersebut mengganggu daur sel, apoptosis, dan

perbaikan DNA yang berujung pada terbentuknya tumor (Deroo dan Korach,

2006).

Radifar dkk. (2013) melakukan penelitian secara

in

silico dengan metode

sidik jari interaksi dengan 4-hidroksi-tamoksifen sebagai ligan bagi

REα

. Dalam

penelitian tersebut Asp351 diketahui berperan menjadi jangkar dalam ikatan suatu

ligan dengan

REα

.

D. Coumestrol

Coumestrol (3,9-dihidroksi-6H-benzofuro[3,2-c] [1]benzopyran-6-one)

merupakan senyawa polifenolik alami golongan pterokarpan yang terdapat dalam

kacang-kacangan, bayam, kedelai, dan cengkeh. Coumestrol paling banyak

terdapat dalam kedelai dan cengkeh dan dapat berfungsi sebagai antioksidan,

antibakteri, antiviral, dan antifungi

(Lee, Lee, Park, Sangurdekar, Chang 2012).

Coumestrol merupakan senyawa fitoestrogen

yang memiliki aktivitas

biologis seperti estrogen sehingga memiliki reseptor yang sama dengan estrogen

yaitu RE. Coumestrol dapat berikatan dengan

REα

maupun RE

β d

engan

kemampuan ikatan dengan RE

β lebih tinggi dibandingkan REα

(Kuiper, Enmark,

Pelto-Huikko, Nilsson, dan Gustaffson, 1996). Berdasarkan penelitian Hopert

dkk. (1998) secara

in vitro

coumestrol dapat menjadi ligan bagi

REα

dengan

Selain itu, secara

in vivo

coumestrol dapat menjadi senyawa anti estrogen pada

otak dan kelenjar pituitari yang bekerja dengan berikatan

REα

(Jacob dkk., 2000).

Struktur coumestrol dapat dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Struktur coumestrol

E. Penapisan Virtual Berbasis Struktur

Penapisan virtual berbasis struktur (PVBS) adalah teknik komputasi

dalam penemuan obat untuk mengidentifikasi bagaimana suatu senyawa dapat

berikatan pada targetnya seperti enzim atau reseptor dimana struktur dari molekul

target sudah diketahui sehingga dilakukan dengan cara menambatkan ligan

dengan protein target kemudian dilanjutkan dengan

scoring

untuk memperkirakan

afinitas ligan terhadap protein target (Kroemer, 2007).

PVBS bersifat

stochastic

, oleh karena itu diperlukan validasi

.

Ada 2

Protokol suatu PVBS dapat diterima a

pabila memiliki nilai RMSD ≤

2 Å

(Marcou dan Rognan, 2007).

Validasi retrospektif dilakukan dengan menggunakan senyawa yang aktif

terhadap reseptor

target (REα)

dan pengecoh untuk ditambatkan menggunakan

protokol yang sama kemudian dilihat nilai

Enrichment Factor

1% (EF1%). Nilai

EF1% didapat dengan membandingkan

% True Positive

pada 1%

False Positive

.

Nilai EF1% tersebut kemudian dibandingkan dengan EF1% pada pertama kali

dilakukan retrospektif PVBS terhadap

REα

. Apabila nilai EF1% lebih besar dari

EF1% awal maka protokol tersebut dikatakan baik (Huang, Soichet, Irwin, 2006).

Salah satu perangkat lunak penambatan yang dapat digunakan dalam

penapisan virtual berbasis struktur adalah PLANTS 1.2 (Korb, Stutzle, dan Exner,

2007; Korb dkk., 2009). PLANTS 1.2 memberikan luaran ChemPLP (

chemical

piecewise linear potential

) yang merupakan suatu

scoring

function

yang menilai

interaksi yang ada berdasarkan gaya tarik-menarik dan tolak-menolak antara

protein (reseptor) dan ligan. Prinsip dari penilaian ChemPLP adalah memberi nilai

suatu penambatan protein-ligan berdasarkan posisi ligan di dalam reseptor target.

Nilai ChemPLP suatu ligan yang memiliki posisi penambatan yang sama persis

dengan ligan lain akan selalu sama, karena penilaian ini berdasarkan perhitungan

matematis (Korb dkk., 2007).

Kualitas PVBS dapat ditingkatkan dengan menggunakan

Interaction

Fingerprint

(IFP) (Marcou dan Rognan, 2007). Dasar dari IFP yaitu dengan

mengubah bentuk 3 dimensi dari interaksi protein-ligan ke dalam 1 dimensi

interaksi protein-ligan pada

docking tools

terhadap ligan pembanding.

Perbandingan ini menghasilkan nilai yang dapat digunakan untuk meningkatkan

PVBS (Radifar dkk., 2013). Namun kebanyakan

tools

IFP berbayar sehingga

kemampuan untuk megembangkan IFP terbatas. Oleh karena itu Radifar dkk.

