LAPORAN LENGKAP KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
BAB I
PENDAHULUAN
Kromatografi digunakan sebagai untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen- komponennya, misalnya senyawa Flavonoida yang terdapat pada tahu, tempe, bubuk isoflavon memiliki banyak manfaat. Beberapa kelabihan senyawa isoflavon yang potensial bagi kesehatan manusia, diantaranya adalah sebagai antioksidan, antitumor / antikanker, antikolestrol, antivirus, antialergi, dan dapat mencegah osteoporosis. Dan semua kromatografi bekerja berdasarkan metode kromatografi.
Kromatografi telah didefinisikan terutama sebagai suatu proses pemisahan yang digunakan untuk pemisahan campuran yang pada hakekatnya molekuler. Kromatografi bergantung pada pembagian- ulang molekul-molekul campuran antara dua fase atau lebih. Tipe-tipe kromatografi mencakup kromatografi adsorbs, kromatografi partisi cairan, dan pertukaran ion. Sistem utama yang digunakan dalam kromatografi partisi adalah: partisi gas, partisi cairan yang menggunakan alas tak bergerak (misalnya kromatografi kolom), kromatografi kertas dan lapis tipis. Dalam tiap kasus terjadi distribusi antara fase ‘cair’ yang terserap secara ‘stasioner’ dan zat-alir bergerak yang kontak secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi partisi cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang diserapkan pada suatu pendukung; dalam kromatografi kertas pendukung itu adalah kertas atau kertas terolah, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis adsorbennya disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran plastic. Hanya akan dibahas aspek-aspek yang dipilih dari kromatografi partisi pada selulosa dengan rujukan khusus ke analisis anorganik.
Maksud percobaan adalah untuk mengetahui metode penentuan kima secara kromatografi lapis tipis.
Tujuan percobaan adalah untuk memisahkan campuran senyawa fase dengan metode kromatografi lapis tipis dan untuk mengetahui nila Rf
Prinsip percobaan adalah adsorbs dan partisi dimana adsorbs adalah penyerapan pada pemulaan, sedangkan partisi adalah penyebaran atau kemampuan suatu saat yang ada dalam larutan untuk berpisah kedalam pelarut yang digunakan.
BAB II
PEMBAHASAN
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan peramabatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak.
Pemisahan KLT dikembangkan oleh Ismailoff dan Schraiber pada tahun (1938). Tekniknya menggunakan penyokong fase diam berupa lapisan tipis sepreti lempeng kaca, aluminium atau plat inert.
Derajat retensi pada kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai factor resensi, Rf:
Pada fase diam, jika dilihat mekanisme pemisahan, fase diam dikelompokkan:
a. Kromatogarfi serapan (Silika gel, alumina, keiselguhr) b. Kromatografi partisi (Selulosa, keiselguhr, silika gel)
c. Kromatografi penukar ion (Penukar ion selulosa, resina penukat ion) d. Kromatografi gel (Sephadex, Biogel)
Pada fase gerak, pada proses serapan, yang terjadi jika menggunakan silika gel, alumina dan fase diam lainnya, pemilihan pelarut mengikuti aturan kromatografi kolom serapan. System tak berair paling banyak digunakan dan contoh pelarut organik dalam seri pelarut mikroskop diberikan dalam Tabel 25, yang meliputi (sifat hidrofob menaik) methanol, asam asetat, etanol, aseton, etil asetat, eter, kloroform (perlu diperhatikan pada kloroform yang distabilkan dengan etanol) benzene, sikloheksana, dan eter petroleum.
KLT mempunyai beberapa kelebihan, yaitu:
1. Waktu pemisahan lebih cepat
2. Sensitive, artinya meskipun jumlah cuplikan sedikit masih dapat dideteksi.
3. Daya resolusinya tinggi, sehingga pemisahan lebih sempurna.
Aspirin, phenacetin dan kofein (APC) sering digunakan dalam kombinasi sebagai sediaan antipiretik analgetik. Penentuan dan identifikasinya sangat penting yang dapat dilakukan secara kromatografi lapis tipis.
Prosedur di sini mengikuti Ganshirt dan Malzachur dan penyiapan lempeng sederahan menurut metode Less dan De Muria. Noda ditampakkan dengan semprotan permanganat dalam suasana asam, yang akan mengoksidasi senyawa sampel hingga menghilangkan warna permanganate.