(2013) mengembangkan metode penapisan virtual yaitu PyPLIF (

Python-based

Protein-Ligan Interaction Fingerprint

).

PyPLIF merupakan pengembangan IFP dengan mengubah interaksi

molekuler protein-ligan menjadi

bitstrings

sesuai dengan residu dan tipe

interaksinya. Untuk setiap residu terdapat 7 bit yang mewakili 7 tipe interaksi

yaitu (1) apolar, (2) interaksi aromatik (

face to face

), (3) interaksi aromatik (

face

to edge

), (4) ikatan hidrogen (protein sebagai donor), (5) ikatan hidrogen (protein

sebagai akseptor), (6) interaksi elektrostatik (protein bermuatan positif), dan (7)

interaksi elektrostatik (protein bermuatan negatif). Kemudian

bitstrings

tersebut

dibandingkan terhadap standar untuk dilihat kemiripanya dengan menggunakan

Tanimoto coefficient Protein-Ligan Interaction Fingerprint

(Tc-PLIF) (Radifar

dkk., 2013).

Tanimoto coefficient

(Tc) merupakan hasil dari pembagian antara jumlah

F. Landasan Teori

Kanker adalah pertumbuhan sel abnormal dimana pertumbuhan sel

tersebut tidak terkontrol dan tidak dapat berhenti meskipun rangsangan

pertumbuhan sel tersebut telah dihentikan. Kanker payudara yaitu kanker yang

terletak pada payudara yaitu sekitar 50

–

75% terjadi di bagian duktus. Kanker

payudara merupakan kanker terbanyak yang diderita wanita dengan 93.000

kematian pada negara di Asia Tenggara selain itu berdasarkan data Sistem

Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2007, kanker payudara menempati urutan

pertama pada pasien rawat inap di seluruh RS di Indonesia yaitu sebesar 16,85%.

RE yaitu reseptor yang memerlukan hormon estrogen dalam proses

pengaktifannya. Aktivasi RE oleh ligan dapat melalui 2 jalur yaitu aktivasi pada

RE dalam kompartemen inti (

transactivation transcription

) dan aktivasi RE pada

membran (

signaling

). Sinyal ini dapat mengaktifkan gen C-Myc yang merupakan

gen untuk proliferasi sel, menginaktivasi gen P53 yang merupakan gen penekan

tumor dan mengaktifkan c-jun yang merupakan anti apoptosis. Terdapat 2 jenis

RE yaitu

REα

dan RE

β. Berdasarkan penelitian sekitar 70% REα

diekspresikan

berlebihan pada penderita kanker payudara dimana ekspresi berlebihan tersebut

dapat mengganggu daur sel, apoptosis, dan perbaikan DNA sehingga dapat

memicu terbentuknya tumor. Berdasarkan penelitian Radifar dkk. (2013) yang

berperan sebagai jangkar ligan bagi

REα

adalah Asp 351.

coumestrol diketahui dapat berikatan dengan

REα

maupun RE

β d

engan

kemampuan ikatan dengan RE

β lebih tinggi dibandingkan REα

.

PVBS adalah teknik komputasi dalam penemuan obat untuk

mengidentifikasi bagaimana suatu senyawa dapat berikatan pada targetnya yaitu

dapat berupa enzim atau reseptor. PVBS bersifat

stochastic

, oleh karena itu

diperlukan validasi yaitu validasi internal dan validasi retrospektif. Pada

penelitian ini hanya digunakan validasi internal. Validasi internal dilakukan

dengan menambatkan kembali ligan standar pada reseptor untuk menguji apakah

protokol PVBS dapat menghasilkan kembali pose ligan ko-kristal. Parameter yang

digunakan adalah RMSD ≤

2 Å.

Penelitian PVBS memerlukan perangkat lunak untuk menambatkan suatu

ligan pada protein. Salah satu perangkat lunak yang dapat digunakan dan tidak

berbayar adalah PLANTS 1.2 yang memberikan luaran ChemPLP, suatu

scoring

function

yang menilai interaksi yang ada berdasarkan gaya tarik-menarik dan

tolak-menolak antara protein (reseptor) dan ligan. Semakin negatif nilai ChemPLP

maka afinitas suatu ligan dalam protein semakin tinggi.

IFP merupakan metode yang dapat digunakan untuk meningkatkan

kualitas PVBS, namun kebanyakan

tools

IFP berbayar sehingga Radifar dkk.

(2013) membuat

tools

IFP yang tidak berbayar yaitu PyPLIF yang merupakan

pengembangan IFP. PyPLIF mengubah interaksi molekuler protein-ligan menjadi

bitstrings

sesuai dengan residu dan tipe interaksinya. Untuk setiap residu terdapat

7 bit yang mewakili 7 tipe interaksi, setelah itu

bitstrings

tersebut dibandingkan

Tc-PLIF memiliki rentang antara 0,000 hingga 1,000 dimana nilai 0,000

memiliki arti tidak ada kemiripan dan nilai 1,000 menunjukkan interaksi sidik jari

ligan standar dan ligan yang ditambatkan identik. Suatu ligan dapat dikatakan

dikenali pada

REα

apabila memiliki nilai Tc-

PLIF ≥ 0,600.

G. Hipotesis

1.

Coumestrol merupakan ligan bagi

REα

secara

in silico

menurut protokol

16

BAB III

METODE PENELITIAN

A.

Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian yang berjudul “Simulasi Penambatan Molekuler Coumestrol

Pada Reseptor Estrogen Alf

a” termasuk penelitian komputasi

eksperimental yang

terdapat intervensi terhadap variabel yang dilakukan dengan bantuan komputer.

B.

Variabel dan Definisi Operasional

1.

Variabel Penelitian

a.

Variabel utama

1)

Variabel bebas

: Protokol penambatan

coumestrol pada REα

2)

Variabel tergantung : Nilai Tc-PLIF, ChemPLP serta pose coumestrol

di dalam kantung ikatan

REα

b.

Variabel pengacau

1)

Variabel pengacau terkendali

a)

Spesifikasi alat komputasi dan versi perangkat lunak

2)

Variabel pengacau tak terkendali

a)

Sifat algoritma penambatan molekuler yang

stochastic

2.

Definisi Operasional

2.

Pose coumestrol adalah pose coumestrol di dalam kantung ikatan

REα

yang dipilih secara obyektif kuantitatif berdasarkan nilai Tc-PLIF dan

atau ChemPLP.

3.

Filter

adalah penyaringan pose ligan yang memiliki interaksi dengan

residu asam amino Asp351.

C.

Bahan dan Alat Penelitian

1.

Bahan yang digunakan dalam penelitian

a.

Protokol yang telah dikembangkan oleh Anita dkk. (2012) dan telah

divalidasi kembali oleh Radifar dkk. (2013)

b.

Struktur ko-kristal dari

REα

(didapatkan dari PDB kode: 3ERT).

c.

Struktur tiga dimensi coumestrol (didapatkan dari zinc.docking.org,

dengan kode: ZINC00001219)

d.

Docking Software

PLANTS 1.2 (Korb dkk., 2007; Korb dkk., 2009)

untuk simulasi penambatan molekuler, PyPLIF (Radifar dkk., 2013)

untuk menilai kembali pose penambatan,

Open Babel

sebagai pustaka

fingerprinting

open access

, PyMol 1.2rl (Lill dan Danielson, 2011) untuk

memvisualisasikan pose coumestrol, dan R 3.0.1. (R Development Core

Team, 2013) untuk komputasi statistik.

2.

Alat atau instrumen penelitian

dilakukan pada komputer dengan spesifikasi: CPU intel i5-3230 @2.60GHz,

RAM 4GB, dengan sistem operasi ubuntu 12.04 versi kernel 3.8.0-32.

D.

Tata Cara Penelitian

1.

Pengunduhan ko-kristal

REα

Pengunduhan dilakukan dari website PDB (

www.rcsb.org

) dengan

kode PDB: 3ERT.

2.

Pengunduhan struktur coumestrol

Struktur virtual coumestrol didapat dengan mengunduh dari zinc

database dengan kode ZINC00001219 (

http://zinc.docking.org/

).

3.

Penambatan ulang 4-hidroksi-tamoksifen (validasi internal)

4-hidroksi-tamoksifen ditambatkan pada

REα

sebanyak 1.000 kali

dengan 3 kali replikasi. Setelah itu, dilakukan identifikasi sidik jari interaksi

dari hasil penambatan menggunakan aplikasi PyPLIF (Radifar dkk., 2013)

dilanjutkan penyaringan pada ikatan hidrogen dengan Asp351 (Radifar dkk.,

2013) dan pengurutan nilai yang didapatkan. Luaran yang didapat terbagi

menjadi empat bagian: (i) Nilai Tc-PLIF

filter

ikatan hidrogen dengan

Asp351, (ii) Nilai Tc-PLIF

nonfilter

ikatan hidrogen dengan Asp351, (iii)

Nilai ChemPLP

filter

ikatan hidrogen dengan Asp351, dan (iv) Nilai

ChemPLP

nonfilter

ikatan hidrogen dengan Asp351.

4.

Analisis hasil validasi internal

dimulai dari poin i sampai poin iv (tata cara 3). Simulasi penambatan

coumestrol berdasar pada protokol yang dinyatakan valid sesuai Gambar 3.

Gambar 3. Diagram pengambilan keputusan

5.

Simulasi penambatan coumestrol

pose yang memiliki ikatan dengan Asp351 (Radifar dkk., 2013) dan dipilih

pose dengan nilai Tc-PLIF terbesar setiap replikasi. Jika dalam penambatan

terdapat lebih dari satu pose dengan nilai Tc-PLIF terbesar, maka pose dengan

nilai ChemPLP terbesar yang dipilih

6.