BAB III
METODE KERJA
A. Alat-alat yang digunakan
1. Batang pengaduk
2. Bejana KLT (chamber) + tutup 3. Botol semprot
4. Erlenmeyer 5. Gelas kimia
6. Gelas objek / plat KLT 7. Isolasi
8. Pipa kapiler
B. Bahan-bahan yang digunakan 1. Asam asetat glacial
2. Asam kromat 3. Asam sulfat 4. Benzene 5. Dietileter
6. Kalium permanganate 7. Kloroform
8. Methanol absolute 9. Sampel
10. Silika gel
11. Zat pembanding C. Cara kerja
1. Penyiapan lempeng
1.1 Disiapkan alat dan bahan yang digunakan
1.2 Dibersihkan 8 glas objek (25mm x 75mm) dengan larutan asam kromat. Kemudian asam sulfat, dibilas dengan air dan dikeringkan
1.3 Dibuat bubur, dari 3gram silika gel G dan 6 ml air diaduk dengan mortis.
1.4 Bubur yang sudah jadi dilapiskan pada plat (glas objek) dengan menggunakan batang pengaduk dengan ketebalan sekitar 0,1mm sampai 0,3mm.
1.5 Dikeringkan, setelah kering dipindahkan glas objek ke oven dan diaktifkan pada suhu 1000C Selma 1 jam.
1.6 Plat atau lempeng yang sudah diaktifkan disimpan dalam desikator.
2. Penyiapan pengembang kromatografi 2.1 Disiapkan alat dan bahan yang digunakan
2.2 Dipipet 1ml methanol absolute, 18,090 ml asetat glacial, 60,301ml, dietileter, dan 120,60ml benzene
2.3 Dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan dihomogenkan 2.4 Dimasukkan ke dalam chamber secukupnya
2.5 Dijenuhkan chamber dengan menutup sambil digoyang kemudian didiamkan.
3. Penotolan sampel
3.1 Disiapkan alat dan bahan
3.2 Sampel dilarutkan dalam kloroform 5-10mg/ml, kemudian ditotolkan pada ujung lempeng (kurang lebih 1,5cm dari ujung) menggunakan pipet halus (pipa kapiler untuk penentuan titik leleh).
Diameter totolan boleh lebih dari 3cm.
3.3 Dianginkan sampai kering.
4. Eluen dengan larutan pengembang 4.1 Disiapkan alat dan bahan
4.2 Lempeng yang sudah ditotol dengan sampel dimasukkan ke dalam chamber, kemudian ditutup dengan segera.
4.3 Setelah permukaan pelarut naik kurang lebih 5cm atau kira-kira 1cm dari ujung atas, diangkat lempeng dari chamber.
4.4 Diberi tanda posisi pelarut lalu dikeringkan di ujung
4.5 Dimasukkan ke dalam oven beberapa menit untuk menghilangkan pelarut organik.
URAIAN BAHAN
1. Asam asetat (FI edisi III, hal 42)
Nama resmi : ACIDUM ACETICUM GLACIALE Nama lain : Asam asetat glacial
Rumus molekul : C-2H2O2 Berat molekul : 60,05
Pemerian : Cairan jernih, tidak berwarna, bau khas, tajam, jika diencerkan dengan air, rasa asam
Kelarutan : Dapat campur dengan air, dengan etanol (95%) P dan dengan gliserol P
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat Kegunaan : Zat tambahan
2. Asam kromat (FI edisi III, hal 650)
Larutkan 84gram kromtrioksida P dalam 700ml air, tambahan 400ml asam sulfat P perlahan-lahan sambil diaduk.
3. Asam sulfat (FI edisi III, hal 58)
Nama resmi : ACIDUM SULFURICUM Nama lain : Asam sulfat
Rumus molekul : H2SO4 Berat molekul : 98,07
Pemerian : cairan kental seperti minyak, korosit, tidak berwarna, jika ditambahkan ke dalam air menimbulkan panas.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat.
Kegunaan : Zat tambahan 4. Benzen (FI edisi III, hal 658)
Benzen P C6H6, cairan tidak berwarna, transparan mudah terbakar pemerian cairan transparan:
tidak berwarna, mudah menyala.
5. Coffeinum (FI edisi III, hal 175) Nama resmi : COFFEINUM Nama lain : kofein Rumus molekul : C8H10N4O2 Berat molekul : 194,19
Pemerian : serbuk hablur berbentuk jarum, meningkat biasanya menggumpal putih, tidak berbau, rasa pahit.
Kelarutan : agak sukar larut dalam air dan etanol 95% P, mudah larut dalam kloroform P.
Penyimpanan : Dalam wadah tertutup baik.
Kegunaan : Stimulan saraf pusat kardiafik.
6. Dietil eter (FI edisi III, hal 650) Nama resmi : DIETIL ETER Nama lain : Dieti, eter Rumus molekul : C2H5O
RJ : 0,714 gram – 0,78 gram
Jarak didih : Tersuling sempurna pada suhu antara 340C dan 360C.
7. Methanol (FI edisi III, hal 706) Nama resmi : METANOLUM Nama lain : methanol Rumus molekul : CH2-OH Berat jenis : 0,796 – 0,798
Pemerian : Cairan jernih tidak berwarna, bau khas
Kelarutan : Dapat bercampur dengan air membentuk cairan jernih tidak berwarna.