Elusidasi pose ikatan coumestrol pada

REα

Pose penambatan dengan nilai terbaik sesuai luaran protokol yang

dinyatakan valid (Gambar 3) dihitung nilai RMSD. RMSD yang didapat

kemudian dikelompokkan menggunakan metode pengelompokkan

k-means

pada aplikasi R komputasi statistik. Nilai median RMSD pada masing-masing

kelompok dipilih sebagai kelompok representatif. Kemudian kelompok

tersebut digambar posenya menggunakan Pymol untuk menggambarkan

bagaimana interaksi coumestrol dengan

REα

.

E.

Tata Cara Analisis Hasil

Data Tc-PLIF dianalisis dengan aplikasi R komputasi statisik

menggunakan

shapiro-wilk

untuk melihat distribusi data tiap kelompok. Jika

didapatkan distribusi data yang normal maka dilanjutkan dengan

var-test

untuk

mengetahui variansi antar kelompok. Apabila distribusi normal selanjutnya

digunakan

t-test

bila tidak terdistribusi normal digunakan

Wilcoxon-test.

Ligan

21

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pendekatan kimia medisinal komputasi memiliki peran dalam

meningkatkan efisiensi penemuan obat. Protokol yang digunakan telah banyak

dikembangkan salah satunya adalah protokol yang dikembangkan oleh Anita dkk.

(2012) dan divalidasi kembali oleh Radifar dkk. (2013). Untuk melakukan

pendekatan secara

in silico

dibutuhkan protokol yang tervalidasi. Penelitian ini

menambatkan coumestrol yang secara

in vitro

(Hopert dkk., 1998)

maupun

in vivo

(Jacob dkk., 2000) aktif sebagai ligan bagi

REα

dengan tujuan mengetahui dan

menguji kemampuan protokol yang dikembangkan oleh Radifar dkk. (2013) dapat

mengenali coumestrol sebagai ligan pada

REα

serta mengetahui pose coumestrol

pada kantung ikatan

REα

.

Coumestrol ditambatkan pada

REα

dengan menggunakan aplikasi

PLANTS 1.2 (Korb dkk., 2007; Korb dkk., 2009) luaran yang didapatkan adalah

nilai ChemPLP dimana nilai terendah merupakan nilai yang paling baik.

Kemudian luaran tersebut digunakan untuk mengidentifikasi sidik jari interaksi

REα

-coumestrol menggunakan aplikasi PyPLIF (Radifar dkk., 2013). Untuk

[image:40.595.101.516.226.622.2]

Protokol yang digunakan dalam penelitian ini harus valid, oleh karena itu

sebelum dilakukan penambatan coumestrol pada

REα

perlu dilakukan validasi

internal dengan menambatkan kembali 4-hidroksi-tamoksifen pada

REα

untuk

mengetahui apakah protokol yamg digunakan dapat menghasilkan kembali pose

dari ligan ko-kristal dengan menggunakan parameter nilai RMSD. Protokol dapat

diterima apabila 95% dari data mempu

nyai nilai RMSD ≤

2 Å sesuai dengan

diagram pengambilan keputusan (Gambar 3).

Tabel I. Data RMSD

penambatan ulang 4-hidroksi-tamoksifen

% RMSD

≤

2 Å ChemPLP

% RMSD

≤

2 Å Tc-PLIF

Non Filter

Filter

Non Filter

Filter

Rep.I Rep.II Rep.III Rep.I Rep.II Rep.III Rep.I Rep.II Rep.III Rep.I Rep.II Rep.III

99,9% 99,8% 99,8% 100% 100% 99,9% 89,6% 89,9% 90,5% 91,2% 92,5% 90,6%

Berdasarkan tabel I dapat diketahui bahwa protokol yang menggunakan

parameter Tc-PLIF tidak dapat menghasilkan kembali pose ko-kristal sedangkan

protokol yang menggunakan parameter ChemPLP baik

filter

maupun

non filter

dapat menghasilkan kembali pose ko-kristal yang ditandai dengan lebih dari 95%

data memiliki nilai RMSD ≤

2 Å oleh karena itu protokol dengan parameter

ChemPLP

filter

dapat digunakan untuk menentukan pose penambatan coumestrol

pada

REα

.

Salah satu tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui dan

menguji kemampuan protokol yang dikembangkan oleh Radifar dkk. (2013) dapat

mengenali coumestrol sebagai ligan pada

REα

. Dari data validasi internal

diputuskan protokol dengan parameter ChemPLP

filter

yang digunakan, namun

protokol dengan parameter Tc-PLIF

filter

untuk menguji apakah protokol dapat

mengenali coumestrol sebagai ligan pada

REα

.

Protokol dengan parameter Tc-PLIF

filter

digunakan karena protokol

tersebut telah divalidasi oleh Radifar dkk. (2013) bahwa protokol tersebut mampu

mengenali ligan

REα

. Namun protokol tersebut belum dilakukan validasi apakah

dapat menghasilkan kembali pose dari ligan ko-kristal. Oleh karena itu pada

penelitian ini digunakan protokol dengan parameter Tc-PLIF

filter

untuk

mengetahui dan menguji kemampuan protokol yang dikembangkan oleh Radifar

dkk. (2013) dapat mengenali coumestrol sebagai ligan pada

REα

serta protokol

dengan parameter ChemPLP

filter

untuk mengetahui pose coumestrol pada

kantung ikatan

REα

.

4.1. Protokol Tc-PLIF filter

Protokol ini berdasar pada nilai Tc-PLIF terbaik dari coumestrol yang

memiliki ikatan hidrogen dengan ASP351

REα

pada setiap penambatannya.

Penambatan dilakukan sebanyak 1.000 kali (3 kali replikasi). Coumestrol dapat

dikenali sebagai ligan pada

REα

apabila memiliki nilai Tc-

PLIF ≥ 0,600 (Marcou

dan Rognan, 2007). Untuk menguji apakah nilai Tc-

PLIF yang didapatkan ≥

0,600 digunakan aplikasi statistik R 3.0.1. (R Development Core Team, 2013).

Dari penelitian yang dilakukan didapatkan nilai Tc-PLIF dengan nilai

mean

dan

median

berturut-turut 0,356 (SEM=

0,003) dan 0,417 (Lampiran 12)

kemudian dilakukan uji Wilcoxon dengan Hi yaitu Tc-PLIF lebih kecil dari 0,600

didapatkan nilai

p-value

< 2,2e-16 (Lampiran 12) artinya Tc-PLIF < 0,600

Namun berdasarkan penelitian Hopert, dkk. (1998) dan Jacob dkk. (2000) secara

in vitro

maupun

in vivo

coumestrol aktif sebagai ligan pada

REα

. Oleh karena itu

protokol Radifar dkk. (2013) perlu dikembangkan agar dapat mengenali

coumestrol sebagai ligan bagi

REα

. Kelemahan dari metode interaksi sidik jari

yaitu metode tersebut sangat bergantung pada senyawa standar karena prinsip dari

sidik jari interaksi yaitu mengukur kemiripan sidik jari interaksi ligan dengan

sidik jari interaksi senyawa standar. Dalam protokol Radifar dkk. (2013) senyawa

standar yang digunakan adalah 4-hidroksi-tamoksifen yang diketahui mempunyai

afinitas yang sangat tinggi terhadap

REα

oleh karena itu usulan pengembangannya

adalah dengan mengganti senyawa standar (4-hidroksi-tamoksifen) dengan

senyawa ligan

REα

yang afinitasnya lebih rendah dari 4-hidroksi-tamoksifen.

Usulan pengembangan lainnya yaitu dengan mengganti

filter

asam amino Asp351

degan asam amino lain yang berperan dalam pengikatan ligan bagi RE

α seperti

[image:42.595.104.510.310.706.2]

Glu353, Arg394, Thr347.

4.2. Protokol ChemPLP filter

Protokol ini berdasar pada nilai ChemPLP terbaik dari coumestrol yang

memiliki ikatan hidrogen dengan ASP351

REα

pada setiap penambatannya.

Protokol ini digunakan untuk mengetahui pose coumestrol pada kantung ikatan

REα

. Penambatan dilakukan sebanyak 1.000 kali dengan 3 kali replikasi,

[image:43.595.100.501.277.570.2]

kemudian dipilih pose dengan nilai ChemPLP terbaik untuk menjadi pembanding

dalam menghitung nilai RMSD dari setiap penambatan coumestrol pada

REα

.

Data yang didapatkan ditampilkan pada Gambar 5.

Gambar 5. Histogram sebaran RMSD penambatan coumestrol-

REα

Berdasarkan Gambar 5 dapat dilihat bahwa terdapat sebaran nilai RMSD

coumestrol pada

REα

sehingga coumestrol memiliki berbagai pose. Oleh karena

itu selanjutnya perlu dilakukan pengelompokan dengan metode pengelompokkan

k-means

pada aplikasi statistik R 3.0.1. (R Development Core Team, 2013) untuk

Sebaran nilai RMSD coumestrol kemudian ditampilkan dalam bentuk

plot yang telah dilakukan pengelompokkan dengan menggunakan metode

pengelompokkan

k-means

pada R 3.0.1. (R Development Core Team, 2013) yang

[image:44.595.98.498.194.537.2]

ditampilkan pada Gambar 6.

Gambar 6. Plot kelompok RMSD coumestrol

Dari plot tersebut dapat dikatakan bahwa coumestrol setidaknya memiliki

3 pose penambatan, kemudian median dari tiap pose digunakan sebagai pose

representatif penambatan coumestrol pada

REα

untuk divisualisasikan dengan

menggunakan aplikasi PyMOL 1.2rl (Lill dan Danielson, 2011).