Pembahasan
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode pemisahan fitokimia dengan adsorbs pada lapisan tipis adsorben dikenal dengan nama Thin Lager Chormatografi ( TLC). Prinsip kerja KLT adalah partisi dan adsorbs dimana aleum sebagai fase gerak dan lempeng KLT sebagai fase diam.
KLT sebagai salah satu metode instrumental yang sering digunakan, karena mempunayi keuntungan antara lain sebagai berikut :
1. Peralatan yang diperlukan sedikit 2. Waktu analisis yang cepat 3. Hasil pemisahan lebih baik
4. Daya pemisahan tinggi
5. Pengerjaannya sederhana dan mudah 6. Harganya terjangkau
Dalam praktikum yang telah digunakan fase gerak yaitu eluen dan terdiri dari methanol absolute, asam asetat glacial, dietil eter, dan benzene dengan perbandingan 1 : 18 : 60 : 120, dan fase diam digunakan lempeng KLT yang mana telah dilapisi dengan silika gel yang berfungsi sebagai penyerap atau penyangga atau sampel dan eluen. Sebelum lempeng yang dielusi dengan sampel dimasukkan kertas saring. Chamber yang berisi eluen yang akan merambat keluar melalui kertas saring. Alasan mengapa eluen harus dijenuhkan yaitu agar tekanan dalam chamber sama agar noda yang dihasilkan sesuai dengan diinginkan.
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu. Pada kromatografi, komponen-komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak akan melarutkan zat komponen campuran. Komponen yang mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat. ( Imam Haqiqi, Sohibul,2008 )
Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. ( Anggraeni, Megawati,2009 )
Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa tekhnik kromatografi. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen- komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. ( Anggraeni, Megawati,2009 )
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut
atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning.
a. Kromatogram
Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan warna yang mdrupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.
Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis :
Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta, pewarna dari tinta akan bergerak selayaknya kromatogram dibentuk / tinta ikut naik ke atas.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan pada sebuah gelas kimia bertutup berisa pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa batas pelarut berada dibawah garis dimana posisi bercak berada. Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak dari perbedaan bercak warna.
b. Perhitungan nilai Rf
Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut :
Nilai Rf untuk setiap warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini didasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang ditempuh oleh bercak warna masing-masing.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut :
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen / jarak yang ditempuh oleh pelarut c. Mengidentifikasi senyawa-senyawa
Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya.Caranya: Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi.
Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5.
Metode Praktikum Alat dan Bahan : 1. Alat
a. Alumunium foil b. Beaker glass
c. Kertas saring whatman d. Lidi
e. Klip f. Blower 2. Bahan a. Safranin
b. Pewarna Makanan c. Methylene Blue d. Minyak
Cara kerja :
1. Potong kertas whatman sesuai kebutuhan
2. Garis dengan pensil dengan jarak 2 cm dari sisi bawah kertas
3. beri tanda titik tempat sampel akan diletakkan dengan jarak 1,5-2 cm jarak tiap sampel 4. Letakkan sampel pada tiap titik sebanyak 10 ul menggunakan pipet kapiler
5. Masukkan pelarut dengan ketinggian 1-1.5 cm ke dalam bejana 6. Masukkan kertas whatman yang telah ditetesi sampel
7. Lakukan pengembangan selama 5-10 menit atau sampai eluen atau pelarut hampir mencapai batas ketinggian 2 cm dari batas atas, atau dengan ketinggian secukupnya sesuai keperluan, jika pelarut sampai tengah kertas saring telah menunjukkan pemisahan sudah biasa ditentukan.
8. Sampel dibiarkan dengan angin-angin / dengan blower 9. Berilah tanda batas pelarut bagian atas
10. Lakukan pengamatan, tulis hasil dan pembahasan terhadap senyawa dan komponen pada kromatogram
Hasil dan Pembahasan
Kromatografi lapis tipis adalah pemisahan zat berdasarkan kepolarannya, prinsipnya ada dua yakni partisi dan absorbsi. Bila fase diam berupa zat padat yang aktif, maka dikenal istilah kromatografi penyerapan (adsorption chromatography). Bila fase diam berupa zat cair, maka teknik ini disebut kromatografi pembagian (partition chromatography). Metodenya ada dua fase gerak ( pelarutnya ) dan fase diam ( sampelnya ).
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda.
Pelarut atau fase gerak :
Methil asetat : heksan : methanol = 1 : 1 : 1 Methil asetat sifatnya semi polar
Heksan sifatnya non polar Methanol sifatnya polar
Sampel yang digunakan adalah safranin, pewarna makanan, methylen blue, dan minyak. Setelah pelarut mendekati atas kertas, kertas kemudian diambil dan dikeringkan dengan blower. Kemudian dilihat dengan sinar UV yang berfungsi membedakan zat yang berfluorescent dan tidak / sampel mana yang bercahaya. Bila arna semakin ke atas semakin non polar, semakin ke bawah polar bila benda di tengah-tengah semi polar.