Met388, Ile389, Gly390, Leu391, Val392, Arg394, Ser395, Leu402, Leu403,

Phe404, Ala405, Leu408, Leu410, Gly415, Val418, Glu419, Gly420, Met421,

Val422, Glu423, Ile424, Phe425, Leu428, Ile514, His516, Met517, Ser518,

Asn519, Lys520, Gly521, Met522, Glu523, His524, Leu525, Tyr526, Ser527,

Met528, Lys529, Cys530, Leu536, dan Leu539 (Anita dkk., 2012) dan ditemukan

ikatan hidrogen yang diduga berperan penting dalam menentukan interaksi

ligan-REα

yaitu ikatan antara 4-hidroksi-tamoksifen dengan molekul air dan residu

[image:45.595.104.509.293.720.2]

asam amino Glu353 dan Arg394 selain itu ikatan hidrogen antara

4-hidroksi-tamoksifen dengan residu asam amino Thr347 dan Asp351 (Anita dkk., 2012).

Radifar dkk. (2013) menyatakan bahwa ikatan ligan dengan residu asam amino

Asp351 yang berperan penting dalam ikatan 4-hidroksi-tamoksifen dengan

REα

.

Interaksi 4-hidroksi-tamoksifen dengan

REα

dapat dilihat pada Gambar 7.

Menurut Marcou dan Rognan (2007), interaksi hidrogen dapat terjadi

antara 2 atom yang berjarak hingga 3,5 Å, interaksi aromatik (

face to face

),

interaksi aromatik (

edge

to face

), interaksi

π

-kation dapat terjadi antara 2 atom

yang berjarak hingga 4 Å, dan ikatan hidrofobik dapat terjadi pada jarak hingga

4,5 Å. Kantung ikatan suatu ligan pada reseptor yaitu asam amino yang berjarak

sekitar 5 Å dari ligan (de Graaf dkk., 2011) sehingga untuk mendeteksi

kemungkinan residu asam amino yang dapat berikatan dengan coumestrol

dilakukan penyaringan dengan menunjukkan residu asam amino yang berjarak

hingga 5 Å dari coumestrol. Kemudian ditentukan asam amino yang berinteraksi

dengan coumestrol berdasarkan jarak maksimum sesuai jenis interaksinya.

Berdasarkan inspeksi visual dan jarak interaksi hidrogen dibawah 3,5 Å,

pada ketiga pose pengikatan coumestrol dalam

REα

(Gambar 8) pada semua

kelompok

didapatkan kemungkinan interaksi hidrogen antara bagian 3-hidroksi

dari coumestrol dengan residu asam amino Asp351 selain itu pada kelompok

1

dan 2 terdapat ikatan hidrogen dari bagian karbonil coumestrol dengan residu

asam amino Thr347. Selain itu terdapat ikatan hidrogen pada bagian 9-hidroksi

coumestrol dengan residu asam amino Met522 serta ikatan hidrogen antara air

dengan residu asam amino Glu353 dan Arg394 pada semua kelompok.

[image:46.595.96.514.223.535.2]

Gambar 8. (A) 3 pose ikatan coumestrol pada

REα

. Pose representatif kelompok 1,

2, 3 coumestrol pada

REα

(B, C, D)

Tabel II. Tabel nilai Tc-PLIF tiap kelompok

Kelompok Replikasi

Nama Ligan

Tc-PLIF

1

1078

ZINC00001219_entry_00001_conf_38

0,458

2

786

ZINC00001219_entry_00001_conf_42

0,400

3

878

ZINC00001219_entry_00001_conf_32

0,138

[image:47.595.105.509.110.626.2]

kelompok 1 dan 2 lebih mirip dengan sidik jari ligan standar

(4-hidroksi-tamoksifen) dibandingkan dengan kelompok 3. Hal ini dapat dibuktikan pada

Gambar 8 dimana coumestrol dapat berikatan dengan Asp351 dan Thr347 yang

juga merupakan asam amino yang berikatan dengan 4-hidroksi-tamoksifen,

sedangkan pada kelompok 3 coumestrol hanya berikatan dengan Asp351 dan

Met522. Meskipun dapat menilai kemiripan sidik jari interaksi coumestrol dan

4-hidroksi-tamoksifen, protokol sidik jari interaksi yang dikembangkan oleh Radifar

dkk. (2013) tidak dapat mengenali coumestrol yang merupakan ligan bagi

REα

.

Oleh karena itu perlu dilakukan pengembangan protokol agar mampu mengenali

coumestrol sebagai ligan bagi

REα

serta dapat menghasilkan kembali pose ligan

ko-kristal.

[image:49.595.106.512.245.649.2]

Usulan pengembangan yaitu dengan menambahkan gugus karboksilat

pada bagian nomor 9 dari coumestrol. Dengan penambahan gugus karboksilat

tersebut diharapkan akan terjadi interaksi elektrostatik antara senyawa

pengembangan dan residu asam amino Arg394 dan ikatan hidrogen antara gugus

karboksilat senyawa pengembangan dengan air. Struktur senyawa pengembangan

coumestrol ditunjukkan pada Gambar 10.

Gambar 9. Jarak ikatan coumestrol pada

REα

kelompok 1 (A) dan 2 (B)

32

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A.

Kesimpulan

1.

Coumestrol bukan merupakan ligan bagi RE

α

menurut

Protokol penapisan

in silico

yang dikembangkan oleh Radifar dkk. (2013) karena protokol

tersebut tidak mampu mengenali coumestrol sebagai ligan pada RE

α

.

2.

Didapatkan setidaknya 3 pose ikatan coumestrol pada

REα

dengan

menggunakan protokol PVBS tanpa interaksi sidik jari untuk elusidasi

mode.

B. Saran

1.

Perlu dilakukan pengembangan terhadap protokol penapisan

in silico

yang

dikembangkan oleh Radifar dkk. (2013) agar dapat mengenali

senyawa-senyawa yang sudah terbukti sebagai ligan pada

REα

DAFTAR PUSTAKA

Anita, Y., Radifar, M., Kardono, L.B.S., Hanafi, M., dan Istyastono, E.P., 2012,

Structure-based design of Eugenol Analogs as Potential Estrogen Receptor

Antagonists,

Bioinformation

, 8 (19), 901-906.

Babiker, F.A, De Windt, L.J., van Eickels, M., Grohe, C., Meyer, R., dan

Doevendans, P.A., 2002, Estrogenic Hormone Action in the Heart:

Regulatory Network and Function,

Cardiovascular Research

, 53 (3), 709

–

19.

Bertram, J.S., 2001, The molecular biology of cancer,

Molecular Aspects of

Medicine

, 21, 167

–

223.

Deroo, B.J., dan Korach, K.S., 2006, Estrogen Receptors and Human

Disease,

Journal of Clinical Investigation

, 116 (3), 561-567.

de Graaf, C., Kooistra, A.J., Vischer, H.F., Katritch, V., Kuijer, M., Shiroishi, M.,

Iwata, S., Shimamura, T., Stevens, R.C., de Esch, I.J., Leurs, R., 2011,

Crystal structure-based virtual screening for fragment-like ligands of the

human histamine H(1) receptor,

Journal of Medicinal Chemistry,

54 (23),

8195-8206.

Dixon, K. dan Kopras, E, 2004, Genetic alterations and DNA repair in human

carcinogenesis,

Seminar in Cancer Biology

, 14, 441

–

448.

Globocan, 2008,

Cancer Fact Sheet,

http://globocan.iarc.fr/factsheets/

cancers/all.asp

, diakses tanggal 13 September 2013.

Gustaffson, J.A., 1999, Estrogen Receptor, a new dimension in estrogen

mechanism of action,

Journal of Endocrinology

, 163, 379-383.

Hopert A.C., Beyer A., Frank K., Strunck E., Wiinsche W., dan Volimer G., 1998,

Characterization of Estrogenicity of Phytoestrogens in an

Endometrial-derived Experimental Model,

Environmental Health Perspectives

, 106 (9),

581-586.

Huang, N., Soichet, B.K., dan Irwin, J.J., 2006, Benchmarking Sets for Molecular

Docking,

Journal of Medicinal Chemistry

, 49 (23), 6789-6801.

Jacob, D.A., Temple, J.L., Patisaul, H.B., Young, L.J., dan Rissman, E.F., 2000,

Coumestrol Antagonizes Neuroendocrine Actions of Estrogen via the

Estrogen

Receptor α,

Society for Experimental Biology and Medicine

, 226

(4), 301-306.

Kikandi, N.S., 2008, Understanding the Mode of Action Estrogenic Compound

and Development of Novel Electroplating Method,

Dissertation

, 3,

Korb, O., Stutzle T., dan Exner, T.E., 2007, An ant colony optimization approach

to flexible protein-ligand docking,

Swarm Intelligence

, 1, 115-134.

Korb, O., Stutzle T., dan Exner, T.E., 2009, Empirical scoring function for

advanced protein-ligand docking with PLANTS.

Journal of Chemical

Information and Modeling,

49 (1)

,

84-96.

Kroemer, R.T., 2007, Structure-based drug design: docking and scoring Curr

Protein Pept,

Current Protein and Peptide Science

, 8 (4): 312

–

328.

Kuiper, G.J.M., Enmark, E., Pelto-Huikko, M., Nilsson S., dan Gustaffson, J.,

1996, Cloning of a novel estrogen receptor expressed in rat prostate and ovary,

Proceedings of the National Academy of Sciences

, 93 (12), 5925-5930.

Kumar, V., 2007,

Buku Ajar Patologi,

Ed. 7, EGC, Jakarta, PP.186-187.

Lee, H., Lee, J., Park, K., Sangurdekar, D., Chang, W., 2012,

Effect of Soybean

Coumestrol on Bradyrhizobium japonicum

Nodulation Ability, Biofilm

Formation, and Transcriptional Profile,

Applied and Environmental

Microbiology

, 78 (8), 2896

–

2903.

Levin, E.R., 2001, Cell localization, physiology, and nongenomic actions of

estrogen receptors,

Journal of Applied Physiology,

91 (4), 1860-1867.

Lill, M.A., dan Danielson, M.L., 2011, Computer-aided drug design platform

using PyMOL,

Journal of Computer-Aided Molecular Design,

25, 13-9.

Linda, B., dan Maria, S., Mechanisms of Estrogen Receptor Signaling :

Convergence of Genomic and Nongenomic Actions on Target Genes,

Molecular Endocrinology

19 (4), 833

–

842.

Marcou, G., dan Rognan, D., 2007, Optimizing fragment and scaffold docking by

use of molecular interaction fingerprints,

Journal of Chemical Information

and Modeling

, 47 (1), 195

–

207.

Paruthiyil, S., Parmar, H., Kerekatte, V., Cunha, G.R., Firestone, G.L., Leitman,

D.C., 2004,

Estrogen Receptor β Inhibits Human Breast Cancer Cell

Proliferation and Tumor Formation by Causing a G2 Cell Cycle Arrest,

Cancer Research,

64, 423

–

428.

Price, 2006,

Patofisiologi Konsep Klinis Proses-Proses Penyakit,

Ed. 6, EGC,

Jakarta, PP. 150 -151

R Development Core Team, 2013,

R:A Language and Environment for Statistical

Computing

, R foundation for Statistical Computing, Vienna.

Riswanto, F.D.A, Setiawati, A., Yuliani, S.H., dan Istyastono, E.P., 2013,

In silico

Screening and Binding Mode Analysis of Celexocib as a Ligand for Estrogen

Receptor Alpha,

Indonesian Journal of Drug Design and Discovery

, 1 (1).

Shaun, M.C., Susan, H., Sietse, M., Malcolm, G.P., 1997, Estrogen Receptors

α

and

β

Form Heterodimers on DNA,

The Journal of Biochemical Chemistry

,

272 (32), 19858-19862.

Trosko, J.E., 2001,

Commentary: is the concept of “tumorpromotion” a useful

paradigm?,

Molecular Carcinogenesis

, 30, 131

–

137.

Yaghmaie, F., Saeed, O., Garan, S.A., Freitag, W., Timiras, P.S., dan Sternberg,

H., 2005, Caloric restriction reduces cell loss and maintains estrogen

receptor-alpha immunoreactivity in the pre-optic hypothalamus of female

B6D2F1 mice

,

Neuro Endocrinology Letters,

26 (3), 197

–

203.

Yayasan Kanker Indonesia, 2012

, YKI Jakarta race

,

http://yayasankanker

1 1,594 1,594 1,836 2 1,593 1,593 1,817 3 1,626 1,626 1,591 4 1,599 1,599 1,596 5 1,829 1,829 1,806 6 1,812 1,812 1,811 7 1,594 1,594 1,596 8 1,717 1,717 1,809 9 1,804 1,804 1,809 10 1,823 1,823 1,808 11 1,808 1,808 1,595 12 1,809 1,809 1,803 13 1,823 1,823 1,599 14 1,604 1,604 1,614 15 1,42 1,42 1,811 16 1,596 1,596 1,818

17 1,6 1,6 1,595

18 1,834 1,834 1,822 19 1,613 1,613 1,607 20 1,819 1,819 1,59 21 1,608 1,608 1,593 22 1,593 1,593 1,806 23 1,312 1,312 1,811 24 1,594 1,594 1,11 25 1,803 1,803 1,618 26 1,613 1,613 1,592 27 1,822 1,822 1,817 28 1,623 1,623 1,61 29 1,816 1,816 1,592 30 1,806 1,806 1,604 31 1,819 1,819 1,601 32 1,804 1,804 1,403 33 1,118 1,118 1,806 34 1,823 1,823 1,599 35 1,599 1,599 1,598 36 1,607 1,607 1,597 37 1,818 1,818 1,59 38 1,822 1,822 1,6 39 1,806 1,806 1,602 40 1,114 1,114 1,808

41 1,601 1,601 1,591 42 1,349 1,349 1,805 43 1,814 1,814 1,599

44 1,6 1,6 1,596

45 1,596 1,596 1,439 46 1,81 1,81 1,81 47 1,597 1,597 1,807 48 1,598 1,598 1,814 49 1,809 1,809 1,147 50 1,599 1,599 1,59 51 1,82 1,82 1,595 52 1,594 1,594 1,122 53 1,816 1,816 1,594 54 1,819 1,819